反向离子对高效液相色谱法测定地夸磷索钠含量

2023-06-11张小平朱永星

中国药业 2023年11期

张小平，魏渊，朱永星

（1. 江苏大学药学院，江苏镇江 212013； 2. 江苏恒新药业有限公司，江苏镇江 212009）

干眼症的发病原因包括泪液质和量异常，动力学异常的内膜稳定性下降，眼部神经异常，眼部炎症导致角膜、结膜细胞损伤等，我国发病率为21%～30%［1］，且趋于年轻化、大众化［2-3］。目前，治疗干眼症的常规方法是运用人工泪液或联合抗炎药物滴眼［4］，常用药物有聚乙二醇［5］、普拉洛芬联合玻璃酸钠［6］、石斛夜光丸联合玻璃酸钠［7］、环孢素A［8］等。3%地夸磷索钠滴眼液于2010 年在日本上市，2017 年10 月进入中国市场，临床治疗干眼症疗效良好［9-13］。地夸磷索钠作用于眼结膜上皮及杯状细胞膜上的P2Y2 受体，通过上调细胞内的钙离子浓度，促进水分及黏蛋白的分泌，进而改善干眼症症状，是一种治疗干眼症的新型药物［14-17］。截至2022 年5 月25 日，国内尚无药品生产企业取得地夸磷索钠滴眼液批准文号，也无其含量测定的相关报道。本研究中采用反向离子对高效液相色谱法测定了地夸磷索钠的含量［18］。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

BP211D 型电子天平（德国赛多利斯公司，精度为十万分之一）；UV - 2600i 型紫外可见分光光度计，LC - 2030 Plus 型高效液相色谱仪，LC - 20 AD 型高效液相色谱仪，均购自日本岛津公司；Agilent 1220 infinity LC 型高效液相色谱仪（美国安捷伦科技公司）；DL -204 型电热恒温干燥箱（天津市中环实验电炉有限公司）；KQ-800DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司，功率为1 600 W，频率为40 kHz）。

1.2 试药

地夸磷索钠对照品（广东先强药业有限公司，批号为211002，纯度为99.8%）；地夸磷索钠（批号分别为220301，220302，220303），纯化水，均由江苏恒新药业有限公司自制；乙腈（德国默克集团）；磷酸二氢钾、氢氧化钾（国药集团化学试剂有限公司）；四丁基硫酸氢铵（上海麦克林生化科技股份有限公司）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：Thermo Scientific™C18柱（100 mm×4.6 mm，3µm）；流动相：磷酸盐缓冲液（pH 6.8）-乙腈（85∶15，V/V）；流速：1.0 mL/ min；检测波长：262 nm；柱温：30 ℃；进样量：10µL。

2.2 溶液制备

取地夸磷索钠样品10 mg，精密称定，置100 mL 容量瓶中，加纯化水适量，超声（功率为1 600 W，频率为40 kHz）20 min 使其彻底溶解，加纯化水定容，摇匀，即得供试品溶液。取地夸磷索钠对照品适量，置电热恒温干燥箱中干燥至恒重，取10 mg，精密称定，置100 mL容量瓶中，加纯化水适量，超声使溶解，加纯化水稀释并定容，即得对照品溶液。

2.3 方法学考察

专属性试验：分别取2.2 项下对照品溶液、供试品溶液，以纯化水为阴性对照品溶液，各10µL，按2.1 项下色谱条件进样测定，结果对照品溶液在此色谱条件下的理论板数按地夸磷酸钠峰计为6 237，拖尾因子为0.909。地夸磷索钠理论板数不低于4 000，拖尾因子应不大于1.5，按外标法以峰面积计算。供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相同保留时间处有相应色谱峰。色谱图见图1。

1. 地夸磷索钠A. 对照品溶液 B. 供试品溶液 C. 阴性对照品溶液图1 高效液相色谱图1.Diauafosol sodiumA.Reference solution B.Test solution C.Negative reference solutionFig.1 HPLC chromatograms

破坏性试验：取地夸磷索钠样品100 mg，精密称定，置100 mL 容量瓶中，按2.2 项下方法制备浓度为1 mg/mL的供试品溶液，平行6份，除1份溶液未经破坏外，其余溶液分别经强酸（2 mol/L HCl溶液、室温3 h）、强碱（2 mol/L NaOH溶液、室温3 h）、强氧化（3%H2O2溶液室温3 h）、热（100 ℃水溶0.5 h）、强光［（4 500±500）Lx照射1 d］条件破坏，破坏后，调pH至中性，加纯化水衡释为质量浓度为100µg/mL的溶液，按2.1项下色谱条件进样测定，结果供试品溶液经酸破坏后峰面积减小，热破坏后峰面积增大，对碱、氧化、强光破坏相对稳定，各降解产物均能较好分离，且对地夸磷索钠主峰无干扰。

检测限与定量限确定：取2.2 项下对照品溶液适量，加纯化水逐级稀释，按2.1项下色谱条件进样测定，分别以信噪比（S/N）为3和10时待测成分的质量浓度作为检测限和定量限。结果地夸磷索钠检测限为0.01µg/mL，定量限为0.03µg/mL。

线性关系考察：取地夸磷索钠对照品0.032 36 g，精密称定，置50 mL容量瓶中，加纯化水适量，逐级稀释成质量浓度分别为3.23，32.30，161.50，323.00，484.50，646.00µg/mL 的系列溶液，按2.1项下色谱条件进样测定。以地夸磷索钠质量浓度（X，µg/mL）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程Y=11 346X+35 924（r=0.999 9，n=6）。结果表明，地夸磷索钠质量浓度在3.23～646.00 µg/ mL 范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验：取地夸磷索钠对照品适量，加纯化水分别制成质量浓度为40，100，400µg/mL 的溶液，在日内各重复进样5 次，并连续测定5 d。结果地夸磷索钠低、中、高质量浓度的对照品溶液日内及内间精密度试验结果的RSD均≤2.0%（n= 5）。取同一批（批号为220301）样品适量，按2.2 项下方法配制成质量浓度为100µg/mL 的供试品溶液，在同一试验室的不同时间，由不同操作人员分别用岛津LC - 2030 Plus 型、Agilent 1220 infinity LC 型、岛津LC-20 AD 型高效液相色谱仪测定样品含量，结果中间精密度试验结果的RSD为0.52%。上述结果表明仪器精密度良好。

重复性试验：取样品（批号为220301）适量，按2.2项下方法配制成质量浓度为100 µg/ mL 的供试品溶液，平行5 份，按2.1 项下色谱条件各进样测定2 次，记录色谱图。结果地夸磷索钠的平均含量为99.60%，RSD为0.36%（n=10），表明方法重复性良好。

稳定性试验：取样品（批号为220301）0.010 05 g，精密称定，按2.2项下方法配制成质量浓度为100µg/mL的供试品溶液，分别于室温放置0，1，2，4，6，8，10，12 h时按2.1 项下色谱条件进样测定，记录色谱图。结果的RSD为0.69%（n= 8），表明供试品溶液在室温下放置12 h内稳定性良好。

加样回收试验：取已知含量的样品（批号为220301）适量，共9份，分别置100 mL容量瓶中，分别加入质量浓度为0.401 0 mg / mL 的对照品溶液20，25，30 mL，各3 份，如纯化水适量，超声使溶解，加纯化水定容，按2.1项下色谱条件进样测定，记录色谱图。结果见表1。

表1 地夸磷索钠加样回收试验结果（n=9）Tab.1 Results of the recovery test of diauafosol sodium（n=9）

2.4 样品含量测定

取3 批（批号分别为220301，220302，220303）样品各适量，按2.2 项下方法制备供试品溶液，按2.1 项下色谱条件分别进样测定2次，记录峰面积，并计算含量。结果平均含量分别为99.84%，99.97%，99.35%，RSD分别为0.13%，0.06%，0.20%（n=2）。

3 讨论

3.1 检测波长选择

前期试验中，取对照品10 mg，精密称定，加纯化水，制成每1 mL 溶液中含地夸磷索钠50µg 的溶液，采用紫外分光光度计于200～400 nm 波长范围内进行扫描。结果地夸磷索钠溶液约在205 nm 及262 nm 波长处有最大吸收，由于205 nm 只检测到该峰末端部分，属紫外末端吸收，故检测波长选择262 nm。

3.2 色谱柱选择

C18或C8反相色谱柱常用于分离弱极性、中性、非极性化合物，用C18或C8短柱（100 mm×4.6 mm，3µm）分离地夸磷索钠，保留时间为1.0 min，换为长柱（250 mm×4.6 mm，5µm）保留时间仅延长至2.0 min，由于地夸磷索钠显极性，故在反相色谱柱中的保留时间极短。

3.3 磷酸盐缓冲液配制方法选择

地夸磷索钠解离常数为6.3，在流动相为pH 6.8的磷酸盐缓冲液中以解离型居多，若选择氢氧化钠调节pH，溶液中的钠离子会对药物中的钠离子形成干扰，降低含量测定的准确度，偏差变大；若将pH 调节剂换为氢氧化钾，可避免外源性钠离子对测定结果的干扰。地夸磷索钠为弱酸类物质，流动相中需加入季铵类离子对（四丁基硫酸氢铵）［19］等正离子与药物磷酸基团的负离子（反离子）生成不带电荷的中性离子对，增加供试品在反相色谱柱中的溶解度，增大分配系数，改善分离效果，延长保留时间，实现样品充分分离。故磷酸盐缓冲液配制方法为取磷酸二氢钾6.80 g，氢氧化钾1.316g，四丁基硫酸氢铵5.0 g，加纯化水1 000 mL，调pH 至6.8。同时发现，四丁基硫酸氢铵缓冲盐溶液室温放置8 h 以上可见浑浊，故需临用现配。