神经干细胞联合神经营养因子-3基因修饰的嗅鞘细胞移植对创伤性脑损伤大鼠神经功能的影响及机制

张召宇，李梦欣，李慧堂，李海明，金保哲

(1.新乡医学院第一附属医院神经外科,河南 卫辉 453100;2.河南省神经修复重点实验室,河南 卫辉 453100)

创伤性脑损伤(traumatic brain injury,TBI)是成人致残和死亡的重要因素[1]。TBI发生后会出现神经细胞的破碎、坏死、炎症反应以及神经营养因子缺乏等,进而导致患者出现不同程度的难治性神经功能障碍[2]。目前,临床对脑损伤后神经功能恢复有许多治疗方案,但治疗效果往往并不理想。神经干细胞(neural stem cells,NSCs)是一种单能干细胞,具有自我复制的能力,可转化为成熟的神经元[3]。有研究表明,嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cells,OECs)可促进轴突再生,调节免疫反应,增加血管生成[4]。GUÉROUT等[5]研究发现,大鼠切断喉返神经后,在吻合部位移植OECs可促进NSCs向神经元转化,增强损伤后神经系统功能的恢复和轴突再生能力。随着技术的发展,细胞移植技术为改善脑损伤后神经功能障碍提供了新的治疗方案[6]。基于此,本研究旨在探讨NSCs与神经营养因子-3(neurotrophin-3,NT-3)基因修饰的OECs联合移植对大鼠脑损伤后神经功能的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物102只健康清洁级雄性和2只健康清洁级雌性Sprague Dawley大鼠购自济南朋悦实验动物繁育有限公司(许可证号SCXK鲁20190003),2月龄,体质量(200±20)g。随机取2只雌鼠与2只雄鼠分别合笼,每天观察大鼠情况,雌鼠产仔后1 d,取出乳鼠进行后续实验。

1.2 主要试剂与仪器胎牛血清购自杭州四季青公司,达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbeco′s modified Eagle′s medium,DMEM)/F12购自美国HyClone公司,大鼠NSCs完全培养基购自武汉普诺赛生命科技有限公司,小鼠抗p75抗体、小鼠抗Nestind抗体、大鼠神经生长因子(nerve growth factor,NGF)抗体购自英国Abcam公司,酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)试剂盒购自郑州远东生物科技公司,NT-3基因慢病毒载体购自上海吉玛制药技术有限公司;显微镜购自日本Nikon公司,酶标仪购自上海科华生物工程股份有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 NSCs和OECs悬液制备取1日龄新生乳鼠,超净工作台中消毒、处死,取出脑组织,分离出海马体及嗅球组织,参考文献[7-8]中的方法分离培养NSCs和OECs,将2种细胞置于 37 ℃ 、含体积分数5% CO2培养箱内培养,NSCs使用NSCs完全培养基培养,OECs使用含体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12培养。培养7～10 d后,取生长状态良好的细胞,消化、离心、重悬,制备细胞悬液,调整细胞密度为1×108L-1。

1.3.2 NT-3基因修饰的OECs细胞悬液制备取2 mL生长状态良好的OECs悬液,加入6孔板中铺板,置于 37 ℃培养箱中培养24 h。弃去6孔板中原培养基,加入NT-3基因慢病毒载体(病毒滴度为10),置于细胞培养箱培养24 h后,弃慢病毒液,加入新鲜完全培养基。继续培养48 h后,取出生长状态良好的细胞,消化、离心、重悬,制备细胞悬液,调整细胞密度为1×108L-1。

1.3.3 动物分组及TBI模型构建将100只雄性大鼠按照随机数字表法分为假手术组、模型组、NSCs组、OECs组、联合治疗组,每组20只。模型组、NSCs组、OECs组、联合治疗组大鼠采用改良Feeney法构建TBI模型[9],具体操作如下:将大鼠麻醉后固定于打击器底座,暴露顶枕部皮肤,消毒后沿顶枕部中线切开头皮,分离周围组织,暴露颅骨,在矢状缝旁3.0 mm、人字缝前2.0 mm处开一圆形骨窗(直径约5 mm),保护硬脑膜完整,于高20 cm处使用40 g质量砝码自由下落打击骨窗,造成大鼠TBI。假手术组大鼠切开头皮,暴露硬脑膜后缝合头皮,不予打击。造模1 d后,将不同的试剂注入各组大鼠损伤灶进行细胞移植,模型组大鼠注入10 μL生理盐水,OECs组大鼠注入10 μL NT-3基因修饰的OECs悬液,NSCs组大鼠注入10 μL NSCs细胞悬液,联合治疗组大鼠注入5 μL NT-3基因修饰的OECs悬液和5 μL NSCs悬液,注射完成后继续常规饲养。

1.3.4 各组大鼠神经功能缺损程度评估分别于移植后 1、7、 14、28 d,随机取各组10只大鼠,采用改良神经功能缺损评分(modified neurological severity scores,mNSS)[10]评估各组大鼠的神经功能缺损程度,总分3～18分,分值越高表示神经功能缺损越严重。

1.3.5 ELISA法检测大鼠脑组织中白细胞介素(interleukin,IL)-6、IL-1β及NGF水平于移植后7 d,随机取各组3只大鼠,水合氯醛麻醉,取损伤灶周围2 mm脑组织,加入生理盐水进行组织匀浆,经短暂超声处理,离心后取上清液,使用IL-6、IL-1β、NGF ELISA检测试剂盒和酶标仪检测上清液中IL-6、IL-1β、NGF水平,严格根据ELISA试剂盒说明书进行操作。以所测标准品的吸光度值为横坐标,标准品浓度为纵坐标绘制标准曲线,得到直线回归方程,将各组样品的吸光值代入直线回归方程,得出IL-6、IL-1β、NGF水平。

1.3.6 苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色法观察大鼠脑组织病理学改变移植后28 d,随机取各组3只大鼠麻醉后处死,经心脏灌注甲醛后,断头取脑组织,石蜡包埋,切片。取脑组织切片,置于烤片机上1 h,然后脱蜡(二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ各浸泡5 min)、梯度乙醇复水,滴加苏木精染液,1 min 后用自来水冲洗,然后滴加分化液,30 s后,清水浸泡15 min,加入伊红染液,10 s后清水冲洗,晾干后封片,置于显微镜下观察大鼠脑组织病理学改变并拍照。

1.3.7 免疫组织化学染色法检测大鼠脑组织中NGF表达取各组大鼠移植后28 d的脑组织切片,经脱蜡、水化后,将切片浸泡在枸橼酸钠抗原修复液中,并加热至沸腾,然后置于室温冷却,取出切片浸泡于磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline,PBS)中3 min。向切片上滴加过氧化氢封闭内源性过氧化物酶,室温静置15 min,使用PBS 冲洗,然后滴加Triton X,室温静置10 min后,使用PBS反复冲洗。将切片置于湿盒中,加入山羊血清工作液室温封闭1 h,甩干,然后向切片上滴加50 μL NGF一抗工作液,置于冰箱中过夜,24 h后取出切片,室温放置30 min,加入100 μL二抗,室温孵育1 h,PBS冲洗;滴加100 μL二氨基联苯胺显色,自来水冲洗,苏木精复染,自来水冲洗、常规梯度乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封片,然后置于显微镜下观察。阳性细胞判定标准:细胞质被染为棕色,细胞核被染为蓝色。随机选3个视野(×200),计数每个视野阳性细胞。

2 结果

2.1 5组大鼠神经功能缺损程度比较结果见表1。移植后1、7、14、28 d,模型组、NSCs组、OECs组、联合治疗组大鼠mNSS评分显著高于假手术组,差异有统计学意义(P<0.05)。移植后1 d,模型组、NSCs组、OECs组、联合治疗组大鼠mNSS评分比较差异无统计学意义(P>0.05)。移植后7、14 d,NSCs组、OECs组、联合治疗组大鼠mNSS评分显著低于模型组,差异有统计学意义(P<0.05)。移植后7、14 d,NSCs组、OECs组、联合治疗组大鼠mNSS评分比较差异无统计学意义(P>0.05)。移植后28 d,NSCs组、OECs组、联合治疗组大鼠mNSS评分显著低于模型组,联合治疗组大鼠mNSS评分显著低于NSCs组和OECs组,差异有统计学意义(P<0.05)。移植后28 d,NSCs组与OECs组大鼠mNSS评分比较差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 5组大鼠神经功能缺损程度比较Tab.1 Comparison of the degree of neurological impairment of rats among the five groups

2.2 5组大鼠脑组织中IL-6、IL-1β、NGF水平比较结果见表2。模型组、NSCs组、OECs组、联合治疗组大鼠脑组织中IL-6、IL-1β水平显著高于假手术组,差异有统计学意义(P<0.05)。NSCs组、OECs组、联合治疗组大鼠脑组织中IL-6、IL-1β水平显著低于模型组,差异有统计学意义(P<0.05)。联合治疗组大鼠脑组织中IL-6、IL-1β水平显著低于NSCs组、OECs组,差异有统计学意义(P<0.05)。NSCs组与OECs组大鼠脑组织中IL-6、IL-1β水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。

表2 5组大鼠脑组织中IL-6、IL-1β、NGF水平比较Fig.2 Comparison of IL-6,IL-1β and NGF levels in brain tissue of rats among the five groups

NSCs组、OECs组、联合治疗组大鼠脑组织中NGF水平显著高于假手术组、模型组,差异有统计学意义(P<0.05)。假手术组与模型组大鼠脑组织中NGF水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。联合治疗组大鼠脑组织中NGF水平显著高于NSCs组、OECs组,差异有统计学意义(P<0.05)。NSCs组与OECs组大鼠脑组织中NGF水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.3 5组大鼠脑组织病理学改变结果见图1。假手术组大鼠脑组织结构完整,核仁明显,细胞排列有序。模型组大鼠损伤灶周围脑组织形态不规则,细胞肿胀,排列紊乱,可见坏死细胞及细胞核固缩,存在炎症细胞浸润。相较于模型组,NSCs组及OECs组大鼠脑组织细胞肿胀,排列紊乱,细胞核固缩、炎症浸润现象稍有改善。相较于模型组、NSCs组及OECs组,联合治疗组大鼠脑组织细胞排列相对规整,细胞肿胀减轻,核仁清晰。

A:假手术组;B:模型组;C:NSCs组;D:OECs组;E:联合治疗组。图1 5组大鼠脑组织病理学形态(HE染色,×400)Fig.1 Brain histopathological morphology of rats in the five groups (HE staining,×400)

2.4 5组大鼠脑组织中NGF蛋白表达比较结果见表3和图2。NSCs组、OECs组、联合治疗组大鼠脑组织中NGF阳性表达细胞数显著高于假手术组,模型组大鼠脑组织中NGF阳性表达细胞数显著低于假手术组,差异有统计学意义(P<0.05)。NSCs组、OECs组、联合治疗组大鼠脑组织中NGF阳性表达细胞数显著高于模型组,差异有统计学意义(P<0.05)。联合治疗组大鼠脑组织中NGF阳性表达细胞数显著高于NSCs组、OECs组,差异有统计学意义(P<0.05)。NSCs组与OECs组大鼠脑组织中NGF阳性表达细胞数比较差异无统计学意义(P>0.05)。

A:假手术组;B:模型组;C:NSCs组;D:OECs组;E:联合治疗组。图2 5组大鼠脑组织中NGF表达情况(免疫组织化学染色,×200)Fig.2 Expression of NGF in brain tissue of rats in the five groups (immunohistochemical staining,×200)

表3 5组大鼠脑组织中NGF阳性表达细胞数比较Tab.3 Comparison of the number of NGF positive expression cells in brain tissue of rats among the five groups

3 讨论

TBI除了有外力直接打击造成的原发性损伤灶,还有继发性损伤,如炎症反应、细胞凋亡、脑水肿等[11]。脑损伤后机体存在一定的自我修复功能,包括自发激活内源性NSCs、分泌各种营养因子。NT-3可维持神经元存活,在中枢神经系统发育过程中起调控作用,并能够影响神经细胞突触的活性。NGF能够正向调节神经元的生长、发育以及分化,维护、修复神经系统功能。周围脑组织内环境的紊乱往往使NSC不能长时间生存、分化,各种营养因子不能稳定持久分泌,导致机体自我修复能力十分有限。

有研究表明,在动物模型中外源性的NSCs移植是促进神经细胞再生和恢复损伤部位微环境的有希望的治疗方式之一[12]。然而,NSCs的分化不受控制,分化的神经元比例有限,衍生的星形胶质细胞是细胞移植后胶质瘢痕的主要原因[13]。有研究表明,移植OECs到中枢神经系统,不仅可以使脱髓鞘轴突再生并促进受损轴突的再生[14],而且还可以调节免疫反应并促进血管生成[15]。有研究发现,OECs可以分泌多种神经营养因子,从而诱导NSCs 向神经元的分化[16-17]。研究发现,NT-3 基因修饰的OECs可更高水平地分泌NT-3,提高OECs的神经修复作用[18]。本研究结果显示,移植后1、7、14、28 d,模型组大鼠mNSS评分显著高于假手术组,验证了TBI大鼠模型构建成功。本研究结果显示,移植后7、14 d,NSCs组、OECs组、联合治疗组大鼠mNSS评分显著低于模型组,NSCs组、OECs组、联合治疗组大鼠mNSS评分比较差异无统计学意义,说明移植后7、14 d NSCs和NT-3基因修饰的OECs单独或联合移植治疗均可改善大鼠神经功能缺损程度。本研究结果显示,移植后 28 d,NSCs组、OECs组、联合治疗组大鼠mNSS评分显著低于模型组,联合治疗组大鼠mNSS评分显著低于NSCs组和OECs组,NSCs组与OECs组大鼠mNSS评分比较差异无统计学意义;说明移植后 28 d NSCs和NT-3基因修饰的OECs单独或联合移植治疗均可改善大鼠神经功能缺损程度,且NSCs和NT-3基因修饰的OECs联合移植治疗对TBI大鼠的改善效果更好。此外,本研究HE染色结果显示,与模型组、NSCs组和OECs组比较,联合治疗组大鼠,脑组织细胞排列相对规整,细胞肿胀减轻,核仁清晰,说明NSCs和NT-3基因修饰的OECs联合移植可明显改善TBI大鼠脑组织病理学改变。

TBI在各种病理和生物化学反应下会导致损伤灶周围脑组织内环境紊乱。其中炎症反应发挥重要作用,其机制为细胞缺血、缺氧以及活化的炎症因子浸润神经组织,这些炎症因子又进一步增加了细胞的损伤程度,导致神经组织破坏,神经元变性、坏死,从而加重神经系统的损伤[19]。胶质细胞分泌的炎症因子(如IL-6、IL-1β等)在损伤部位广泛分布,是评价炎症反应的有效指标。本研究结果显示,模型组大鼠脑组织中IL-6、IL-1β表达水平显著高于假手术组,这表明脑损伤后损伤灶周围炎症反应增加。此外,本研究结果显示,联合治疗组大鼠IL-6、IL-1β表达水平显著低于模型组、NSCs组、OECs组,说明NSCs和NT-3基因修饰的OECs联合移植治疗可以显著降低大鼠脑损伤后神经系统的炎症反应。

NGF是神经营养因子的一种,对表达NGF受体的细胞具有营养作用,并且在免疫和炎症反应中也起到一定作用。此外,NGF可参与胶质细胞的增殖和分化,影响NSCs的潜在储备,调节NSCs的迁移和分化,并提供适合神经元存活的环境。因此,NGF能促进脑损伤后神经功能的恢复[20]。本研究结果显示,NSCs组、OECs组、联合治疗组大鼠脑组织中NGF阳性表达细胞数及NGF水平显著高于模型组,联合治疗组大鼠脑组织中NGF阳性表达细胞数及NGF水平显著高于NSCs组、OECs组,NSCs组与OECs组大鼠脑组织中NGF阳性表达细胞数及NGF水平比较差异无统计学意义;表明NSCs和NT-3基因修饰的OECs单独或联合移植治疗TBI大鼠均可提高脑组织中NGF表达水平,且联合移植治疗对TBI大鼠脑组织中NGF表达水平的提高更显著。

综上所述,NSCs和NT-3基因修饰的OECs联合移植治疗TBI大鼠可显著减轻大鼠神经功能缺损程度,提高NGF表达水平,减轻炎症反应,从而起到神经保护作用。