葱白提取物干预脂多糖诱导的心肌细胞凋亡和氧化应激损伤的实验研究

陈荣荣,张 茜

脓毒症心肌病是临床上脓毒症最常见的并发症之一,炎症、氧化应激、线粒体功能障碍及心肌细胞凋亡参与了脓毒症心肌损伤的发生;阐明心肌细胞损伤的机制,从而改善脓毒症病人心肌损伤状况,对临床治疗脓毒症具有重要意义[1-2]。研究表明,中医药在治疗脓毒症方面效果明显[3]。葱白为百合科植物葱近根部的鳞茎,是临床常用的中药,其主要化学活性成分为甾体及皂苷类化合物、黄酮类、挥发油类等,具有心脏保护、抗血栓、抗氧化、抗肿瘤等多种药理作用,可以治疗心脑血管疾病[4]。有研究报道,葱白提取物可抑制心肌梗死后心力衰竭大鼠的心肌纤维化[5];葱白提取物可通过抑制炎症反应与抗氧化损伤抗大鼠急性心肌缺血[6];葱白提取物可明显降低大鼠血清丙二醛(MDA),升高超氧化物歧化酶(SOD)及总抗氧化能力(total antioxidant capacity,T-AOC)水平,对缺血心肌具有保护作用[7]。以上研究表明,葱白提取物具有抗氧化作用,且可抗心肌缺血。然而葱白提取物对脂多糖(LPS)诱导的心肌细胞凋亡和氧化应激损伤的影响及机制尚不清楚。有研究报道,敲减miR-194-5p可抑制LPS诱导的心肌细胞炎性因子的分泌,可为心血管损伤的治疗提供新靶点[8]。因此,本实验旨在观察葱白提取物对LPS诱导的心肌细胞凋亡和氧化应激损伤的影响,并探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 H9c2细胞(美国ATCC);DMEM培养基(美国Hyclone);LPS(美国Sigma);葱白提取物(西安金绿生物工程技术有限公司);细胞毒性试验(CCK-8)试剂盒、蛋白提取试剂盒、凋亡检测试剂盒均购自上海吉至生化科技有限公司;MDA含量检测试剂盒、SOD活性检测试剂盒和过氧化氢酶(CAT)活性检测试剂盒均购自北京百奥莱博科技有限公司;荧光定量聚合酶链式反应(PCR)试剂盒购自上海科敏生物科技有限公司。

1.2 CCK-8法检测LPS对H9c2细胞活性的影响 H9c2细胞用DMEM培养基培养,取对数生长期细胞,分别用1 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL的LPS处理,在5%体积分数CO2、37 ℃恒温培养箱中培养48 h后,每孔加入10 μL的CCK-8试剂继续培养2 h,酶标仪检测450 nm波长处吸光度值(A)。后续试验选择细胞活性约为50%的LPS浓度。

1.3 细胞处理与分组 常规培养的H9c2细胞作为NC组,单独用LPS 10 μg/mL处理的H9c2细胞作为LPS组,分别用25 mg/mL、50 mg/mL、100 mg/mL葱白提取物和LPS 10 μg/mL处理的H9c2细胞作为葱白提取物低剂量组、中剂量组、高剂量组;将miR-194-5p抑制剂及阴性对照转染至H9c2细胞后用10 μg/mL的LPS处理,作为anti-miR-194-5p+LPS组、anti-miR-NC+LPS组;将miR-194-5p模拟物及阴性对照转染至H9c2细胞后用100 mg/mL葱白提取物和10 μg/mL的LPS处理,作为miR-194-5p+葱白提取物高剂量+LPS组、miR-NC+葱白提取物高剂量+LPS组。

1.4 蛋白质印迹法(Western Blot)检测蛋白表达 提取各组H9c2细胞的总蛋白,定量变性后取50 μg进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),然后转膜、封闭,分别加入Cleaved-Caspase-3和Bax一抗(1∶800),4 ℃孵育过夜;洗膜后加入二抗(1∶2 000)室温孵育2 h,显影、成像后分析蛋白条带灰度值,以β-actin为内参。

1.5 流式细胞仪检测细胞凋亡 取各组培养48 h的细胞,加入胰酶消化后用磷酸缓冲盐溶液(PBS)漂洗细胞2次,加入结合缓冲液轻摇使之形成均匀细胞悬液,分别加V-异硫氰酸荧光素(annexin V-FITC)和碘化丙啶(propidium iodide,PI)各5 μL,轻摇混匀,常温避光孵育15 min,上流式细胞仪检测。

1.6 酶联免疫吸附法(ELISA)检测细胞中MDA含量及SOD、CAT活性 细胞培养48 h后收集各组细胞,分别按各自试剂盒说明书进行操作。

1.7 实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测miR-194-5p表达水平 提取各组H9c2细胞总RNA,合成cDNA后以U6为内参进行PCR扩增,相对表达量采用2-△△Ct法计算。miR-194-5p正向引物序列为5′-GCCGTGTAACAGCAACTCCA-3′,反向引物序列为5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′;U6正向引物序列为5′-GTGGACCGCACAAGCTCGCT-3′,反向引物序列为5′-TTGTTGAACGGCACTGTGTATAGCA-3′。

2 结 果

2.1 不同浓度LPS对H9c2细胞活性的影响 与0 μg/mL的LPS比较,1 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL的LPS处理后H9c2细胞活性明显降低(P<0.05)。详见表1。选择细胞活力为50%左右的LPS浓度(10 μg/mL)用于后续试验。

表1 不同浓度LPS对H9c2细胞活性的影响

2.2 不同浓度葱白提取物对LPS诱导的H9c2细胞凋亡及蛋白表达的影响 与NC组比较,LPS组Cleaved-Caspase-3、Bax蛋白表达水平和H9c2细胞凋亡率升高(P<0.05);与LPS组比较,葱白提取物低、中、高剂量组Cleaved-Caspase-3、Bax蛋白表达水平和H9c2细胞凋亡率降低(P<0.05)。详见图1、图2及表2。

图1 流式细胞仪检测各组H9c2细胞凋亡

图2 Western Blot检测各组Cleaved-Caspase-3、Bax蛋白表达

表2 各组H9c2细胞凋亡率及Cleaved-Caspase-3、Bax蛋白表达水平比较

2.3 不同浓度葱白提取物对LPS诱导的H9c2细胞氧化应激损伤的影响 与NC组比较,LPS组MDA含量升高,SOD和CAT活性降低,差异均有统计学意义(P<0.05);与LPS组比较,葱白提取物低、中、高剂量组MDA含量降低,SOD和CAT活性升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表3。

表3 各组氧化应激指标MDA、SOD、CAT比较

2.4 不同浓度葱白提取物对LPS诱导的H9c2细胞中miR-194-5p表达水平的影响 与NC组比较,LPS组miR-194-5p表达水平升高(P<0.05);与LPS组比较,葱白提取物低、中、高剂量组miR-194-5p表达水平降低(P<0.05)。详见表4。

表4 各组LPS诱导的H9c2细胞中miR-194-5p表达水平比较

2.5 anti-miR-194-5p对LPS诱导的H9c2细胞凋亡、蛋白表达和氧化应激损伤的影响 与anti-miR-NC+LPS组比较,anti-miR-194-5p+LPS组miR-194-5p表达水平降低,Cleaved-Caspase-3、Bax蛋白表达水平和细胞凋亡率降低,MDA含量降低,SOD和CAT活性升高,差异均有统计学意义(P<0.001)。详见图3、图4及表5。

图3 流式细胞仪检测H9c2细胞凋亡

图4 Western Blot检测Cleaved-Caspase-3、Bax蛋白表达

表5 anti-miR-194-5p对LPS诱导的H9c2细胞凋亡蛋白表达和氧化应激损伤的影响

2.6 miR-194-5p逆转葱白提取物对LPS诱导的H9c2细胞凋亡和氧化应激损伤的影响 与miR-NC+葱白提取物高剂量+LPS组比较,miR-194-5p+葱白提取物高剂量+LPS组miR-194-5p表达水平升高,Cleaved-Caspase-3、Bax蛋白表达水平和细胞凋亡率升高,MDA含量升高,SOD和CAT活性降低,差异均有统计学意义(P<0.001)。详见表6及图5、图6。

图5 流式细胞仪检测H9c2细胞凋亡

图6 Western Blot检测Cleaved-Caspase-3蛋白表达

表6 miR-194-5p逆转葱白提取物对LPS诱导的H9c2细胞凋亡和氧化应激损伤的影响

3 讨 论

脓毒症心肌病的发生是脓毒症病人预后不良的预测因素之一,氧化应激是脓毒症多脏器,多系统损伤的根本机制,参与了心肌损害的发病过程,抗氧化剂可能成为脓毒症治疗的新策略[9-11]。有研究表明,葱白提取物可通过提高硫化氢(H2S)和一氧化氮(NO)水平抗大鼠急性心肌缺血[12]。葱白提取物通过线粒体途径减少心肌细胞凋亡从而对心肌缺血再灌注损伤起保护作用[13]。葱白提取物可降低急性心肌缺血兔血清中MDA水平,升高SOD水平[14]。本实验用不同浓度LPS处理心肌细胞,选择细胞活力为50%左右的LPS浓度(10 μg/mL)用于后续试验,建立细胞损伤模型;LPS诱导的心肌细胞H9c2的凋亡率升高,MDA含量升高,SOD和CAT活性降低。而用不同浓度葱白提取物预处理后,H9c2细胞凋亡率降低,MDA含量降低,SOD和CAT活性升高。表明葱白提取物可抑制LPS诱导的心肌细胞凋亡及氧化应激反应。本实验结果表明,葱白提取物在LPS诱导的心肌细胞中同样具有抗凋亡和抗氧化应激损伤的作用。

研究报道,敲除lncRNA MALAT1可通过miR-194-5p/FOXP2轴抑制细胞凋亡从而减轻LPS诱导的急性肺损伤[15]。circ-USP1通过调节miR-194-5p/DNMT3A轴保护肾小管免受缺氧诱导的肾损伤[16]。且已有研究报道敲减miR-194-5p可抑制LPS诱导的心肌细胞炎症反应[8]。本实验结果显示,LPS诱导的心肌细胞中miR-194-5p表达水平升高;抑制miR-194-5p表达后,细胞凋亡率降低,MDA含量降低,SOD和CAT活性升高,表明抑制miR-194-5p表达可抑制LPS诱导的心肌细胞凋亡及氧化应激。

此外,本实验还发现葱白提取物处理可降低miR-194-5p表达水平;过表达miR-194-5p和高剂量葱白提取物处理后,心肌细胞凋亡率升高,MDA含量升高,SOD和CAT活性降低。说明miR-194-5p过表达逆转了葱白提取物对LPS诱导的H9c2凋亡和氧化应激损伤的影响。

综上所述,葱白提取物通过下调miR-194-5p抑制LPS诱导的心肌细胞凋亡和氧化应激损伤。