利用小RNA深度测序技术鉴定江苏盐城辣椒病毒种类

赵小慧　刘冲　郁凯　钟明娟　郑佳秋　邢锦城

摘要： 2019年6月江蘇省盐城市发生了较为严重的辣椒病毒病，危害症状表现为植株重度矮化、叶片黄化、蕨叶甚至畸形。将采集的11株疑似感染病毒的辣椒植株叶片研磨成浆液，再用其摩擦接种本氏烟植株，发现用其中3株辣椒的叶片浆液摩擦接种本氏烟植株后，本氏烟植株出现病毒侵染的典型症状，初步判断这些辣椒被病毒感染，但不能确定其种类和归属。为了进一步明确辣椒感染的病毒类型，将3株辣椒样品混成2份样品利用小RNA深度测序技术和生物信息学分析法进行检测，结果发现样品1被蚕豆萎蔫病毒2号（Broad bean wilt virus 2，BBWV2）、苜蓿花叶病毒（Alfalfa mosaic virus， AMV）和辣椒脉斑驳病毒（Chilli veinal mottle virus， ChiVMV）3种病毒复合侵染，从样品2中检测到BBWV2 1种病毒，通过RT-PCR检测验证了这一结果的可靠性。最后利用RT-PCR方法对田间采集的11份辣椒样品和接种的本氏烟植株进行毒源鉴定，其中2株辣椒样品及其接种的本氏烟叶片上鉴定出了BBWV2、ChiVMV和AMV，这3种病毒侵染辣椒在江苏省均为首次发现。研究结果为对江苏省辣椒构成潜在严重威胁的病毒的早期诊断和及时防控提供了参考。

关键词： 辣椒；小RNA深度测序；病毒病

中图分类号： S436.418.1⁺2 文献标识码： A 文章编号： 1000-4440（2023）01-0037-07

Identification of viruses from peppers in Yancheng， Jiangsu province by small RNA deep sequencing

ZHAO Xiao-hui¹， LIU Chong¹， YU Kai¹， ZHONG Ming-juan²， ZHENG Jia-qiu¹， XING Jin-cheng¹

（1.Institute of Agricultural Sciences in the Coastal District of Jiangsu Province， Yancheng 224002， China;2.Zhucheng Agricultural and Rural Bureau， Zhucheng 262200， China）

Abstract： In June 2019， an incidence of relatively serious pepper virus disease was reported in Yancheng City， Jiangsu province. The symptoms included plant dwarf stature， yellowing and deformities of pepper leaves. Eleven strains collected from pepper leaves infected with suspected virus were inoculated into Nicotiana benthamiana leaves by surface rubbing and it was found that three strains of peppers had typical symptoms of virus infection after surface inoculation of N. benthamiana. It was preliminarily suggested that these peppers were infected by a virus with unknown identity. In order to further clarify the virus type， two samples obtained by mixing three pepper standard samples were detected by small RNA deep sequencing technology and bioinformatics analysis. It was found that sample 1 was co-infected by

broad bean wilt virus 2 （BBWV2）， alfalfa mosaic virus （AMV） and chilli veinal mottle virus （ChiVMV）. One virus of BBWV2 was detected in sample 2， and RT-PCR detection verified the reliability of the results. Finally， 11 pepper samples collected from the field and inoculated N. benthamiana were identified by RT-PCR. This is the first report of BBWV2， ChiVMV and AMV viruses infecting peppers in Jiangsu. The current study acts as a base line for early diagnosis and timely prevention and control of novel viral strains that pose a potential threat to peppers in Jiangsu province.

Key words： pepper;small RNA deep sequencing;viral disease

辣椒（Capsicum annum L．）是中国极为重要的一种蔬菜作物，其种植面积和产值在各类蔬菜中位列第一，是中国第一大蔬菜作物^[1]。辣椒病毒病是辣椒上常发生的灾害性病害之一，其发病症状主要表现为辣椒植株整体矮化以及花叶、蕨叶、黄化、顶枯、坏死和畸形等，对辣椒生产造成了严重影响，通常情况下使产量损失30%～70%，严重时可致绝收^[2]。截至2022年4月，中国报道的自然侵染辣椒的植物病毒已有37种，包括黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）、烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）、辣椒輕斑驳病毒（Pepper mild mottle virus，PMMoV）、蚕豆萎蔫病毒2号（Broad bean wilt virus 2，BBWV2）在内的33种病毒^[3]以及烟草蚀纹病毒（Tobacco etch virus，TEV）^[4]、瓜类褪绿黄化病毒（Cucurbit chlorotic yellows virus，CCYV）^[5]、西瓜银色斑驳病毒（Watermelon silver mottle virus，WSMoV）^[6]、小米椒内源RNA病毒1（Capsicum frutescens endornavirus 1，CFEV 1）^[7]。总体而言，虽然中国不同地区侵染辣椒的病毒种类各有差异，但CMV和TMV仍是目前全国范围内辣椒上分布最广且危害最重的病毒^[3，8]。近年来，随着江苏省辣椒种植面积的不断扩大，病毒病的发生也愈发严重。目前，已有关于危害江苏省辣椒的主要病毒种类、分布和复合侵染类型等的报道。吴淑华等^[9]采用RT-PCR检测技术首次在江苏南京的辣椒植株上发现了PMMoV；乔俊卿等^[10]在江苏淮安的设施辣椒病样上检测到PMMoV和辣椒隐症病毒（Pepper cryptic virus，PCV）；刘勇等^[3]采用血清学、分子生物学等检测方法对中国31个省（市、自治区）主要蔬菜作物的病毒病样品进行鉴定，发现PMMoV是危害江苏辣椒生产的主要病毒；吴贺等^[5]采用RT-PCR方法在苏南五地（市）的辣椒样品上检测出9种病毒，其中PMMoV的检出率最高，番茄黄化曲叶病病毒（Tomato yellow leaf curl virus，TYLCV）的检出率次之，两者均是危害这些地区辣椒的主要病毒；于海龙等^[4]对中国16个省（市、自治区）的辣椒病样进行血清学检测，结果在江苏省采集的1个辣椒样品中鉴定出PMMoV、TMV和番茄花叶病毒（Tomato mosaic virus，ToMV）3种病毒。由此可见，PMMoV为侵染江苏省辣椒的优势种，发生最为普遍，但在省内各地区，因耕作制度、种植品种及气候环境等因素不同，辣椒上发现的病毒种类和危害程度也不同，这为江苏省辣椒的安全生产带来不少挑战。

盐城市地处苏北沿海，光温资源丰富，是江苏省优质辣椒的生产基地。近年来，当地因辣椒连作导致病毒病频发，严重损害了苏北辣椒的产量、外观品质和产业健康发展。因此，迫切需要对危害盐城地区辣椒的病毒种类进行调查，为当地病毒病的防控和抗病育种提供指导。本研究采用生物学方法及小RNA深度测序结合RT-PCR验证方法对侵染盐城辣椒的病毒进行鉴定，以期为江苏省辣椒病毒病的预防和综合防治奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

于2019年6月从盐城南洋试验场的设施辣椒大棚中采集叶片表现为黄化、蕨叶、畸形等症状的疑似感染病毒病的辣椒样品11株，在田间记录品种编号和发病症状，采集病株后装入自封袋中带回实验室，集中拍照后保存于-80 ℃冰箱中备用。

1.2 方法

1.2.1 病毒分离物的摩擦接种 将辣椒叶片放入预冷消毒的研钵中，加入适量磷酸盐缓冲溶液（0.01 mol/L，pH7.5），用研棒充分研磨叶片成浆液；在待接种的5～6叶期本氏烟叶片上均匀喷洒600目的金刚砂，用研棒蘸取适量叶片浆液轻轻摩擦叶片，每株摩擦接种3张叶片（植株顶端叶不摩擦接种），以接种缓冲液作为对照；接种的本氏烟用喷壶在其叶片上喷水后置于光照培养箱中培养，3 d后开始观察系统叶的发病症状。

1.2.2 小RNA深度测序 将在本氏烟上症状表现严重且复杂的3株辣椒样品混成2份样品后送至青岛百迈客生物公司进行小RNA测序。参照TRIzol试剂盒（Invitrogen）的说明书提取2份样品总RNA，用Nanodrop 2000对提取的RNA进行质量浓度和纯度的测定，用Agilent 2100对RNA样本进行完整性分析。当测定质量浓度≥250 ng/μl，体积≥10 μl，OD260/280≥1.8，OD260/230≥1.0，RIN值≥8.0时，认为样品检测合格，将检测合格的样品通过VAHTSTM small RNA Library Prep Kit for Illumina（诺唯赞，NR801-02）构建文库，构建好的文库再用Illumina novaseq 6000进行小RNA测序分析。

1.2.3 原始数据的处理与分析 除去含有接头序列、低质量序列、短于18个或长于35个核苷酸的序列，获得有效测序序列（Clean reads）；用Bowtie软件将Clean reads分别与各数据库中的序列进行比对，过滤核糖体RNA（rRNA）、转运RNA（tRNA）、核内小RNA（snRNA）、核仁小RNA（snoRNA）等ncRNA及重复序列，剩余未比对到的小RNA（sRNA）通过velvet软件进行拼接，获得能组装病毒RNA的较长重叠群（Contigs）；通过与病毒核苷酸数据库、蛋白质数据库进行BLAST比对，对获得的Contigs进行分类注释，以明确感染病毒的信息。

1.2.4 PCR/RT-PCR验证 为了验证小RNA深度测序结果的准确性，对于每种注释的病毒，分别根据小RNA深度测序得到的拼接序列和GenBank中与拼接序列同源性最高的病毒基因序列的保守区域设计2对特异性引物。所有引物通过DNAman 7.0和DNAstar 5.01软件设计，引物由南京金斯瑞生物科技股份有限公司合成。另外参照文献[3]和[11]分别合成辣椒上常见的2种病毒（CMV和TMV）的2对特异性引物（表1）。分别按照植物基因组DNA提取试剂盒（Tiangen）和植物总RNA提取试剂盒（Foregene）的说明书提取用于小RNA深度测序的2份病样叶片的总DNA、总RNA，以总RNA为模板，XT176（5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGA￣G￣T￣A￣C￣T￣T￣T￣T￣T￣T￣T￣T￣T￣TTTTTTTTT-3′）和XT269（5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGNNNNNN-3′，N=A/G/C/T）为引物，参照反转录酶M-MLV（Promega，USA）的说明书合成cDNA，以合成的cDNA和提取的DNA为模板，用上述设计的引物和Taq Plus DNA聚合酶[生工生物工程（上海）股份有限公司]进行PCR扩增。扩增结束后，用10 g/L琼脂糖凝胶电泳扩增产物，在紫外灯下发现目的条带后割胶回收，将回收的扩增片段连接到pMD19-T simple载体（TaKaRa）上，并用该载体转化大肠杆菌DH5α感受态，之后选取3个经菌落PCR筛选到的阳性克隆，送至苏州金唯智生物科技有限公司测序。获得的序列用DNASTAR 5.0软件的Seqman程序进行拼接处理，得到的扩增片段序列在美国国家生物技术信息中心（NCBI）网站中利用BLASTn检索进行在线比对分析。最后依据RT-PCR扩增效果和序列比对结果验证小RNA深度测序的准确性并筛选出用于检测后续样品中病毒的引物，进一步应用筛选出的引物对采集的所有辣椒病样和接种的本氏烟进行RT-PCR检测，根据检测结果明确侵染江苏盐城辣椒的病毒类型。

2 结果与分析

2.1 田间辣椒发病情况

于2019年6月对江苏盐城南洋试验场设施大棚内的辣椒进行病害调查，发现部分辣椒植株疑似感染病毒病，主要表现为植株整体矮小、上部叶轻度花叶或蕨叶，同时还有不同程度的黄化症状混发（图1），采集的样品信息见表2。

2.2 病毒分离物的摩擦接种

分别用采集的11株辣椒叶片浆液摩擦接种5～6叶期的指示植物本氏烟植株，对照用磷酸缓冲液接种，对接种后的本氏烟植株进行观察并记录症状。如图2所示，3株辣椒叶片浆液接种后，本氏烟植株出现病毒侵染的典型症状，其中用辣椒品系19068-1、19068-3的叶片浆液接种本氏烟植株6 d后，叶片表现出轻微卷曲、花叶等症状，随后出现黄绿相间的花叶、扭曲，严重的产生畸形，整个植株矮缩、黄化直至坏死；用辣椒品系19068-5的叶片浆液接种本氏烟植株6 d后，出现蕨叶、花叶等症状，之后症状加重，但是植株长势良好；用其余样品叶片浆液接种的本氏烟植株发病症状不明显，而对照植株则生长正常。上述感病本氏烟植株的症状均由病毒病侵染造成，说明辣椒品系19068-1、19068-3和19068-5疑似被病毒感染，但是需要进一步分析来明确病毒的种类和来源。

2.3 小RNA深度测序结果分析

为了进一步确定危害盐城地区辣椒的病毒类型，将上述3株疑似被病毒侵染的田间辣椒样品混成2份样品用于小RNA深度序列测定，其中19068-1、19068-3混为1份，编号为Pe-1，19068-5单独为1份，编号为Pe-2。测序后从Pe-1中获得14 032 995条原始测序序列 （Raw read），去除冗余测序序列（Read），得到12 298 498条Clean read，再过滤后剩余11 139 129条Read，对过滤后获得的序列进行拼接，共得到1 829个Contig，对获得的Contig进行分类注释，结果发现Pe-1中包含BBWV2、苜蓿花叶病毒（Alfalfa mosaic virus，AMV）、辣椒脉斑驳病毒（Chilli veinal mottle virus，ChiVMV）和烟草脉明病毒（Tobacco vein clearing virus，TVCV）等4种病毒。测序后从Pe-2中获得18 076 432条Raw read，去除冗余Read后得到12 994 439条Clean read，再过滤后剩余10 713 241条Read，对过滤后获得的序列进行拼接，共得到2 847个Contig，对获得的Contig进行分类注释，结果发现Pe-2中包含BBWV2、蚕豆萎蔫病毒1号（Broad bean wilt virus 1，BBWV1）、甘薯明脉病毒（Sweet potato vein clearing virus，SPVCV）等3种病毒。上述注释的病毒中，SPVCV为环状DNA病毒，其余病毒为RNA病毒。测序的具体结果见表3。

2.4 PCR/RT-PCR验证和检测

为了验证小RNA深度测序结果的准确性，以用于小RNA深度测序的2份辣椒病样叶片DNA/RNA为模板，用方法1.2.4设计的引物分別对注释到的SPVCV病毒进行PCR验证，对其余病毒进行RT-PCR验证。结果显示，3种注释到的病毒（BBWV2、ChiVMV和AMV）均筛选到1对特异性较好的引物（表1），且在相应的辣椒样品中扩增到了预期大小的条带（图3）。将得到的目的条带回收纯化、克隆测序后进行序列比对分析，发现从样品Pe-1、Pe-2中扩增的BBWV2片段的核苷酸序列完全一致，两者与NCBI中BBWV2分离物XJ14-3（登录号：FN985164.1）的核苷酸序列一致性最高，为94.49%；从样品Pe-1中扩增的ChiVMV核苷酸序列与NCBI中ChiVMV分离物Korea（登录号：AM909717.1）具有最高的核苷酸序列相似度（97.39%）；而从Pe-1样品中扩增得到的AMV核苷酸序列与AMV分离物ER1（登录号：KX579896.2）的核苷酸序列相似度也高达98.32%。以上结果说明，Pe-1样品中存在BBWV2、ChiVMV和AMV 3种病毒，Pe-2样品中存在BBWV2 1种病毒，BBWV2、ChiVMV和AMV侵染辣椒均为江苏省首次报道。在小RNA深度测序注释到的病毒中，有3种病毒TVCV、BBWV1和SPVCV未通过PCR/RT-PCR验证，推测由于病样中这些病毒的丰度过低或是在处理数据过程中因缺少相关信息而造成结果匹配度差，从而影响检测效果。另外，在2份辣椒病样中也未检测到辣椒上常见的TMV、CMV 2种病毒，此结果进一步说明RT-PCR验证结果与小RNA深度测序结果存在一致性。

为确定田间采集的11株辣椒样品和实验室接种本氏烟上携带病毒的情况，用上述筛选得出的扩增3种病毒效果较好的引物及TMV、CMV特异性引物对上述样品进行RT-PCR 检测。结果显示，辣椒品系19068-5确实被BBWV2单独侵染，19068-1、19068-3均被BBWV2、ChiVMV和AMV复合侵染，其余样品中未检测到病毒（表4）。此外，接种的本氏烟植株病叶上均扩增到相应片段，表明接种上述辣椒病样叶片浆液后，本氏烟植株上也存在相应的病毒。

3 讨论

辣椒作为中国一种重要的蔬菜作物，极易受到病毒感染。目前用于检测和鉴定辣椒病毒病的方法有很多，常规的主要包括生物学检测^[12]、电镜观察检测^[13-14]、血清学检测^{[2，4，15-18]}和分子生物学检测^[19-21]等，这些方法都在辣椒病毒种类鉴定方面得以成功应用，但是在发现未知病毒方面还存在一定局限性。新兴的小RNA深度测序技术丰富了病毒种类的鉴定方法，它可以同时检测出多种RNA或DNA病毒，还能发掘新的病毒种类，已被广泛用于辣椒病毒的鉴定^[7，22-24]。2019年6月在对江苏盐城南洋试验场设施辣椒进行病害调查时，发现多株叶片表现黄化、蕨叶等疑似感染病毒病的辣椒植株，但是设施大棚内辣椒的一些生理性病害或药害可能干扰辣椒病样采集的准确性。因此，本研究首先利用生物学检测法对采集的11株疑似感染病毒的辣椒植株样品进行初步分析，结果发现，用其中3株辣椒病叶浆液摩擦接种的本氏烟植株出现了病毒病侵染的典型症状，初步判断这些辣椒被病毒感染，但还不能确定其种类和归属。为进一步明确辣椒感染的病毒类型，用小RNA深度测序技术和生物信息学分析方法对这3株辣椒样品混成的2份样品进行检测，结果发现，样品1被BBWV2、AMV和ChiVMV 3种病毒复合侵染，样品2只感染了BBWV2 1种病毒，RT-PCR检测验证了这一结果的可靠性。最后利用RT-PCR法对田间采集的11株辣椒样品和接种的本氏烟植株进行毒源鉴定，发现从上述3株辣椒样品和其接种的本氏烟植株叶片上均鉴定到了相应病毒，而在其他8株辣椒样品中未发现任何病毒。当然，此结果并不能完全排除这8株辣椒样品中存在一些其他或未知病毒的可能性，这还有待进一步研究。上述结果表明，不同病毒检测方法各有特点，在实际生产过程中如将多种方法结合起来使用，或许能够建立一套快速、准确、灵敏、高效的辣椒病毒检测体系。

在自然界中，植物经常受到2种或多种病毒的复合侵染，这种复合侵染往往会引发病毒的协生作用，导致寄主产生比单独一种病毒侵染更为严重的症状^[25]。本研究涉及的病毒中，ChiVMV是马铃薯Y病毒科（Potyviridae）马铃薯Y病毒属（Potyvirus）的一个成员。据报道，ChiVMV侵染烟草后主要引起褪绿、黄化、花叶、疱斑和叶缘下卷等典型症状^[26]；而AMV作为雀麦花叶病毒科（Bromovirus）苜蓿花叶病毒属（AIfamovirus）的典型成员，有研究结果证实其感染本氏烟后会出现系统性斑驳花叶、明脉症状^[27]。在本研究中，属于豇豆花叶病毒科（Comoviriadae）蚕豆病毒属（Fabavirus）典型种的BBWV2单独侵染本氏烟后表现的症状为花叶、蕨叶，植物长势较正常，而ChiVMV、AMV和BBWV2 3种病毒复合侵染本氏烟却产生了协生作用，引起了极严重的坏死症状。在以往的研究中，作为马铃薯X病毒属典型种的马铃薯X病毒（Potato virus X，PVX）分别与马铃薯Y病毒属成员的马铃薯Y病毒（Potato virus Y，PVY）或TEV^[28]、李痘病毒（Plum pox virus，PPV）^[29]、烟草脉带花叶病毒（Tobacco vein banding mosaic virus，TVBMV）^[25]复合侵染本氏烟时均能产生类似的系统坏死症状。从本研究结果可以看出，病毒复合侵染寄主引起的协生作用在自然界普遍存在，它不仅能导致植物病害症状加重，增加病毒种类鉴定的难度，甚至能造成毁灭性损害，危害程度不容忽视。

值得注意的是，本研究测到的BBWV2、ChiVMV、AMV 3种病毒侵染辣椒在江苏省均为首次报道。BBWV2的寄主范围十分广泛，可侵染包括辣椒、大豆、黃瓜、菠菜、烟草、白术在内的44科植物，目前BBWV2侵染在国内多地辣椒上均有大面积发生，且有逐年加重的趋势，对各地辣椒产业的健康发展造成重大影响^[3，30]。而ChiVMV也能侵染辣椒、南瓜、番茄、烟草、茄子、曼陀罗等多种农作物，是一种危害非常严重的病毒，迄今ChiVMV已蔓延至中国广东、陕西、四川、云南等十几个省（区），严重威胁各地辣椒的安全生产^[31]。BBWV2、ChiVMV均可通过蚜虫以半持久性方式进行传播和汁液接触方式进行传播，因此建议要做好盐城地区辣椒相关病毒病的调查工作，发现病株后及时铲除，加强传播介体蚜虫的防控，以阻止由2类病毒扩散蔓延而造成的严重损失。AMV能侵染豆科牧草、豌豆、菜豆、大豆、辣椒、烟草等多种植物，其中豆科牧草苜蓿是AMV最常见的寄主^[32]，而AMV侵染辣椒的频率在中国并不高，只是偶尔发生且分布不广泛^[3]。AMV由各种蚜虫以非持久的方式传播，还可通过汁液接触、花粉和种子进行传播，由于AMV随种苗进行远距离传播的风险较大，因此在辣椒引种过程中要慎重，选用优质健康种苗。此外，在田间避免创伤性农事操作，及时清除病残体，严格控制传播介体，选育抗病毒辣椒品种等方法，都可对此病毒进行有效防控。

近年来，随着江苏盐城地区设施辣椒种植面积的逐年扩大，辣椒病毒病发生也不断加重，严重影响了当地辣椒的产量和品质。本研究对江苏盐城地区辣椒病毒进行了初步检测，研究结果为对江苏省辣椒构成威胁的病毒的早期诊断和及时防控提供了依据。后期将进一步加大感染病毒病辣椒样品的采集和鉴定力度，对辣椒上的优势病毒、分布及其危害情况进行系统且全面的调查和鉴定，为辣椒病毒病的综合防控和抗病育种方向提供更有力的指导。

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（责任编辑：徐 艳）