肌肉减少症动物模型造模方法研究进展*

王 维，杨 艳，张伊祎，张学军，张 磊

电子科技大学附属四川省人民医院/四川省医学科学院·四川省人民医院 （成都 610072）

肌肉减少症（肌少症）是一种主要表现为肌肉质量减少、肌力减退、肌肉功能下降，导致机体功能退化、跌倒、卧床、死亡等不良结局的综合征；常发生于老年人群，是一个与年龄密切相关的发展过程。随着我国人口老龄化的推进，肌少症已经成为影响老年人身体健康及生活质量的重要因素。但目前学界对肌少症的认识尚不充分，进一步研究肌少症发病机制、干预和治疗方法的前提是筛选和建立肌少症动物模型。本文拟探讨肌少症动物模型的造模方式、造模动物的优缺点、各种模型的适用范围，以及肌少症动物模型的评定标准，以期为后续肌少症动物造模研究提供参考。

1 肌少症

1.1 肌少症定义

肌少症的概念于1989年由Rosenberg提出。2010年欧洲老年人肌少症工作组发表了肌少症共识，将肌少症定义为一种与增龄相关的肌肉质量减少、肌肉力量下降和/或躯体功能减退的老年综合征[1]。2018 年欧洲老年人肌少症工作组修订了肌少症的定义，以肌肉力量作为肌少症诊断的主要参数，并使用躯体功能评估病情的严重程度。目前肌少症的定义已在世界范围内被广泛接受，肌少症也成为近年来国外研究的热点。

1.2 肌少症的研究现状

随着人口老龄化的推进，肌肉骨骼疾病已经成为全球公共健康问题。肌少症严重影响老年人的身体健康，导致老年人衰弱、跌倒、骨折发生率增加[2]。肌少症在危害老年人身体健康的同时，还会导致老年人心理负担加重，最终影响老年人的生活质量。据统计，2018年我国60 岁以上人口占总人口的25%，预计到2050 年，65 岁以上人口有望突破4 亿[3]。肌少症在60～70 岁人群中发病率为5%～13%，≥80 岁人群发病率可达11%～50%[4]。Goates等[5]根据最新的肌少症分类和医院支出数据，对肌少症的经济负荷进行评估发现，2019年美国肌少症患者治疗成本平均为260 美元/人，全球成本为404 亿美元。因此，对肌少症的识别和管理迫在眉睫。

目前肌少症暂无明确的致病机制，多种风险因素和机制参与其发生、发展。多项研究[2，6-8]表明，肌少症发生与蛋白质合成和分解途径失衡、免疫功能失调、慢性炎症、肌肉调控因子失调等因素密切相关。肌肉质量下降主要是由于肌纤维数量和肌纤维横截面积减少造成，根据肌细胞代谢方式和收缩速率可将骨骼肌分为慢肌纤维和快肌纤维。在肌少症患者中，两种肌纤维的数量和横截面积均明显下降，其中快肌纤维的数量和横截面积下降更显著，这是肌少症不同于其他累及骨骼肌疾病（如肥胖、恶病质等）的重要病理特征。随着年龄的增加，在骨骼肌组织减少的同时也观察到非收缩成分（包括脂肪及结缔组织）增加，而肌肉组织毛细血管密度降低，提示肌少症患者骨骼肌组织中的细胞微环境发生了恶化。骨骼肌中肌卫星细胞通常是静止的，当骨骼肌受损伤或刺激后可活化和增殖，产生新肌纤维，但骨骼肌组织中肌卫星细胞的数量和肌细胞再生随年龄增长而明显减少，这可能是老年人更容易发生肌少症的原因。对于高危人群如老年人及慢病患者来说，肌少症的早期预防非常重要，筛选并建立肌少症动物模型是研究肌少症的前提和基础。

目前，肌少症造模动物主要有啮齿类动物、果蝇、斑马鱼、秀丽隐杆线虫、犬等。造模方案主要有衰老模型、化学诱导模型、废用模型、基因工程模型，不同造模方法及模型各有优缺点，需要结合实际情况进行选择。

2 肌少症动物模型的评定标准

对肌少症的诊断和评价主要基于肌肉质量、肌肉力量和肌肉功能，因此一般使用上述3 个指标评定肌少症动物模型造模是否成功。动物模型肌肉质量可直接测量，一些研究[9]测量动物后肢的骨骼肌质量（胫骨前肌、比目鱼肌、足底肌、腓肠肌），以此代表所有肌肉的质量。但腓肠肌是受衰老影响最大的肌肉，也是下肢活动中最重要的肌肉，被认为是骨骼肌质量和力量的良好代表，所以肌少症动物模型多以腓肠肌为目标肌进行称重[10-11]，同时腓肠肌也可用于后续各项生化指标的测定。此外，腓肠肌重量与体重之比可作为小鼠肌少症模型的诊断依据，但具体的诊断分界点还有待进一步研究。更重要的是，能够准确测量活鼠肌肉质量的仪器并不常见，这限制了该方法在研究中的应用。活体动物肌肉质量检测与人类相似，可采用CT、MRI、生物电阻抗分析、双能X线吸收测定等方法进行检测。

肌肉力量可通过转棒式疲劳仪及动物前肢抓力进行测定与评价[12]。研究[13]表明，手的握力（前肢握力）与下肢肌肉力量、腿部肌肉横截面积密切相关，所以可通过测量前肢握力来表示小鼠整体肌肉力量。实验前，让小鼠适应握力仪10 min，将小鼠前肢置于握力仪传感横杆上，前肢抓住横杆后，水平向后拖动小鼠尾巴，直到小鼠不能坚持，释放前肢。由握力仪自动记录小鼠在持杆过程中的最大抓力。重复测量多次，取最大值或平均值记录为小鼠前肢抓力。除了前肢的力量，还可以测量小鼠四肢的抓力作为肌肉力量的评定指标。

肌少症患者肌肉功能常以行走6 或4 m的速度来评估[14]，动物的肌肉功能也可用测量步速的方式来评定。转棒式疲劳仪可间接反映小鼠的行走速度，将小鼠放在转棒上，调节转棒的转速，记录小鼠落下时的转速。有研究[15]认为，这种方法并不局限于测量最终转速，还可用来测量在适当转速范围内下落的小鼠数量，以反映小鼠的肌肉功能。但目前肌少症动物模型评定的相关研究仍较少，其评定方式、标准和可行性还需进一步探讨。

3 大小鼠肌少症模型建立

大小鼠与人类的衰老过程和基因水平相似，能够在较短时间内模拟人类的衰老过程[16]。且大小鼠基因组转化技术成熟，发达的肌肉骨骼系统和肌肉干细胞并存的特点适用于与年龄相关的肌肉再生下降研究。小鼠价格相对便宜，这使得它们常成为大样本研究选择的动物。大鼠和小鼠因尾巴较长，常用来作为尾悬吊肌少症动物模型的构建材料。大小鼠模型可为肌少症的药物干预和各种运动治疗干预提供初步的研究依据，但人类骨骼肌的组成与大小鼠不同，当将大小鼠模型结果扩展到人类时，需要考虑纤维类型的异质性。

3.1 衰老模型

由于衰老是大多数肌肉骨骼疾病（包括骨关节炎、骨质疏松症和肌肉减少症）的主要危险因素，衰老小鼠模型已广泛用于肌肉减少症的研究。通常使用的小鼠衰老模型有自然衰老、高脂饮食诱导衰老和加速衰老小鼠模型（senaging - accelerated mouse，SAM）。

自然衰老模型：实验小鼠和大鼠寿命一般为24个月，3 月龄的老鼠相当于20 岁的人类，18～24 月龄的老鼠相当于56～69 岁的人类。根据以往的研究[17]，与衰老相关的生物标志物主要在老鼠18 月龄后检测到。18 月龄小鼠的后肢抓力、运动耐力、肌肉体积和肌肉质量明显低于10 周龄小鼠，表明18 月龄小鼠存在肌少症表现[18]。持续观察18 月龄小鼠直至25 月龄，发现与18 月龄的小鼠相比，25 月龄小鼠后肢肌肉含量、日常活动量、肌肉力量均显著降低。研究[16，19]认为，25 月龄自然衰老小鼠是研究肌少症的合理模型。

高脂饮食诱导衰老模型：越来越多研究[20-22]发现，高脂饮食是肌少症的重要危险因素。喂食高脂肪/高蔗糖饮食的小鼠会发生一系列代谢变化，包括肥胖和血糖、血脂异常。在高脂饮食模型中，肌肉组织内炎症反应增强，肌肉干细胞再生能力下降，肌细胞向肌管分化的过程受到破坏。所以高脂饮食模型小鼠肌肉之间的脂肪堆积增多，肌肉衰老萎缩，使骨骼肌力量下降。由于高脂肪饮食可加速肌少症，同时导致肥胖，因此，高脂饮食诱导衰老小鼠模型可成为肌少症肥胖动物模型的理想选择。

SAM模型：由于自然衰老小鼠模型的建立需要较长时间，越来越多的研究者选择复合型方法，以缩短肌少症的建模时间。SAM能够在相对较短的实验时间内了解衰老和骨骼肌衰老的机制。在SAM族群中，8 月龄加速衰老小鼠（senescence accelerated mouse prone 8，SAMP8）在第7 个月时出现肌肉质量峰值，从第8 个月开始观察到腓肠肌的离体收缩力下降，第10 个月肌肉大部分功能参数明显下降，较普通小鼠达到衰老阶段可节省2/3 的时间[13，23]。SAMP8 比正常小鼠更早表现出肌肉衰老的特征（肌肉质量减少、强直收缩和松弛速率降低、Ⅱ型肌肉纤维萎缩），并且比其他SAMP的肌肉衰老更明显[24]。Zhang等[25]研究结果也显示，SAMP8 小鼠肌肉质量、力量和功能都明显下降，且存在肌少症和骨质疏松。同时，SAMP1、SAMP6 和SAMP10 也表现出肌肉衰老特征，被用于肌少症研究。

3.2 化学诱导模型

地塞米松（dexamethasone，DXM）注射法：DXM是一种合成糖皮质激素，具有抗炎、抗过敏和抗休克作用。但长期注射DXM可导致肌肉萎缩、体重增长、心脏脂肪堆积和其他不良反应[26]。研究[27]发现，DXM导致的肌肉萎缩以Ⅱ型肌纤维减少为主，这与衰老引起的肌肉萎缩一致，说明DXM可成功建立肌少症大鼠模型。鲁飞翔等[27]以6～7 月龄小鼠为研究对象，皮下注射DXM 6 周，注射剂量为5 mg/kg时，小鼠肌肉质量和功能均显著降低，认为建模成功。国外学者Aru等[28]在22 月龄雌性大鼠皮下注射DXM 10 d，注射剂量为0.50μg/g，引起大鼠体重及肌肉含量显著下降，同时后肢抓力降低25%（P<0.01），结果判定肌少症模型构建成功。

右旋糖酐硫酸钠 （dextran sulfate sodium，DSS）注射法：给10 周龄雄性小鼠灌服0.75% DSS 14 d后，发现其股四头肌和腓肠肌的肌纤维减少，肌肉损伤的标志物即肌酸激酶略有增加，结果支持成功诱导肌少症模型[29]。DSS不仅可诱导急性结肠炎，而且可导致小鼠肌肉严重损失，是诱发炎症相关肌少症的合适模型。

D-半乳糖注射法：通过皮下注射D-半乳糖建立衰老模型的原理是衰老代谢理论，即通过影响机体细胞的功能代谢（氧化应激、炎症等），降低与之相关的一些重要酶的功能，诱导实验动物出现类似自然衰老的变化[30]。Yanar等[31]将5月龄D-半乳糖肌少症雄性大鼠模型肌肉代谢指标与24月龄大鼠肌肉相关指标同步比较，发现两组大鼠的肌肉细胞均会发生氧化应激，这种变化在大鼠比目鱼肌中最明显[23]，结果表明，D-半乳糖可诱导慢性炎症和氧化应激，导致啮齿类动物加速衰老。D-半乳糖与DXM类似，可以皮下注射，不仅能够减少对动物的刺激，避免不必要的死亡，而且能够逐渐增加衰老程度，更适合研究老年人的自然衰老过程[32]。

3.3 废用模型

尾悬吊法：尾悬吊的原理是破坏多种细胞代谢过程，如诱导氧化失衡、线粒体功能障碍、细胞间相互作用和异常蛋白质合成/降解，从而促进肌肉萎缩[33]。尾悬吊能够模拟失重状态，减少骨骼肌的使用，促进肌肉萎缩。目前广泛用于研究由肌肉消瘦疾病、卧床休息和制动等各种情况引起的肌肉萎缩。尾悬吊法一般采用大鼠或小鼠作为实验动物，将动物的后肢抬高，避免后肢负重。确保老鼠能够自由转体及活动，供给足够水分及食物，通常在14 d左右即可建模成功，其优势在于成模率及一致性好，劣势在于操作相对复杂，动物死亡率高。悬吊小鼠尾部使其机体与笼底夹角为30°，悬吊10 d后与对照组小鼠相比，吊尾组小鼠比目鱼肌代谢显著异常，表现出明显的肌肉萎缩[34]，证明成功建立肌少症模型。

神经截断法：采用手术操作、物理干预、化学药物等，对实验动物的周围神经干、神经丛根部和脊髓进行人工破坏或阻滞，影响神经支配肌肉，导致肌肉功能障碍而构成肌少症。这种造模方法用于模拟肢体运动障碍造成的肌肉萎缩[23]。大鼠右侧坐骨神经横断术后第14 d，Huang等[35]观察到实验组大鼠腓肠肌相对重量及肌纤维横截面积均显著下降，证实已有肌少症的表现。Tamaki等[36]分离出大鼠坐骨神经后进行冰冻处理，发现实验组大鼠比目鱼肌、胫前肌和趾长伸肌的重量和肌纤维横截面积显著下降，造模成功。

关节固定法：关节部位固定的肌肉因为废用而引起肌肉萎缩，该模型用于模拟关节融合术、关节病变或单纯骨折后需要打石膏的情况[37]。以最大屈曲度将小鼠髋关节、膝关节和踝关节固定在背部皮肤，固定1～3周后，便可出现废用性萎缩。有研究[38]将成年大鼠的后肢固定，10 d后大鼠比目鱼肌的肌肉质量和功能均显著降低，证实造模成功。

3.4 基因工程小鼠模型

Sod1（-/-）/Sod1KO小鼠：研究[39]表明，铜与锌超氧化物歧化酶可逆转骨骼肌中自由基的产生，防止肌肉萎缩。在Sod1（-/-）/Sod1KO小鼠模型中，幼年小鼠因缺失铜与锌超氧化物歧化酶导致神经肌肉连接中断，运动神经传递受损，肌肉萎缩加速[40]。目前Sod1（-/-）/Sod1KO小鼠已被用于肌肉萎缩和肌少症的各种研究[24，41]。

线粒体DNA（mtDNA）聚合酶γ缺陷小鼠：mtDNA突变的积累是导致线粒体功能障碍和寿命缩短的原因。研究[42]发现，mtDNA聚合酶γ缺陷小鼠表现出mtDNA突变率增加、线粒体功能障碍和早衰，如体重减轻、皮下脂肪减少、骨质疏松和肌肉减少，适合用于模拟与增龄相关的肌少症动物模型。

天冬酰胺合成酶结构域1（asparagine synthetase domain containing 1，ASNSD1）缺乏小鼠：ASNSD1基因发生突变的小鼠会出现进行性退行性肌病，导致肌肉减少和骨骼肌变性。Vogel等[43]研究发现，14 周龄ASNSD1小鼠的肌肉群出现广泛的退行性变化，37 周龄的ASNSD1小鼠出现肌内和间质脂肪变性、肌肉明显减少，表现为严重的肌无力，可作为肌少症的造模方法。

4 果蝇模型建立

果蝇肌肉在体重中占很大比例，肌肉功能可通过测量其飞行和攀爬能力来评定。果蝇缺乏肌肉干细胞，不受肌肉再生的混杂影响，这对研究肌肉衰老过程存在优势。同时果蝇生命周期短，基因转化技术非常成熟，是一种高效且经济的肌少症模型[24]。

肌强直性营养不良（myotonic dystrophy，DM）果蝇：DM是由mRNA非编码区CUG重复引起的常染色体显性疾病，DM患者的临床特征包括肌强直、肌肉萎缩、心脏传导障碍等。有研究[44]在果蝇中构建了一个由480 个CUG重复序列组成的非编码mRNA，该mRNA转录积累表达导致果蝇肌肉萎缩和退化，生成了第一个DM的果蝇模型。

dPOMT1/dPOMT2突变果蝇：蛋白-O-甘露糖基转移酶1 （protein O-mannosyltransferase 1，POMT1）缺陷会导致先天性肌营养不良。dPOMT1、dPOMT2是果蝇POMT1同源基因，dPOMT1是在该基因的第一个外显子中插入等位基因创建的，可导致胚胎肌肉发育缺陷。dPOMT1幼虫表现为腹部肌肉缺损或瘦弱，dPOMT1成虫表现为腿部和飞行肌肉缺陷。在显微镜下观察到dPOMT2突变果蝇肌肉超微结构缺陷、肌肉排列紊乱、z线不规则、纤维散乱、肌浆网肿胀等一系列肌肉病理状态[6]。dPOMT1/dPOMT2突变果蝇符合肌少症的表现，可作为研究肌少症的模型。

基因敲除：果蝇体内有许多与人类肌营养不良蛋白同源的异构体，人体内的肌营养不良蛋白Dp427、Dp260、Dp140、Dp116、DP71 等亚型分别与果蝇体内的DLP1、DLP2、DLP3、Dp205 和Dp186 相似[45]。在敲除肌营养不良蛋白亚型基因C端后，果蝇幼虫期会出现严重肌肉变性，肌肉断裂或缺失，肌纤维与肌腱细胞附着部位分离[46]。敲除果蝇肌营养不良蛋白Dp117 亚型后，在电镜下显示，果蝇肌肉断裂、肌丝组织紊乱、肌浆网膨胀。因此，基因敲除果蝇可作为研究肌少症的模型。

5 斑马鱼模型的建立

斑马鱼骨骼肌在分子和组织学上与人类骨骼肌高度相似。且斑马鱼骨骼肌快肌纤维和慢肌纤维组织容易分离，适合研究其在肌肉减少症中的异质性[47]。研究[48]表明，肌少症斑马鱼的骨骼肌横截面积降低、蛋白质合成降解失衡、线粒体功能障碍等，与人骨骼肌衰老过程类似。21 月龄的斑马鱼大致相当于50 岁的人类，可用于模拟肌少症[49]。

5.1 化学诱导模型

DXM：斑马鱼与啮齿类动物一样可使用DXM诱导建立肌少症模型。将斑马鱼浸泡在含DXM的水中，斑马鱼可通过皮肤和鳃吸收DXM，从而诱导斑马鱼骨骼肌萎缩[50]。

慢性酒精模型：哺乳动物长时间高剂量饮酒会导致肌肉萎缩，乙醇诱导骨骼肌萎缩的机制尚不完全清楚，其中一个原因是乙醇会增加泛素连接酶的表达，从而导致肌肉萎缩[24]。与哺乳动物类似，长期乙醇暴露（在普通斑马鱼水中添加0.5%的乙醇，持续8 周）可导致斑马鱼肌肉萎缩[51-52]。因此，慢性酒精模型也是斑马鱼肌少症建模的一种理想方法。

5.2 基因工程模型

肌管蛋白相关蛋白12（the myotubular in related protein 12，MTMR12）敲除斑马鱼：研究[53]发现，MTMR12与肌小管蛋白结合可为肌小管蛋白提供稳定性，斑马鱼中MTMR12基因敲除会导致骨骼肌缺陷和运动功能受损。MTMR12基因敲除斑马鱼的病理变化与X连锁肌管肌病类似，电镜下表现为中心形核、三联征紊乱和肌纤维萎缩，可进行肌少症建模。

Sapje斑马鱼：研究[54-55]发现，Sapje斑马鱼携带一种营养不良蛋白突变基因，形态学分析显示其肌肉纤维有明显的病理变化，如肌腱连接处脱离、肌肉广泛变性伴纤维化、炎症反应等，使Sapje斑马鱼从胚胎期开始便出现肌肉逐渐退化，可用于肌少症建模。

肌球蛋白结合蛋白C1 （myosin binding protein-C，MYBPC1）基因突变斑马鱼：MYBPC1 是一种骨骼肌蛋白，主要在慢肌纤维中表达。人类MYBPC1基因突变会导致远端关节挛缩（先天性挛缩综合征）进行性发展。斑马鱼MYBPC1基因下调表现出异常的发育表型，如运动功能受损、运动活性下降、肌节数量减少，以及轻微的身体弯曲和总体生存率受损[56]，即出现肌少症的表现，因此可选择MYBPC1基因突变斑马鱼进行造模。

N471突变斑马鱼：在人类婴儿中，星云蛋白基因的N471突变会导致肌肉无力和运动功能下降。具有相同突变的星云蛋白斑马鱼遗传模型表现出与人类相似的组织学特征，包括肌肉力量下降和肌肉纤维组织改变[57]。因此N471突变斑马鱼模型可作为肌少症的模型。

6 其他动物肌少症模型建立

6.1 秀丽隐杆线虫

秀丽隐杆线虫的寿命短暂（平均18～21 d），便于进行衰老研究。线虫靠体壁肌肉运动，肌肉功能也容易监测，是研究肌节组装、维持、调控和肌肉衰老机制等的理想模型[46]。

肌营养不良蛋白同源物（dystrophin homologue 1，dys1）/ 肌源性转录因子双突变：肌源性转录因子在肌肉分化过程中能调节伴侣蛋白表达，敲除该转录因子后，秀丽隐杆线虫会出现肌肉组织严重缺陷和运动功能下降[58]。dys1/ 肌源性转录因子双突变秀丽隐杆线虫模型携带抗营养不良蛋白基因和肌肉分化基因，表现出运动损伤和肌肉退化[59-60]，可作为肌少症的理想模型。

肌小管蛋白相关磷酸酶3（myotubularin-related phosphatase 3，ceMTM3）基因敲除：研究[61]表明，秀丽隐杆线虫ceMTM3敲除后，肌动蛋白纤维结构会出现损伤导致肌纤维不稳定，与野生组相比，ceMTM3基因敲除组线虫体型更小。因此，ceMTM3基因敲除秀丽隐杆线虫对于肌纤维的研究具有一定意义，但不能作为肌少症的模型。

6.2 犬

自发选择性剪接：有研究[61]表明，在威尔士柯基犬和拉布拉多寻回犬中，利用基因组编辑技术删除插入的重复元件后，可以产生肌营养不良蛋白，但未评估模型是否可用于肌少症建模。

基因工程：一些犬肌营养不良模型的外显子2 和20之间存在突变，其中包括比格犬的内含子6点突变[62]，威尔士科尔基犬内含子13 重复元件插入[63]，拉布拉多猎犬肌营养不良犬内含子19 重复元件插入[64]，以及边境牧羊犬肌营养不良犬外显子20 单个核苷酸缺失[65]，都可以导致犬肌营养不良，该模型可用于肌营养不良相关的肌少症研究。

综上所述，现有肌少症模型方案包括衰老模型、废用模型、化学诱导模型和基因工程模型等，每种方案各有利弊，需要结合实际情况加以选择。肌少症动物模型种类繁多，但很多研究者并没有评估建模后的动物模型是否符合肌少症的标准。未成功诱导的肌少症模型很可能是错误的，甚至可能误导后续研究，所以本研究总结了常用肌少症动物模型的评估方法，以期为今后的研究提供参考。目前，尚无完整显示人类肌少症临床及病理特征的动物模型，相信随着医学技术的发展，可以构建更多适合肌少症的动物模型。