CRISPR-Cas13a检测在肺结核诊断中的价值

张治国 尚媛媛 张旭霞 刘荣梅 马丽萍 秦林 孔忠顺 任卫聪

目前,临床上诊断肺结核的方法仍是影像学技术及细菌学检测,但痰涂片抗酸杆菌染色法简单、快速、经济,但敏感性差;痰菌培养周期长,不利于临床结核病的诊断和治疗[1]。随着结核病实验室诊断技术不断进步,分子生物学检测技术以其独特的优势正迅猛发展且逐步取代传统的结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis,MTB)检测技术[2]。GeneXpert MTB/RIF(简称“Xpert”)是世界卫生组织推荐用于结核病检测的分子诊断平台,与传统检测方法比较,其检测的敏感度和特异度均明显升高[3]。然而,其检测成本是涂片镜检的20多倍,阻碍了在低收入国家的大规模应用。因此,需要更多经济有效的分子生物学技术来提高结核病的检出率。

成簇的规律间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)和相关蛋白(Cas)系统由于其高度的灵活性、敏感性和特异性而在临床诊断中得到越来越多的应用[4]。通过将目标核酸序列转化为荧光信号,可以有效地检测病原微生物。例如,基于 CRISPR/Cas12a 的平台已用于检测结核病和其他传染病[5-9]。此外,RNA引导的靶向RNA的核酸内切酶 Cas13a是另一种在分子诊断方面具有巨大潜力的CRISPR-Cas系统。有研究人员将Cas13a的侧链RNase 切割与分子扩增相结合,建立了基于 CRISPR-Cas13a 的平台,敏感度达单拷贝、特异度达单碱基的高敏感性、高特异性病毒检测方法[10-11]。本研究旨在利用CRISPR-Cas13a检测方法对临床样本进行检测,评价其对肺结核的诊断效能。

材料和方法

一、标本来源

采用回顾性研究方法,收集首都医科大学附属北京胸科医院2022年9月至2022年12月收治住院的102例经Xpert检测确诊的肺结核患者的支气管肺泡灌洗液标本,作为结核病组;收集同期收治入院的100例非结核病患者(包括肺癌,细菌性肺炎,支气管扩张,慢性阻塞性肺疾病)的支气管肺泡灌洗液标本,作为非结核病组。所有患者的支气管肺泡灌洗液标本均进行涂片抗酸杆菌染色镜检、分枝杆菌培养、Xpert检测及CRISPR-Cas13a检测。

二、仪器与试剂

T7 RNA聚合酶(T7 RNA Polymerase Mix,M0255A,美国New England Biolabs公司)、MightyAmpTMDNA Polymerase Ver.3 [宝日医生物技术(北京)有限公司]、报告RNA试剂盒(RNase Alert v2,30315288,美国Invitrogen公司)、RNA纯化磁珠[FAgencourt RNA Clean XP,贝克曼库尔特商贸(中国)有限公司]、鼠RNA酶抑制剂(美国New England Biolabs公司),GeneXpert MTB/RIF反应盒及样本处理液(美国Cepheid公司),OADC(美国BD公司),Casl3a蛋白由军事医学研究院微生物流行病研究所赠与;ABI7500荧光定量PCR仪(美国ABI公司)、Axygen Maxygene-Ⅱ梯度PCR仪(广州科适特科学仪器有限公司)、BACTEC MGIT 960 全自动分析仪(美国BD公司)。

三、检测方法

(一)涂片抗酸杆菌染色镜检

采用直接涂片抗酸杆菌染色镜检法,具体操作过程按照《痰涂片镜检标准化操作及质量保证手册》的要求进行。

(二)分枝杆菌培养

将1～2 ml支气管灌洗液用2% N-乙酰-L-半胱氨酸-NaOH 进行消化处理。在MGIT液体培养管中加入杂菌抑制剂(PANTA)和营养添加剂(OADC)混合添加剂0.8 ml。将0.5 ml处理后的样本加入到MGIT培养管并将培养管放入BACTEC MGIT 960分枝杆菌培养系统中培养。通过分析荧光强度判断是否有MTB生长,一般快速 7～14 d培养阳性,培养周期设定为42 d。

(三)Xpert检测

按照GeneXpert MTB/RIF操作说明书进行。取2 ml支气管灌洗液标本与1～2倍体积的样本处理液混合,在涡旋振荡器上振荡15～30 s,室温放置15 min。用专用吸管把处理后的样本缓慢加入Cartridge 反应盒内,然后将反应盒放置到检测模块中进行检测,2 h后系统自动显示MTB的检测结果。MTB 阳性的诊断标准为5个探针中至少2个探针循环阈值(Ct值)≤38,并可按Ct值对样本中MTB进行半定量分析,Ct值<16为高荷菌量,16～22为中等荷菌量,22～28为低荷菌量,>28为极低荷菌量。

(四)CRISPR-Cas13a检测

1.crRNA的设计、筛选和制备：参考文献[10],以MTB特异性重复序列IS1081为检测的靶序列,在序列的不同位置分别设计crDNA,筛选荧光信号最强,敏感度好、特异度高的crRNA,具体crRNA序列如下：GGGGAUUUAGACUACCCCAAAA-ACGAAGGGGACUAAAACCCCGCCCGCUCGA-UGCCGGCCCGUAUAC,扩增需要的上游引物(5′～3′)：TAATACGACTCACTATAGGGGAT-TTAGACTACCCCAA,下游引物(5′～3′)：GTATACGGGCCGGCATCGAG。

2.样本的核酸提取：收集入组患者的支气管灌洗液2 ml,采用煮沸法提取基因组DNA并保存到-80 ℃备用。

3.PCR扩增靶基因序列：提取临床样本DNA,以ddH2O为阴性对照管,以卡介苗基因组为阳性对照组,进行靶基因的扩增。扩增引物序列如下：TB_IS1081F：5′-ACAAAGCTTTCCAAGTCGCA-3′;TB_IS1081_R1：5′-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGCCCAGGATCTCTCGGTAGC-3′。

4.荧光检测：将上一步反应的产物2 μl进行检测,体系见表1。体系放入荧光定量PCR仪,FAM通道检测荧光信号变化。设置37 ℃反应30 s,37 ℃ 反应30 s(收集荧光),共30个循环。

表1 CRISPR 检测体系

5.CRISPR 结果判定：阴性对照基本无荧光信号的变化,复孔检测结果基本一致;阳性对照荧光信号明显升高,满足以上两条说明实验结果可信。阳性结果：检测结果以样品荧光信号与阴性对照具有明显差异为阳性。阴性结果：样品荧光信号无明显升高,与阴性对照无明显差异。

四、统计学处理

采用SPSS 22.0软件进行数据分析。计数资料以“频数和百分率(%)”描述,组间差异的比较采用χ2检验和Fisher精确概率法,以P<0.05为差异有统计学意义。采用GraphPad Prism 5.0软件绘制数据韦恩图。以Xpert检测结果作为参考,评价CRISPR-Cas13a诊断结核病的效能,各指标计算公式如下：敏感度=真阳性数/(真阳性数+假阴性数)×100%;特异度=真阴性数/(真阴性数+假阳性数)×100%;阳性预测值=真阳性数/(真阳性数+假阳性数)×100%;阴性预测值=真阴性数/(真阴性数+假阴性数)×100%;准确度=(真阳性数+真阴性数)/(真阳性数+真阴性数+假阴性数+假阳性数)×100%。

结 果

一、检测结果

结核病组102份标本中,CRISPR-Cas13a检测阳性为99份(97.1%),涂片阳性40份(39.2%),培养阳性68份(66.7%)。CRISPR-Cas13a-MTB检测阳性率明显高于涂片和培养法,差异有统计学意义(涂片：χ2=58.141,P<0.001;培养：χ2=30.250,P<0.001)。与传统检测方法相比,CRISPR-Cas13a比涂片和培养法多检测出28份标本(图1)。非结核病组100份标本中,CRISPR-Cas13a检测阳性4份(4.0%),明显低于检测结核病组标本的阳性率,差异有统计学意义(χ2=174.982,P<0.001)。

图1 三种方法检测102份肺结核患者支气管肺泡灌洗液标本的韦恩图

二、检测效能

结核病组102份标本,Xpert检测阳性率为100%;非结核病组100份标本,Xpert检测阴性率为100%。以Xpert检测结果作为参照,CRISPR-Cas13a检测肺结核的敏感度为97.1%(99/102)、特异度为96.0%(96/100),准确度为96.5%(195/202),阳性预测值为96.1%(99/103),阴性预测值为97.0%(96/99)。

讨 论

目前,CRISPR系统已被开发为体外核酸检测的高敏感度诊断工具[10,12-13]。CRISPR系统在病毒、真菌、细菌等病原微生物的检测中得到了广泛应用。Gootenberg等[10]建立了敏感度可达到单拷贝的核酸检测技术SHERLOCK,并将之应用于生物样本(血液或尿液)中多种病毒的检测。Qin等[14]报告CRISPR-Cas13a自动检测埃博拉病毒RNA的POC系统,纯化的埃博拉病毒RNA的检测达到20 PFU/ml;Li等[15]把CRISPR-Cas13a系统应用到真菌的核酸检测中,其检测的敏感度和特异度分别为100.0%和91.7%。Ai等[16]利用CRISPR-Cas12a系统建立了对MTB的快速检测方法,为肺结核高敏感度的诊断提供了巨大潜力,其中,Casl2a可将识别的靶序列为双链DNA,并可切割单链DNA;Casl3a与Casl2a不同,它能够在切割靶RNA之后呈现出强大的,对非特异的 RNA 序列的“平行切割”效应[17],起到信号放大的效应,可以提高对靶基因的检出率。CRISPR-Casl3a系统在埃博拉病毒[14]、乙型肝炎病毒[18]、新型冠状病毒[19]等检测中具有较高的敏感度,说明Casl3a具有广泛应用于科学和临床医学领域的潜力。

本研究对102例肺结核患者和100例非结核病患者的支气管肺泡灌洗液标本进行CRISPR-Cas13a检测,以Xpert检测结果为参照,其敏感度为97.1%。Ai等[16]采用Cas12a对结核病患者进行MTB的检测,其检测敏感度为79%,高于Xpert检测(敏感度为66%)和培养(敏感度为33%),两种检测方法的敏感度不一样,原因之一可能是检测的标本类型不同,原因之二可能是CRISPR系统中所用的Cas蛋白不同,原因之三可能是检测的靶基因序列不同。本文采用的检测方法与Ai等[16]利用Cas12a建立的MTB检测方法对样本量的需求是一致的,需要的样本量少,仅需要500 μl的体液即可完成检测,更适合儿童结核病和结核性脑膜炎的诊断。另外,此方法在低细菌载量的患者诊断中具有优势,但其诊断的效能需要在不同类型标本中,包括标本量较少和含菌量较低的体液中进一步验证,如肺外结核和结核性胸膜炎等。

CRISPR-Cas13a应用于临床时,其操作过程简单,通过临床常用的、稳定PCR扩增和通用的“报告RNA”检测即可完成。仅需要1台荧光PCR仪,在2 h之内就能完成全部检测。此外,检测成本低于2美元,这与涂片显微镜的成本相当,但诊断准确性明显提高。因此,此方法在资源有限情况下,为结核病的诊断提供了一种有竞争力的替代方案。

本诊断方法也具有一定的局限性。首先,由于其检测的是菌体DNA,不能判断患者体内是否有活菌存在,因此,无法满足结核病患者随访的需求。其次,本研究纳入样本数量有限,需要扩大样本量进一步验证其诊断的准确性。再次,通过对基因组多拷贝序列IS1081作为检测靶标,CRISPR-Cas13a表现出较高的敏感度,但是其特异度有待进一步验证,尤其是在感染非结核分枝杆菌的患者中。最后,本研究使用的核酸采用简单法提取,其提取效率相较自动提取法偏低,可能影响其检测的敏感度。因此,建立基于CRISPR-Cas13a的即时诊断技术是未来发展的重要方向。

综上所述,本研究系统评价了CRISPR-Cas13a在支气管肺泡灌洗液中检测MTB的效能,研究结果表明与传统方法相比,其具有敏感度高和特异度高的优势,且操作方法便捷,有广阔的应用前景。未来亟需纳入大样本量开展临床评价,为推广基于CRISPR-Cas13a的MTB检测系统提供更可靠依据。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

作者贡献张治国：酝酿和设计实验及实施研究;尚媛媛和秦林：实施研究;张旭霞、刘荣梅和马丽萍：采集数据;孔忠顺：分析及解释数据;任卫聪：分析及解释数据、起草文章、统计分析。