长链非编码RNA抗结核分枝杆菌感染功能的研究进展

董静 史雨婷 潘丽萍 张宗德

深入了解结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis,MTB)感染后宿主的免疫应答机制对寻找结核病的免疫治疗靶标具有重要意义。随着基因图谱研究的深入及高通量检测深度和广度的增加,越来越多的研究人员开始关注非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA)介导的宿主免疫应答。其中,长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)约占ncRNA的80%。既往研究提示,lncRNA在疾病发生发展过程中发挥重要的生物学功能[1-2]。笔者对既往lncRNA分子参与MTB感染和结核病发病后宿主免疫调控的研究进行综述,以期为结核病的免疫治疗提供新的思路。

lncRNA的定义和分类

lncRNA是一种由超过200个核苷酸组成的不具备蛋白质编码能力的RNA[3-4],参与了包括结核病在内的多种疾病的发生发展。根据lncRNA与蛋白质编码区(sequence coding for aminoacids in protein,CDS)的相对位置和功能,通常将lncRNA分为5类：(1)正义链lncRNA：lncRNA与编码基因的一个或多个外显子重叠,且转录方向相同;(2)反义链lncRNA：lncRNA与编码基因转录方向相反;(3)基因内lncRNA：由基因的内含子产生,既可以是独立转录,也可以是前体mRNA(pre-mRNA)加工的副产物;(4)双向lncRNA：lncRNA与蛋白质编码基因共用相同的启动子,但转录方向相反;(5)基因间lncRNA：由位于蛋白质编码基因之间的序列独立转录的lncRNA[3,5-6]。

与大多数mRNA相似,lncRNA在5′处有一个特殊的帽子结构,在3′处有聚腺苷酸[7-8]。最早研究者认为其序列中没有开放阅读框(open reading frame,ORF);但随着研究的深入,发现一些lncRNA 具有小型ORF,可编码具有特殊生物学功能的短肽[9-10]。与具有编码能力的mRNA相比,lncRNA的表达水平通常较低,但在不同组织中特异性较高。近年来,研究人员广泛开展了对各类疾病的临床研究队列,进行lncRNA疾病生物标志物鉴定的相关研究。随着研究的深入,越来越多的研究者发现lncRNA 参与包括细胞增殖、分化、凋亡在内的多种生物学过程[3, 11]。

lncRNA的生物学功能

随着生物信息学分析和分子生物学实验技术的发展,已有更多的方法从不同维度进行RNA的研究,但人们对各种lncRNA发挥调控功能的机制仍知之甚少[12-14]。结核病研究领域现有研究多为验证结核病患者中特异性异常表达的lncRNA,对其发病机制的相关研究不足。总结既往其他疾病方面的研究发现,lncRNA发挥调控作用和定位有一定的联系,其调控功能主要是通过与DNA、RNA和蛋白质在内的生物大分子相互作用,转录为生物活性因子或短肽片段,在转录、转录后和翻译阶段发挥作用。此外,lncRNA的功能还与细胞的类型和细胞发育分化阶段的特异性刺激有关[15-16]。

一、转录调控

lncRNA在细胞核中可与DNA产生三螺旋体或R环等复杂结构来招募蛋白质复合物,从而影响染色质转录[17]。既往研究显示,lncRNA-DNA三螺旋体可以通过甲基化介导基因沉默[18],未来进一步研究可能会发现更多的lncRNA-DNA复合物作为分子信标来招募蛋白质,最终形成相互作用网络。此外,定位于细胞核内的lncRNA也可通过影响染色质调控蛋白或与蛋白质相互作用参与基因转录,从而抑制特定基因组位点或增强蛋白的功能[19]。除了与生物大分子相互作用,lncRNA也可作为转录因子或增强子在细胞的转录网络中发挥作用[1]。

二、转录后调控

lncRNA作为微RNA(miRNA)海绵进行转录后调控是目前主要发现的作用模式,既往一些研究均阐明了lncRNA-miRNA的调控关系。此外,一个lncRNA可以通过不同的靶miRNA来调控不同的通路,如lncRNA肺癌相关转录本1在胆囊癌和肾癌中,分别靶向miR-363-3p和miR-200s发挥调控作用[20-21]。lncRNA除了与miRNA相互作用外,还可以参与和调控mRNA的生成。既往研究指出,lncRNA可以与同源性较高的mRNA进行结合,从而竞争性地减少miRNA与其3′UTR的结合;此外还可以通过参与pre-mRNA剪接、调控mRNA的稳定性或使mRNA降解来调控基因表达[3]。

三、翻译调控及其他

研究显示,lncRNA发挥生物学功能除了参与转录及转录后调控外,还可以激活或抑制翻译水平。2015年,关于lncRNA的功能研究出现突破性进展,即发现lncRNA以短ORF编码特定多肽发挥调控作用[22],并且在多种癌症中已有相关报道。研究显示,lncRNA HOXB-AS3编码的短肽可以改善结肠癌患者的预后,lncRNA 00908编码的短肽可以调控STAT3/血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)通路,从而抑制乳腺癌的发展[23-24]。但是,lncRNA编码的短肽在MTB感染免疫中的作用尚未见报道,一方面由于结核病领域关于lncRNA的研究起步较晚;另一方面由于既往ORF预测算法将大小临界值设为300 nt,即翻译100个氨基酸残基,而lncRNA中的ORF较短,导致lncRNA基因注释中存在大量被忽视的短肽,未来可能通过计算机预测和实验结合的方式,阐明lncRNA 编码的短肽在MTB感染免疫中发挥的调控作用[25-27]。

lncRNA在MTB感染免疫中的研究进展

一、lncRNA在宿主固有免疫应答中的研究进展

在MTB感染过程中,宿主和病原体接触后激活非特异性的固有免疫反应,动员包括巨噬细胞、自然杀伤细胞(natural killer cell,NK)和中性粒细胞在内的固有免疫细胞发挥吞噬作用,调节炎症反应,最终杀伤MTB或使MTB滞留。

(一)lncRNA在巨噬细胞介导的免疫应答中的研究进展

巨噬细胞是宿主抵抗MTB感染的第一道防线。近年来,研究者除了重点关注巨噬细胞在MTB感染后lncRNA表达谱的变化外,还力图解析特异性lncRNA的功能及作用机制。如早在2018年就有研究发现lncRNA NEAT1具有抑制MTB增殖的作用[28]。

1.lncRNA通过内源竞争RNA(competing endogenous RNAs,ceRNA)机制发挥调控作用：进一步探究lncRNA参与宿主免疫调控的具体途径是近年来的主要研究方向。lncRNA通常通过靶基因或靶蛋白发挥调控作用,在结核病领域中研究较多的靶基因类型主要是miRNA。研究发现,MTB标准株H37Rv感染会导致巨噬细胞中lncRNA GAS5表达下调,并通过靶向miR-18a-5p增强巨噬细胞活力[29];而lncRNA NORAD和lncRNA SNHG16在感染后表达水平增加,并负向调控其各自的靶基因miR-618和miR-140-5p[30-31]。以上研究均提示,lncRNA可以靶向miRNA实现对巨噬细胞增殖和炎症反应的调控,从而影响MTB感染的结局。众所周知,miRNA常通过与靶mRNA的3′-UTR不完全互补配对结合抑制下游基因的表达,而包括lncRNA在内的ncRNA可以与miRNA结合,从而实现基因表达。这种转录后调控机制被称为ceRNA调控,其在生物体的生理和病理过程中扮演着重要角色[1,32]。既往研究提示,细胞自噬和凋亡可以促进MTB吞噬体的酸化和成熟,清除MTB赖以生存的生理环境并且抑制MTB在巨噬细胞中的生存,是巨噬细胞抵抗MTB感染的重要手段[33],而lncRNA也可以通过靶向miRNA调控巨噬细胞自噬/凋亡从而影响MTB生长。研究发现,lncRNA PCED1B-AS1作为miRNA海绵结合miR-155而上调FOXO3/Rheb[33],参与MTB感染后的固有免疫反应。此外,另一项研究结果显示,卡介苗(BCG)感染后高表达的lncRNA MIAT也可以作为miR-665的海绵靶向ULK1,最终调控巨噬细胞的自噬和凋亡,在抗结核免疫和抗菌过程中发挥调控作用[34]。在一项负压治疗结核病的研究中,发现负压治疗能够缓解MTB感染导致的lncRNA-XIST表达水平增加,进而上调miR-125b-5,活化NF-κB通路,促进巨噬细胞M1极化和炎性因子的释放[35]。这项研究提示,lncRNA有望作为辅助治疗结核病的靶标,为结核病治疗新策略提供了新的方向和可能性;而随着RNA测序和ceRNA测序等高通量测序技术的不断完善和发展,已经积累了大量的转录组数据,也为系统性地认识与研究ceRNA调控网络在疾病发生和发展过程中的功能提供了潜在的可能。

2.lncRNA通过与RNA结合蛋白相互作用发挥调控作用：lncRNA除了靶向miRNA参与基因表达调控外,还可以通过与RNA结合蛋白(RNA-binding proteins,RBP)相互作用,在固有免疫中发挥功能。RBP是一类可以与RNA特殊结构域结合的蛋白质的总称,在RNA合成、修饰、转运等方面发挥重要作用[36]。近年来,在结核病研究领域也逐渐发现lncRNA可与靶蛋白结合共同调控免疫反应的作用方式。转录因子是一类可以与基因启动子区域DNA序列结合来控制基因转录的蛋白,是真核细胞内多种信号通路的关键调节因子。既往在其他疾病的研究也提示lncRNA可以与转录因子相互作用实现基因表达调控,同时,RNA pull down实验的不断优化及质谱鉴定的发展为寻找包括转录因子在内的RNA结合蛋白提供了保障。2022年的一项研究证实,转录因子FUBP3可以作为RNA结合蛋白,与lncRNA EST12相互作用抑制白细胞介素(IL)-1β、IL-6等细胞因子的表达,促进MTB的增殖[37]。Gcanga等[38]证实lncRNA MIR99AHG可与RNA结合蛋白hnRNPA2/B1相互作用,促进巨噬细胞极化并激活宿主固有免疫应答。此外,在其他疾病领域的研究结果提示上述lncRNA MIR99AHG除了与蛋白结合外,还可以与miRNA相互作用共同调控基因功能[39]。这种同一个lncRNA 可以与多种大分子相互作用而形成庞大的调控网络的现象,进一步体现了lncRNA的功能与基因表达调控网络的复杂性。

3.lncRNA通过启动信号通路发挥调控作用：lncRNA可以启动不同信号通路参与宿主固有免疫。研究发现,lncRNA Cox2可能通过活化NF-κB和Stat3来调节炎症反应[40],而lncRNA EPS在MTB感染后表达下调,同时通过JNK/MAPK信号通路抑制巨噬细胞凋亡并促进其自噬[41]。这提示某些lncRNA在发挥功能时,可能同时出现抑制巨噬细胞凋亡并促进其自噬(或相反)的调控。这可能是由于lncRNA具有多个功能区域或形成不同的二级和三级结构,能够与不同功能的蛋白质或核酸作用形成新的结合位点,一方面实现了基因表达的精准调控,另一方面可以平衡免疫反应造成的细胞损伤,同时为lncRNA通过不同途径调控细胞免疫反应提供了理论基础[42]。

现阶段普遍认为,MTB感染后,巨噬细胞凋亡、自噬及炎症因子释放等在宿主抗结核免疫或MTB逃避免疫应答中具有重要的意义;而深入研究lncRNA通过不同途径参与免疫反应有利于进一步全面了解调控网络,将为寻找结核病免疫治疗新靶点提供思路。

(二)lncRNA在树突状细胞介导的免疫应答中的研究进展

除巨噬细胞外,lncRNA可以调控其他类固有免疫细胞参与抗结核免疫应答。虽然现阶段在结核病领域中尚未发现相关研究,但是在炎症和免疫领域有一定的研究。既往研究显示,lncRNA Dpf3可抑制缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)的活性从而减弱CC趋化因子受体7(CC-chemokine receptor 7,CCR7)介导的树突状细胞的迁移;lncRNA树突状细胞可以通过调控树突状细胞分化来间接参与免疫反应[43-44]。这些研究结果提示,lncRNA对于MTB感染后宿主调控树突状细胞参与免疫应答反应具有可探索的潜力。

(三)lncRNA在NK细胞介导的免疫应答中的研究进展

与树突状细胞类似,既往有研究证实lncRNA参与NK细胞释放细胞因子及激活T细胞介导的适应性免疫应答从而杀伤受到外源性感染的细胞[45-46]。如lncRNA 49a正向调控NK细胞CD49a表达,抑制细胞因子γ-干扰素(IFN-γ)的表达从而参与细胞的免疫功能调控[47]。但到目前为止,lncRNA 在NK细胞中具体的调控作用研究仍然非常少,未来需要进一步挖掘。

除上述细胞外,lncRNA可能也介导其他类别固有免疫细胞发挥作用。研究表明,中性粒细胞也是抵御外源性感染的重要防线。既往针对中性粒细胞表达谱的分析结果显示,有多个lncRNA通过ceRNA调控网络参与细胞凋亡过程[48]。虽然在结核病领域还未见相关报道,但不能否认其在非特异性免疫反应中的可能功能。

综上所述,关于lncRNA在固有免疫中的调控作用及机制仍需要进一步完善。一方面,需要深入挖掘和解析lncRNA在MTB感染免疫中的作用模式和分子机制;另一方面,要加强对于lncRNA参与其他类型细胞(树突状细胞、NK细胞和中性粒细胞等)介导的固有免疫应答的作用和机制探讨。

二、lncRNA在宿主适应性免疫应答中的研究进展

(一)lncRNA在T细胞介导的免疫应答中的研究进展

目前已证实,宿主应对MTB感染的适应性免疫以T细胞介导的细胞免疫应答为主,主要包括CD4+T细胞和CD8+T细胞,通过特异性识别主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)-Ⅰ类或Ⅱ类分子抗原分化成效应T细胞发挥杀伤作用,在抗MTB感染的适应性免疫应答中起到重要的作用。其中,lncRNA介导DNA表观遗传修饰是其重要的调控机制之一[49]。

Agresta等[50]发现CD244分子通过维持lncRNA CD244位点的染色质状态来调控lncRNA CD244的表达,并将多梳蛋白家族中的果蝇zeste基因增强子人类同源物2(enhancer of zeste homolog 2,EZH2)引入到infg/tnfa启动子区,抑制组蛋白H3第27位赖氨酸发生三甲基化,从而抑制CD8+T细胞中IFN-γ和肿瘤坏死因子ɑ的表达,提示lncRNA 可通过调控表观遗传修饰来参与T细胞介导的适应性免疫功能[44, 51-52]。2017年,一项研究发现活动性结核病患者CD8+T细胞中血红素加氧酶1表达下调,与其染色体相近位置的lncRNA XLOC_014219的表达上调具有相关性;CD8+T细胞中lncRNA 00229的上调,与其附近的蛋白编码基因ARHGAP8的上调也存在相关性,故研究人员推测lncRNA的异常表达可能与其邻近的蛋白编码基因相关,lncRNA可能通过正向或负向调控附近基因的表达来参与MTB感染后宿主的免疫应答[53]。但是,lncRNA与邻近编码基因的调控关系及具体作用机制还需深入研究。

目前来看,lncRNA参与MTB感染后宿主CD4+T细胞介导的免疫应答的相关研究较少。2014年,研究初次揭示了活动性结核病患者和结核分枝杆菌潜伏感染者CD4+T细胞中lncRNA和mRNA的表达谱变化。2022年,Hong等[54]基于相关性分析和ceRNA网络机制分析了GSE37250数据,推测包括CD4+T细胞在内的多种T细胞亚群参与调控MTB感染后宿主适应性免疫应答,并构建lncRNA-miRNA共表达调控网络和PPI模型筛选出MIR60OHG/hsa-mir-21-5p轴可能介导T细胞激活,从而参与MTB感染后的适应性免疫。既往研究中并没有关于CD4+T细胞中特异lncRNA作用机制或作用途径的相关研究。

2022年的一项研究提示肠道菌群通过lncRNA-CGB负调控H3K27三甲基化(H3K27Me3)从而刺激IFN-γ的产生,并在T细胞中证实lncRNA-CGB通过与EZH2相互作用参与表观遗传修饰[55]。这是首篇将结核病与肠道菌群联系,进一步丰富了lncRNA参与结核病免疫调控的研究。此外, Wang等[56]推测在活动性结核病患者外周血单核细胞中LINC00870可能通过JAK/STAT信号通路调控Th1/Th2平衡参与MTB感染后的免疫应答反应,但具体的调控机制还需要进一步验正。

现有关于T细胞中lncRNA的研究,多关注整体lncRNA表达谱或通过生物信息学分析调控网络找到理论上与MTB感染相关的理论靶标,而lncRNA 的具体功能和调控机制及lncRNA与mRNA、miRNA和蛋白等生物大分子的调控网络还有待进一步明确。未来还需要结合具体的实验验证生物信息学预测结果,阐明lncRNA在T细胞介导的MTB感染适应性免疫中的具体作用。

(二)B细胞中lncRNA参与免疫反应的研究进展

宿主特异性体液免疫应答主要由B细胞介导,在机体抗结核免疫保护中也发挥重要作用。有研究对活动性结核病患者B细胞中lncRNA表达谱进行了分析,发现lncRNA XLOC_012582与其临近的编码基因SOCS3呈协同表达,这与既往在CD8+T细胞中得到的结论类似,即异常表达的lncRNA与其周围邻近基因的异常表达呈现出一定的相关性[53, 57],推测这些lncRNA可能作为顺式作用元件对其周围的编码基因发挥调控作用。

总之,虽然既往发表的研究已经发现并证实了一些在活动性结核病患者T细胞和B细胞中表达异常的lncRNA,结合生物信息学预测了其功能,但lncRNA在MTB感染后的宿主适应性免疫应答中的作用机制并未完全明确。因此,未来更进一步的研究也需要集中在参与活动性结核病发病过程中宿主适应性免疫相关的lncRNA具体功能和分子机制研究方面,以阐明lncRNA在抗MTB感染适应性免疫中的作用机制和途径,同时也为结核病免疫治疗提供理论基础。

展 望

现阶段结核病防治形势仍然十分严峻。随着lncRNA参与各类宿主免疫细胞介导MTB感染免疫应答的机制研究日益增多,证实lncRNA在炎症、表观遗传修饰、代谢、自噬和凋亡等多方面发挥调控作用,提示lncRNA作为药物开发靶点的潜在可行性。但MTB感染和结核病发病的免疫应答机制尚未完全阐明。随着高通量技术的广泛应用,更多的研究者发现包括miRNA、lncRNA和circRNA在内的多种非编码RNA参与了MTB感染和结核病发病过程。但是,目前在结核病领域,有关lncRNA的机制研究主要集中在细胞水平的表型研究,现有的一些机制探讨研究也多聚焦于ceRNA调控机制,对其他调控方式和作用机制的研究较少。此外,现有大部分研究主要关注lncRNA参与巨噬细胞介导的免疫应答的功能和机制,而对其参与其他固有免疫细胞应答或适应性免疫应答的研究比较缺乏。再者,基于目前有限的研究,尚不能揭示lncRNA对于染色质调控及其在抗MTB感染免疫应答中的全景调控网络,提示对lncRNA在结核病中的具体作用及调控方式的认识还相当有限,未来需要进一步分析其在MTB感染和结核病发病中的作用,并解析具体的作用机制,明确其相互作用网络。尽管如此,现有的研究表明,lncRNA有望作为辅助治疗结核病的靶标,这为结核病治疗新策略提供了新的方向和可能性。因此,靶向lncRNA的相关研究仍然需要继续并更加深入,以期为研究结核病免疫治疗和免疫预防提供靶点和理论依据。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

作者贡献董静：实施研究、起草文章;史雨婷：实施研究; 潘丽萍和张宗德：对文章的知识性内容作批评性审阅、指导