荧光PCR探针熔解曲线技术检测痰标本结核分枝杆菌利福平耐药性的研究

王嫩寒 田丽丽 陈双双 赵琰枫 樊瑞芳 陈昊 任怡宣 张洁 易俊莉 杨新宇 于兰 丁北川 李传友 代小伟

据世界卫生组织估算,2021年我国耐多药结核病(multidrug-resistant tuberculosis,MDR-TB)/利福平耐药结核病(rifampicin-resistant tuberculosis,RR-TB)发病数为33 000例;而实验室确诊的MDR/RR-TB患者数仅为16 826例,治疗成功率仅为53%[1],耐药结核病疫情形势严峻。利福平是一种广谱抗生素,作为一线抗结核药物,其耐药性备受关注。患者感染的结核分枝杆菌是否对利福平耐药,决定了不同的临床治疗方案[2]。传统的药物敏感性试验(简称“药敏试验”)建立在患者标本培养阳性的基础上,此种方法耗时长,易延误治疗。近年来,快速分子耐药筛查技术发展迅速,如GeneXpert MTB/RIF,能直接检测患者标本,及时获得利福平耐药检测结果,为患者制定个体化治疗方案赢取宝贵时间。但该技术的仪器耗材均为进口,影响其推广应用。本研究应用我国自主研发的荧光PCR探针熔解曲线(fluorescence polymerase chain reaction probe melting curve,MeltPro)技术对痰标本直接进行结核分枝杆菌利福平耐药性检测,以评价该方法的应用价值。

资料和方法

一、资料来源

收集2021年5月至2022年5月在北京市疾病预防控制中心结核病门诊就诊的初治肺结核患者痰标本。纳入标准：(1)GeneXpert MTB/RIF检测结果为阳性;(2)痰液标本量>3 ml。对收集到的痰标本进行涂片镜检及分枝杆菌分离培养,培养阳性菌株进行利福平比例法药敏检测;采用GeneXpert MTB/RIF方法和MeltPro技术对痰标本直接进行结核分枝杆菌利福平耐药性检测。

二、仪器和试剂

萋-尼抗酸杆菌染色液由珠海贝索生物技术有限公司生产,酸性罗氏培养基、中性罗氏培养基及含药培养基均由河南赛诺特生物技术有限公司生产,细菌超声分散计数仪BAC spreader 1100C由广东希格生物科技有限公司提供,使用厦门致善生物科技股份有限公司生产的结核分枝杆菌利福平耐药突变检测试剂盒(荧光PCR熔解曲线法),以及SLAN-96S Real-Time PCR System实时PCR检测系统(上海宏石医疗科技有限公司)进行结核分枝杆菌利福平的耐药性检测及结果分析。GeneXpert MTB/RIF检测仪及试剂盒由美国赛沛公司生产。

三、研究方法

1.涂片镜检：按照《结核病实验室检验规程》[3],选取适量痰标本进行涂片,随后进行萋-尼抗酸杆菌染色,在100倍油镜下进行检测。对检测结果进行分级,即“阴性”“1～8条/300视野”“+”“++”“+++”“++++”。

2.分枝杆菌分离培养：按照《结核病实验室检验规程》,吸取1 ml痰标本放入前处理管中,加入1～2倍体积4%的NaOH溶液,旋紧处理管螺旋盖,振荡混匀,使痰标本充分液化,于室温下静置15 min后,均匀接种于酸性罗氏培养基上,每支0.1～0.15 ml,旋紧螺旋盖,在36 ℃±1 ℃中孵育,直至长出可视菌落,记录生长情况。培养8周无菌落生长者报告“阴性”。

3.结核分枝杆菌比例法药敏试验：参照《结核病实验室检验规程》的结核分枝杆菌固体药敏试验操作,使用细菌超声分散计数仪BAC spreader 1100C、中性罗氏培养基、含药培养基(利福平,40 μg/ml),对培养阳性菌株进行利福平比例法药敏试验,同时用对硝基苯甲酸/噻吩-2-羟酸肼(PNB/TCH)培养基鉴定是否为结核分枝杆菌。TCH培养基上有菌落生长,PNB培养基上无菌落生长者为结核分枝杆菌;PNB培养基上有菌落生长,TCH培养基上无菌落生长者为非结核分枝杆菌。耐药百分比(%)=含药培养基上生长的菌落数/对照培养基上生长的菌落数×100%。若耐药百分比大于1%,则认为受试菌对该药耐药。

4.MeltPro技术耐药性检测：吸取1 ml痰标本加入到50 ml圆底离心管内,再加入1～2 ml前处理液(N-乙酰-L-半胱氨酸-氢氧化钠溶液),室温下振荡混匀15 min,加入40 ml 磷酸盐缓冲溶液(PBS)中和离心(3000×g离心18 min),弃上清,加1 ml的PBS进行重悬沉淀,10 000×g离心1 min,弃上清。在沉淀中加入300 μl试剂盒中提供的TB-DNA提取液,90 ℃加热10 min,10 000×g离心1 min,吸取上清液,得到结核分枝杆菌的DNA。按说明书要求配置PCR反应液,在20 μl反应液中加入5 μl结核分枝杆菌DNA,使用SLAN-96S Real-Time PCR系统进行结核分枝杆菌利福平耐药性检测及结果分析,反应程序参照说明书。通过比较所检测样本与阳性对照样本之间熔解曲线熔点值的差异判断样本是否发生突变：样本的熔点与阳性对照的熔点一致,误差不超过1 ℃时,判定为野生型,待检样本对所检测药物敏感;样本的熔点低于阳性对照2 ℃及以上时,判定为突变型,待检样本对所测药物耐药。若结果为结核分枝杆菌未检出或耐药不明确,则检测不成功,需重复检测。

5.GeneXpert MTB/RIF检测：按照GeneXpert MTB/RIF检测说明书要求操作,取1 ml痰标本置于螺旋盖前处理管中,加入2倍体积的检测样品试剂,旋紧前处理管,室温下振荡混匀15 min,使痰标本充分液化,打开检测匣,取2 ml处理后的样品,由加样孔缓慢加入检测匣中,放置到检测模块,仪器开始自动化检测。该技术针对rpoB基因81 bp利福平耐药核心区间(RRDR)设计引物和探针,检测其是否发生突变,用于辅助诊断是否为结核分枝杆菌,以及是否对利福平耐药。基于样本中结核分枝杆菌的Ct值,结核分枝杆菌结果以高、中、低和极低显示,Ct值<16为结核分枝杆菌含量高,Ct值在16～22之间为结核分枝杆菌含量中等,Ct值在22～28之间为结核分枝杆菌含量低,Ct值>28为结核分枝杆菌含量极低。

四、质量控制

本研究药敏试验所用培养基均用标准菌株H37Rv进行含药培养基质量控制。北京市疾病预防控制中心结核病实验室每年参加中国疾病预防控制中心结核病参比实验室组织的药敏试验熟练度测试,成绩为优秀。MeltPro技术耐药性检测选用含有相应野生型靶扩增基因的质粒作为阳性对照,既完成了结果的判读,又保证了检测的质量。GeneXpert MTB/RIF检测每个检测匣包括样本处理质控,确保样品经过正确处理;以及探针检查质控,保证探针检查合格。

五、统计学处理

采用SPSS 19.0软件对数据进行统计分析。计量资料呈偏态分布时以“M(Q1,Q3)”描述,计数资料以“例数”和“百分率/构成比(%)”描述,采用χ2检验或Fisher精确概率法及Kruskal-WallisH检验进行组间差异的比较,以P<0.05为差异有统计学意义。以利福平比例法药敏试验结果为参考标准,分别计算MeltPro技术和GeneXpert MTB/RIF方法检测利福平耐药的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值和Kappa值。Kappa值用于一致性检测,0～0.20为一致性极低,0.21～0.40为一致性一般,0.41～0.60为一致性中等,0.61～0.80为基本一致,0.81～1.00为几乎完全一致。

结 果

一、一般情况

本研究共收集158例初治肺结核患者GeneXpert MTB/RIF检测阳性痰标本,其中男性115(72.8%)例,女性43(27.2%)例。年龄范围16～88岁,年龄M(Q1,Q3)为46(31,64)岁。158例患者的痰标本中,涂片阳性104例,涂片阳性率为65.8%(104/158);经分枝杆菌分离培养,获得阳性菌株130株,培养阳性率为82.3%(130/158),培养阴性20例,污染8例,污染率为5.1%(8/158)。104例患者的涂片阳性标本中,培养阴性14例,涂阳培阴率为13.5%。130株阳性菌株均进行了利福平比例法药敏试验,得到明确的利福平药敏试验结果。

158份痰标本经MeltPro技术进行利福平耐药性检测,成功125份,失败33份。在130份培养阳性进行药敏试验的痰标本中,110份MeltPro技术利福平耐药性检测成功,20份检测不成功。28份未得到阳性菌株的痰标本中,经MeltPro技术检测有15份对利福平敏感,13份检测不成功。

二、痰标本荷菌量对MeltPro技术利福平耐药性检测的影响

MeltPro技术的利福平耐药性检测成功率为79.1%(125/158),随着痰涂片结果等级的升高而升高,各等级间差异有统计学意义(H=22.271,P=0.001),见表1。检测成功率也随着GeneXpert MTB/RIF检测结核分枝杆菌等级的升高而升高,各等级间差异有统计学意义(H=15.637,P=0.001),见表2。

表1 痰涂片结果不同等级与MeltPro技术检测利福平耐药性成功的关系

表2 GeneXpert MTB/RIF检测结核分枝杆菌不同等级与MeltPro技术检测利福平耐药成功的关系

三、利福平耐药性检测

MeltPro技术的利福平耐药检出率为17.6%(22/125),GeneXpert MTB/RIF方法的利福平耐药检出率为12.7%(20/158),比例法的利福平耐药检出率为13.1%(17/130),三者差异无统计学意义(χ2=1.537,P=0.464)。

以比例法药敏试验结果为参考标准,MeltPro技术和GeneXpert MTB/RIF方法检测利福平耐药的敏感度均为100.0%,特异度分别为94.6%和97.3%。见表3。

GeneXpert MTB/RIF方法检测利福平耐药基因突变而比例法药敏试验结果敏感者3例,MeltPro技术检测利福平耐药基因突变而比例法药敏试验结果敏感者5例。由于标本量不足,无法进行GeneXpert MTB/RIF重复实验;对相应结核分枝杆菌DNA用MeltPro技术进行了2次重复实验,结果同前。

表3 MeltPro技术和GeneXpert MTB/RIF方法检测利福平耐药性的效能

讨 论

Meltpro技术是国家科技重大专项的“结晶”,可以在3 h内完成检测,有多个荧光探针同时检测多个突变,通过熔点的变化和突变对应特有的熔解峰自动分析结果。多中心研究测得Meltpro技术检测的敏感度和特异度分别为94.2%和97.5%[4]。本研究选用肺结核患者痰标本,直接采用MeltPro技术进行利福平耐药性检测,发现其有较高的敏感度和特异度,但在基层实验室应用时还需注意DNA提取、标本的选择等问题。

一、MeltPro技术检测结果与痰标本菌荷量的关系

将MeltPro技术检测结果与痰涂片结果分级对应,涂片阴性痰标本检测成功率为59.3%,涂片1～8条/300视野及“+”的痰标本检测成功率为80.0%和86.2%,“++”及以上痰标本检测成功率为90.6%～100.0%,随着涂片阳性等级的升高,检测成功率相应升高。涂片阳性痰标本检测成功率达到80.0%以上,能获得可靠的耐药信息,与赵国连等[5]报告的结果基本一致。本研究同时对GeneXpert MTB/RIF检测结核分枝杆菌等级进行了比较,Meltpro检测成功率也随着结核分枝杆菌阳性级别的升高而升高,结核分枝杆菌阳性等级达到“中”和“高”时,检测成功率分别为91.8%和92.9%。因此,笔者建议基层实验室应用Meltpro技术时,为保证耐药检测的成功率,可选用涂片结果为“++”及以上或GeneXpert MTB/RIF检测结核分枝杆菌等级为“中”或“高”的痰标本。

二、MeltPro技术的利福平耐药筛查临床应用价值

本研究中,MeltPro技术、GeneXpert MTB/RIF方法和比例法药敏试验检测痰标本结核分枝杆菌利福平耐药的检出率分别为17.6%、12.7%和13.1%,三者差异无统计学意义。以比例法药敏试验检测结果为参考标准,MeltPro技术检测利福平耐药的敏感度为100.0%,特异度为94.6%,与苏碧仪等[6]报道的结果基本一致。与比例法药敏试验结果一致性的比较显示,Kappa值为0.845,为几乎完全一致。

三、MeltPro技术的可实施性

比例法药敏试验依赖于培养阳性菌株,需4～6周得到药敏试验结果。GeneXpert MTB/RIF是目前常用的分子利福平耐药检测方法,操作时长约2.5 h,试剂平均成本约220元/例;仪器及设备均需要进口,在使用和维修保养中受到一定限制;常规的GeneXpert MTB/RIF检测仪为4通道,可同时检测4份标本。与之相比,MeltPro技术也可以直接检测痰标本,于3 h内获得耐药检测结果,试剂平均成本约100元/例。MeltPro技术的试剂及仪器设备均为国产,试剂采购和仪器维修保养均很方便;可同时检测46份标本的利福平耐药情况。除此之外,该技术检测药物种类更多,可检测异烟肼、利福平、链霉素、乙胺丁醇及氟喹诺酮类药物的耐药情况。有文献报道,经GeneXpert MTB/RIF检测为利福平耐药的结核分枝杆菌,同时对异烟肼和氟喹诺酮类药物耐药的比例也较高[7],可能会造成对MDR-TB及准广泛耐药结核病的漏诊。另外,RR-TB患者一经诊断,往往以氟喹诺酮类药物作为初始抗结核治疗方案的核心药物之一,若此时结核分枝杆菌对氟喹诺酮类药物耐药,会降低治疗效果,造成治疗失败甚至患者死亡[8]。MeltPro技术能够快速筛查MDR-TB和准广泛耐药结核病患者,为临床医生因人施治提供依据。

四、比例法与分子药敏试验结果不一致原因初步分析

本研究中,部分痰标本的分子耐药检测结果与比例法药敏试验结果不一致,均已进行了重复试验。造成该现象的原因可能与利福平存在一定比例的边缘耐药现象有关。本研究中,比例法药敏试验于接种后4周报告药敏试验结果。Xia等[9]通过将比例法药敏试验结果的报告时间由4周延长至6周,使得更多边缘利福平耐药菌株被检出,利福平耐药的检出率由43.9%上升至57.9%;Xia等[9]在用优化肉汤微孔板法进行药敏试验时发现,将临界浓度由1.0 μg/ml降低至0.5 μg/ml时,利福平耐药的检出率由52.6%上升至70.2%,说明耐药基因检测与比例法药敏试验结果不符还可能与培养基含药浓度有关;另外,有研究报道,rpoB基因RRDR区位点突变导致的利福平耐药患者中,有48.8%的表型药敏试验结果为敏感,其中Leu511Pro是最常见的突变位点[10]。由此推断,利福平耐药基因突变而比例法药敏试验结果敏感也可能与突变位点有关。

另外,若患者存在敏感菌和耐药菌的混合感染,通常在培养过程中,敏感菌生长优于耐药菌,导致培养物中耐药菌的比例下降,出现表型药敏试验结果为假阴性[11]。后续可对菌株进行MeltPro技术耐药性筛查,探讨异质性耐药对分子耐药检测和比例法药敏试验结果的影响。

五、实验中存在的问题和不足

本研究中有33份痰标本MeltPro耐药性检测不成功。根据说明书提供的数据,MeltPro技术进行利福平耐药筛查的检测限为2×104菌/ml。本研究采用粗提法从痰标本中提取结核分枝杆菌DNA。该方法虽然操作简便快捷,适用于基层实验室,但提取效能有限,不能保证DNA纯度及浓度,可能会干扰耐药检测结果[10]。此外,病原学检测结果的敏感度与痰标本质量密切相关[12],若能提高痰标本质量,并对粗提DNA进行纯化或采用提取效能高的方法或仪器进行核酸的提取,可极大提高MeltPro技术的检测成功率。再者,对比例法药敏试验与分子耐药结果不符合的标本,应进一步行全基因组测序等检测,分析不一致的原因;本研究受经费和课题时间的限制,耐药标本收集数量有限,在后续条件允许的情况下,将收集更多耐药痰标本进行深入研究。

综上所述,使用MeltPro技术直接对痰标本进行利福平耐药性筛查具有敏感度高、特异度强、操作简便等优点,可缩短检测时间,为临床提供快速准确的耐药筛查结果。同时,MeltPro技术还能够快速筛查MDR-TB和准广泛耐药结核病患者。但MeltPro技术对DNA的浓度及纯度有较高要求,若能保证DNA浓度及纯度,可以极大提高检测的成功率。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

作者贡献王嫩寒：酝酿和设计实验、整理数据、论文撰写和修改;田丽丽、陈双双和赵琰枫：整理数据、进行统计分析;樊瑞芳、陈昊、任怡宣、张洁、易俊莉、杨新宇和于兰：收集标本、实施研究;丁北川：行政、技术支持,获取研究经费;李传友和代小伟：技术和材料支持、文章修改和指导