微卡与维生素D联合应用对初治涂阳肺结核CD4+ T细胞亚群平衡的影响

尚耀民 周晓蕾 薛运玲 冷霞

肺结核(pulmonary tuberculosis,PTB)进展机制复杂且目前尚无明确定论。近年来,有研究指出PTB的发生发展与CD4+T细胞亚群辅助性 T细胞1(Th1)与Th2(Th1/Th2)比值、Th17与调节性 T细胞(Treg)比值(Th17/Treg)的动态失衡密切相关[1-2]。注射用母牛分枝杆菌菌苗(微卡)是目前世界卫生组织在结核病研究与发展战略规划中推荐使用的免疫调节制剂,辅助治疗初治涂阴PTB的临床疗效显著,且不良反应发生率低[3],其联合用药可明显增强PTB患者的免疫功能和治疗效果[4]。临床资料显示,50%以上的PTB患者血清25-(OH)D3(维生素D)含量明显低于健康人群,血清维生素D水平与外周血CD4+T细胞和CD4+/CD8+T细胞水平均呈正相关,可通过调节PTB患者体内免疫反应增强 T细胞对结核分枝杆菌的杀灭能力[5],因此,维生素D缺乏可增加结核分枝杆菌感染风险,补充维生素D可有效防治PTB[6]。基于以上研究,猜测微卡联合维生素D辅助治疗可能在增强PTB患者免疫功能和提高临床疗效上效果显著,但目前关于二者联合辅助治疗PTB的研究报道还比较少见,尚缺乏相关研究证实。因此,本研究初步探讨二者联合应用对PTB患者CD4+T细胞亚群动态平衡的影响,并分析其临床疗效,以期为PTB临床疗效的提高提供参考依据。

对象和方法

一、研究对象

1.研究对象遴选：采用前瞻性研究方法,于2019年6月至2022年6月,参照入组标准及患者意愿将河南省胸科医院收治的初治涂阳PTB患者分别纳入常规抗结核治疗组(对照组)、常规抗结核+微卡治疗组(微卡组)和常规抗结核+微卡+维生素D辅助治疗组(联合组),至每组100例时截止纳入。排除中途因各种原因退出或脱落而不能完成6个月治疗方案者,最终以最低入组74例为3组纳入患者数[共计222例(PTB组)],并进行统计分析。3组患者性别、年龄及体质量指数(BMI)等基线资料的差异均无统计学意义(表1),具有可比性。另按222例患者的性别、年龄及BMI等人口学特征以1∶1匹配从本院体检中心数据库选取同期222名健康体检者相关临床资料(健康组),其中,男性117名,女性105名;平均年龄为(41.54±3.07)岁,BMI为21.35±1.38;吸烟81名,饮酒141名。本研究经河南省胸科医院伦理委员会审核批准(审批号：2020-07-025),且所有研究对象均签署知情同意书。

2.PTB患者入组标准：(1)纳入标准：①年龄≥18岁;②符合中华人民共和国卫生行业标准《WS 288—2017肺结核诊断》中PTB的相关诊断标准[7];③首次确诊为PTB;④自愿参与本研究,临床资料完整;⑤均完成6个月的治疗;⑥所有患者均进行了初始维生素D和血钙浓度的检测。(2)排除标准：①近3个月内有糖皮质激素、免疫类制剂或维生素类药物用药史;②妊娠或哺乳期妇女;③对微卡、维生素D或抗结核药物过敏,有免疫相关疾病者,以及合并心、肝、肾等疾病引起呼吸系统功能不全者;④重症PTB,如血行播散性PTB、结核空洞≥2个;合并干酪性肺炎及其他肺外结核等;⑤中途因各种原因退出或脱落而不能按治疗方案完成6个月治疗者。

表1 不同组别抗结核治疗初治涂阳肺结核患者基本特征比较

二、研究方法

1.治疗方法：(1)对照组：采用常规抗结核治疗方案,给予患者异烟肼(广东华南药业集团有限公司,批号：201201;0.3 g/d)+利福平(沈阳红旗制药有限公司,批号：C2521131;0.6 g/d)+吡嗪酰胺(沈阳红旗制药有限公司,批号：D0421151;1.5 g/d)+乙胺丁醇(广东华南药业集团有限公司,批号：210301;0.75 g/d)顿服,每次用药均在同一时间点服用。(2)微卡组：在常规抗结核治疗的基础上增加微卡治疗,臀部肌肉深部注射微卡22.5 μg(安徽智飞龙科马生物制药有限公司,批号：111438)。强化期(2个月)2 次/周,两次用药间隔至少72 h;巩固期(4个月)1次/周。(3)联合组：在微卡组治疗的基础上再联用维生素D制剂。强化期(2个月)口服维生素D阿法骨化醇滴剂(南通华山药业有限公司,批号：201225),首剂量0.25 μg/d,并每2周测定1次血钙浓度,根据血钙浓度检测结果增减剂量,当血钙含量<1/2正常下限值时补充剂量为0.5 μg/d;当血钙含量≥1/2正常下限值时补充剂量为0.25 μg/d。所有患者治疗开始前均采用迈瑞BC-10 全自动血液生化分析仪检查血钙和维生素D水平,均低于正常参考值(血钙：2.08～2.60 mmol/L;维生素D：26～65 ng/L),在治疗强化期内血钙浓度连续2次检测正常者视为退出血钙监测。巩固期(4个月)口服维生素D3滴剂,400 IU/d,并每天户外活动不少于2 h。治疗期间未见明显微卡及维生素D相关不良反应。

2.观察指标：(1)临床指标：随访跟踪患者治疗前和治疗后6个月内的临床症状(咳嗽、咯血、咳痰、盗汗、胸痛及疲乏等)、细菌学及影像学检查情况(包括胸部X线摄影和CT扫描)。(2)实验室指标：采集所有健康组(治疗前)和PTB组(治疗前及治疗后6个月)研究对象清晨空腹静脉血5 ml。取2 ml肝素抗凝处理,按照人单核细胞分离试剂盒(武汉艾美捷科技有限公司)说明书分离单核细胞,并制成单个核细胞重悬液(1×106/ml),分别依次加入CD4、CD25、Foxp3荧光抗体室温孵育40 min,再加入γ-干扰素(IFN-γ)、白细胞介素-4(IL-4)、IL-17抗体(英国abcam公司),避光孵育50 min,磷酸盐缓冲液(PBS)清洗,加染色缓冲液,上流式细胞仪检测IFN-γ+CD4+T细胞(Th1)、IL-4+CD4+T细胞(Th2)、IL-17+CD4+T细胞(Th17)及CD4+CD25+Foxp3+T细胞(Treg)含量,采用Kaluza分析流式数据。剩余3 ml血液样本不抗凝处理,室温静置40 min,3000 r/min(离心半径为7.5 cm) 离心15 min,收集血清,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清中IFN-γ、IL-4、IL-17、IL-10水平,严格按照ELISA试剂盒(英国abcam公司)说明书操作。采用紫外分光光度计(上海谱元仪器有限公司)测定波长450 nm处的吸光度值(A450值),并计算各细胞因子水平。

3.疗效评定[8-9]：根据临床症状、细菌学检查以及影像学检查综合评定患者疗效。(1)痊愈：咳嗽、咳痰、盗汗等临床症状完全消失,连续6个月痰涂片阴性,CT扫描示肺部空洞闭合,肺部病变无活动性;(2)显效：临床症状消失,连续3个月痰涂片阴性,CT扫描示肺部空洞闭合或缩小,病灶吸收;(3)有效：临床症状改善,CT扫描示肺空洞缩小或无明显变化,病灶有明显吸收;(4)无效：临床症状无明显变化甚至恶化,痰涂片转阳,或CT扫描示肺部空洞增大或出现新空洞,或病灶吸收不变、恶化。其中,总有效=痊愈+显效+有效。肺部空洞情况评价包括闭合(疤痕愈合、阻塞愈合或消失)、缩小(平均直径缩小≥1/2)、不变(平均直径缩小<1/2)和增大(平均直径增大)。病灶吸收评价包括吸收(病灶吸收≥1/2)、明显吸收(病灶吸收≥1/3且<1/2)、不变(病灶吸收<1/3)和恶化(病灶增大或新增病灶)。

三、统计学处理

结 果

一、治疗前PTB患者与健康体检者外周血Th1/Th2、Th17/Treg及相关细胞因子水平检测情况

与健康组比较,PTB组Th1/Th2和Th17/Treg比值及IFN-γ水平均明显降低,但IL-4、IL-17和IL-10水平均明显升高,差异均有统计学意义,见表2。

二、不同治疗方案对PTB患者Th1/Th2和Th17/Treg平衡体系的影响

治疗前,PTB患者不同组别外周血Th1/Th2、Th17/Treg比值及IFN-γ、IL-4、IL-17、IL-10水平的差异均无统计学意义。治疗后6个月,PTB患者不同组别较治疗前外周血Th1/Th2、Th17/Treg比值和IFN-γ水平均明显升高,IL-4、IL-17及IL-10水平均明显降低,且以对照组、微卡组及联合组的次序依次升高或降低,两组间差异均有统计学意义。具体见表3、4。

表2 不同组别研究对象Th1/Th2和Th17/Treg体系及相关各细胞因子水平检测情况

表3 不同组别初治涂阳肺结核患者治疗前与治疗6个月后Th1/Th2体系细胞因子的比较

表4 不同组别初治涂阳肺结核患者治疗前与治疗6个月后Th17/Treg体系细胞因子的比较

三、不同治疗方案对PTB患者痰涂片阴转率的影响

治疗3、6个月后,PTB患者不同组别痰涂片阴转率的差异均有统计学意义(χ2=11.446,P=0.003;χ2=12.025,P=0.002)。其中,联合组治疗3、6个月痰涂片阴转率均明显高于微卡组和对照组,差异均有统计学意义;但微卡组和对照组比较,差异均无统计学意义(表5)。

四、不同治疗方案对初治涂阳PTB患者肺部病灶和空洞的改善效果分析

治疗6个月后,PTB患者不同组别肺部病灶吸收和肺空洞改善情况的差异均有统计学意义(χ2=12.827,P=0.046;χ2=21.149,P=0.002),但联合组肺部病灶吸收率和空洞闭合率与微卡组比较,差异均无统计学意义(表6)。

表5 不同组别初治涂阳肺结核患者治疗3、6个月后的痰涂片阴转情况

表6 不同组别初治涂阳肺结核患者治疗6个月后肺部病灶和空洞改善情况

表7 不同组别初治涂阳肺结核患者治疗6个月后的疗效分析

五、不同治疗方案对初治涂阳PTB患者的疗效分析

治疗6个月后,PTB患者不同组别综合疗效和总有效率的比较差异均有统计学意义(H=12.047,P=0.002;χ2=6.541,P=0.038)。其中,联合组痊愈、显效的比例均高于微卡组和对照组(表7)。

讨 论

Th1、Th2、Th17和Treg是重要的CD4+T细胞亚群,通过分泌多种细胞因子参与机体防御、免疫及感染性疾病的病理过程[10]。研究认为,PTB的发生发展与Th1/Th2、Th17/Treg的平衡有关,相关细胞因子IFN-γ、IL-4、IL-10、IL-17在结核分枝杆菌感染后异常改变,水平高低与PTB严重程度也密切相关[11-13]。本研究结果显示,初治涂阳PTB患者的Th1/Th2、Th17/Treg比值及IFN-γ水平均明显低于健康人,IL-4、IL-17、IL-10水平均明显高于健康人,与既往研究结果[14-15]一致。因此,恢复PTB患者Th1/Th2、Th17/Treg平衡,改善相关细胞因子的分泌水平,提高PTB患者免疫功能,对PTB的防治具有十分重要的意义。

微卡作为结核病研究与发展战略规划中推荐使用的双向免疫调节制剂,可明显促进T细胞转化、增殖及释放淋巴因子,抑制结核分枝杆菌感染所引起的变态反应,改善机体病理性损伤[3]。早期微卡多用于PTB的预防,近年来微卡逐步被用于PTB的辅助治疗中,但关于其疗效的相关研究报道较少见。研究显示,微卡辅助治疗可有效缩短涂阴PTB的治疗周期[16],明显提高初治药物敏感PTB患者病灶的吸收率,在复治结核病和多耐药结核病中也显示出一定的疗效及安全性,如微卡辅助治疗提高了复治涂阳PTB和多耐药PTB患者的痰涂片阴转率、空洞闭合率和病灶吸收率,有效改善了患者免疫功能,并降低其1年复发率[17-19]。但对初治涂阳PTB患者免疫力及疗效的作用效果目前尚不够明确。本研究发现,与常规抗结核治疗相比,初治涂阳PTB患者微卡辅助治疗后Th1/Th2、Treg/Th17平衡明显恢复,IFN-γ水平回升,IL-4、IL-17、IL-10水平依次回降;治疗3、6个月的痰涂片阴转率均明显提高,病灶愈合和治疗总有效率均有所改善,但与对照组比较无明显差异,仅肺部空洞改善情况有差异,临床效果并不理想。这提示单独的微卡辅助治疗对初治涂阳PTB患者自身免疫功能的改善效果显著,但临床疗效并不明显。

回顾现有研究发现,在常规抗结核治疗的基础上联合微卡治疗更有利于提高临床疗效。崔丹等[4]研究显示,与微卡联合常规抗结核治疗相比,常规抗结核治疗联用微卡和利奈唑胺可明显促进多耐药结核病患者的病灶愈合,有效改善痰菌阴转率,综合疗效确切,同时可有效提高患者T细胞亚群CD4+水平和CD4/CD8比值,增强了患者免疫功能;程建强[20]的研究显示,在常规抗结核治疗的基础上使用微卡和沙参麦冬汤治疗PTB疗效确切,与常规抗结核治疗组相比,可明显改善患者病灶吸收情况,提高2、6个月末的痰涂片阴转率,降低抗结核药物的不良反应发生率。但在常规抗结核治疗的基础上,使用微卡联合其他药物辅助治疗的相关研究还较少,其安全、高效的联合方案仍需进一步探讨。

维生素D具有多种免疫活性,一定程度上影响免疫平衡系统,增强机体免疫功能[21-22]。流行病学及临床研究显示,PTB患者常存在维生素D缺乏或不足现象,较健康人明显降低[23],这可能是结核分枝杆菌导致维生素D代谢紊乱所致,也可能是抗结核药物引起血清维生素D水平下降,如异烟肼通过抑制维生素D分子结构中的羟基导致25(OH)D3减少,利福平通过酶的诱导促进25(OH)D3转化为无活性代谢物;还可能与患者饮食结构的改变及紫外线照射的减少有关[24]。多数学者认为,血清维生素D的缺乏可使维生素D介导的抵御结核分枝杆菌的免疫作用和机体消灭结核分枝杆菌的能力降低,是PTB发病的高危因素,也是PTB治疗效果不佳的的重要原因之一[25-28]。因此,补充维生素D有助于提高自身免疫力,促使T细胞平衡恢复,抑制炎症反应,明显提高痰涂片阴转率,改善临床症状及肺部病变程度[29-30];也有研究发现,维生素D辅助治疗可明显改善儿童PTB临床症状及肺部病变程度,提高患儿自身免疫能力[31];因此,提高外周血中维生素D的含量有助于PTB好转,但既往研究多集中于维生素D对常规抗结核治疗方案的增效作用,很少见与其他药物再联合治疗抗结核的效果研究。

本研究明确了单独的微卡辅助抗结核治疗对初治涂阳PTB患者自身免疫功能的改善效果显著,但临床疗效改善并不明显。因此,本研究在此治疗基础上,进一步对联合维生素D的PTB患者自身免疫功能及临床疗效进行了探讨,结果显示,微卡与维生素D联合使用后患者外周血Th1/Th2、Treg/Th17平衡及细胞因子IFN-γ、IL-4、IL-17、IL-10水平恢复幅度均明显高于对照组和微卡组;治疗后6个月的痰涂片阴转率、综合疗效和总有效率均优于微卡组和对照组。分析其原因可能是：一方面,微卡含有与结核分枝杆菌相似的抗原,能够促进T细胞的增殖以改善细胞免疫功能,抑制病原菌引起的变态反应,改善自身免疫力,阻止结核病进展;另一方面,体外补充维生素D能有效治疗由于维生素D缺乏所致的先天性免疫和适应性免疫功能的损害,减轻抗结核药物不良反应并增强其疗效[32]。值得注意的是,联合组患者的肺部病灶和空洞改善情况均优于对照组,但与微卡组的差异均无统计学意义,这可能与研究对象单一、患者例数较少有关,后续需扩大样本量进一步探究。以上提示常规抗结核联合微卡和维生素D辅助治疗方案疗效确切,并可有效改善PTB患者体内CD4+T细胞Th1/Th2、Th17/Treg平衡及相关细胞因子水平,提高患者自身免疫力,发挥抗结核增效作用。本研究也存在以下局限：一是本研究纳入患者仅为初治涂阳患者,结论的适用性受到一定限制;二是本研究仅选取了较重要的4种细胞因子进行分析,属于初步探讨,其全面性可能尚缺。因此,后续工作中还需纳入不同类型PTB、扩大样本、检测更多Th1/Th2、Th17/Treg平衡体系相关细胞因子做进一步全面研究。

综上所述,常规抗结核联合微卡和维生素D辅助治疗可促进患者CD4+T细胞亚群Th1/Th2、Th17/Treg平衡恢复,有效改善IFN-γ、IL-4、IL-17和IL-10细胞因子水平,临床疗效显著。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

作者贡献尚耀民：设计试验方案,收集、汇总、核实并分析所有病例资料及数据统计结果、撰写文章;周晓蕾：辅助设计试验方案,收集、复查病例资料,审阅文章;薛运玲：收集病例资料,并对痰涂片、病灶及肺空洞资料进行统计学分析;冷霞：收集病例实验室检验指标,统计分析治疗6个月疗效