结核分枝杆菌Rv2333c在巨噬细胞内功能的初步研究

何萍 王怡婷 宋泽萱 夏辉 王胜芬 贺文从 郑扬 赵雁林

结核病依旧是全球公共卫生需要攻克的难关,临床上越来越多的耐多药结核分枝杆菌的出现更加剧了这一严峻形势[1]。一方面,耐药性的产生多与其自身药物转运泵相关,在结核分枝杆菌主要的耐药泵[包括主要异化超家族(major facilitator superfamily,MFS)、耐受-生节-分裂家族(resistance-nodulation-division family,RND)、三磷酸腺苷结合转运蛋白家族(ATP-binding cassette transporter family,ABC)和小多重耐药家族(small multidrug resistance family,SMR)][2]中,MFS家族多为跨膜转运蛋白,拥有多个跨膜区,在细菌感染机体中发挥重要作用[3]。结核分枝杆菌感染机体时,往往最先与肺部巨噬细胞接触,使得机体巨噬细胞多在清除结核分枝杆菌早期感染过程中即发挥重要作用。另一方面,结核分枝杆菌侵染机体会引起细胞免疫,而结核分枝杆菌通过改变细胞内一系列信号通路的变化[如肿瘤坏死因子α(TNF-α)、核因子激活B细胞的κ-轻链增强(NF-κB)和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号途径等]来阻断机体对自身的清除杀伤作用[4]。

已有研究表明,结核分枝杆菌可通过参与NF-κB和MAPK途径与巨噬细胞产生相互作用,但其分子机制尚不清楚。结核分枝杆菌Rv2333c属于MFS家族,参与结核分枝杆菌对壮观霉素和四环素的先天性耐药[5],但其具体的耐药机制和免疫功能也并不很清楚。本研究通过在耻垢分枝杆菌内表达Rv2333c基因,构建耻垢分枝杆菌过表达Rv2333c菌株,进而用其感染小鼠巨噬细胞J774A.1,探究Rv2333c与NF-κB途径的关系,即Rv2333c在细菌感染巨噬细胞过程中所发挥的功能。

材料和方法

一、研究材料

1.菌株：耻垢分枝杆菌mc2155(ATCC700084)和结核分枝杆菌H37Rv(ATCC27294)均由中国疾病预防控制中心结核病预防控制中心结核病国家参比实验室保存。小鼠巨噬细胞J774A.1采购于中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心。质粒pSUM-Kan-MCS2购自全球质粒共享信息库(Addgene;plasmid#109289)。

2.试剂与仪器：KOD plus Neo(PCR试剂盒),东洋纺(上海)生物科技有限公司;2×Taq Master Mix,江苏康为世纪生物科技有限公司;LB琼脂和LB肉汤,北京陆桥技术有限公司;Middle brook 7H9和Middle brook 7H10,美国碧迪医疗器械有限公司;高糖培养基DMEM、胎牛血清(FBS)和磷酸盐缓冲液(PBS,pH 7.4),美国赛默飞世尔科技公司;anti-HA抗体和anti-Rabbit抗体,美国Cell Signaling Technology公司;化学发光试剂盒,美国赛默飞世尔科技公司;Mouse IL-1 bate/IL-1F2 Duo Set酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒,美国Bio-Techne Corporation公司;酶标仪、电转仪和蛋白印迹转膜槽,美国伯乐生命医学产品有限公司;触摸屏二氧化碳培养箱,德国美墨尔特贸易有限公司。

二、研究方法

1.重组质粒的构建：根据美国国家生物信息中心(NCBI)上公布的结核分枝杆菌Rv2333c基因序列(1627 bp)设计、合成引物并进行目的基因序列的扩增,扩增C段添加HA标签序列。上游引物Rv2333c-fwd：5′-CCAAGCTTTCATGAACCGCACACAGCTCCT-3′,下游引物Rv2333c-HA-rev：5′-CCAAGCTTTCAGGCGTAGTCCGGCACGTCGTACGGGTAGGCAGGCCATAGTCGACACCA-3′。将Rv2333c的PCR扩增产物取5 μl进行核酸电泳跑胶,若琼脂糖凝胶上出现约1627 bp的条带,说明Rv2333c片段扩增成功。使用限制性内切酶Hind Ⅲ分别处理Rv2333c基因扩增片段和质粒pSUM-Kan-MCS2,37 ℃处理2 h后纯化回收。使用T4连接酶16 ℃处理2 h后,混合产物热激转入E.coliDH5α感受态细胞,涂布于含有卡那霉素(50 μg/ml)的LB琼脂板,37 ℃过夜培养。通过使用Rv2333c基因的验证引物进行菌落聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR),以筛选阳性克隆并进行测序分析。将菌落PCR扩增产物取5 μl进行核酸电泳跑胶,若琼脂糖凝胶上出现约1627 bp的条带,说明该克隆内含有Rv2333c片段,将此克隆提取质粒进行测序检测。重组质粒pSUM-MCS2-Rv2333c构建成功后,通过电转化方法转入耻垢分枝杆菌mc2155感受态细胞内,转化产物涂布于含有卡那霉素(50 μg/ml)和0.05% Tween-80的Middle brook 7H10琼脂板,37 ℃培养3～5 d。

2.Rv2333c在耻垢分枝杆菌中的表达：将含有重组质粒pSUM-MCS2-Rv2333c和空载pSUM-Kan-MCS2的耻垢分枝杆菌(Ms_Rv2333c和Ms_Vec)培养于含有卡那霉素(50 μg/ml)和0.05% Tween-80的10 ml Middle brook 7H9液体培养基中,37 ℃培养24 h,4000×g离心30 min收集菌体。用1 ml 1×PBS重悬菌体,加入0.1 mm硅珠振荡破碎,12 000×g离心10 min收集菌体蛋白。样品中加入4×蛋白上样缓冲液 (4×protein loading buffer),煮沸处理10 min后,加样于十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),并通过anti-HA抗体进行蛋白免疫印迹实验(Western blotting实验)。若在PVDF膜的Ms_Rv2333c样品泳道内出现相对分子质量大约为58 200的条带,而Ms_Vec样品泳道内没有出现,则说明Rv2333c在耻垢分枝杆菌内正常表达。

3.重组耻垢分枝杆菌生长曲线的测定：将Ms_Vec 和Ms_Rv2333c转接于300 ml 7H9液体培养基内,调整初始吸光度值(A600)为0.01,37 ℃、摇床培养箱转速设定为180 转/min,培养48 h。每隔6 h测量1次A600值,记录数据并绘制生长曲线。

4.Rv2333c过表达菌株对巨噬细胞毒性影响分析：将小鼠巨噬细胞J774A.1以5×103/孔接种于96孔细胞培养板上,每组设置3个平行复孔,使用含有10% FBS的高糖DMEM培养基于37 ℃、5%CO2细胞培养箱内过夜培养。将重组耻垢分枝杆菌(Ms_Rv2333c;实验组)和空载耻垢分枝杆菌(Ms_Vec;空载组)按照感染量MOI=10∶1加入细胞孔中,感染6、24和48 h后,按照乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性检测试剂盒说明书处理样品,检测每个时间段巨噬细胞的活性。

注 泳道M为DNA分子质量标准;图1中泳道1为Rv2333c PCR扩增产物;图2中1～7泳道均为重组质粒PCR扩增片段,8泳道为阴性对照;1627 bp为Rv2333c序列的碱基对数目图1～2 Rv2333c重组质粒的构建

5.Rv2333c过表达菌株在巨噬细胞内存活能力的影响：将小鼠巨噬细胞J774A.1以5×105/孔接种于12孔细胞培养板中,使用含有10% FBS的高糖DMEM培养基于37 ℃、5%CO2细胞培养箱内过夜培养。将Ms_Rv2333c和Ms_Vec按照感染量MOI=10∶1加入细胞孔中,感染2 h后弃掉细胞培养液,并用1×PBS反复清洗每个细胞孔3遍。之后每个细胞孔内加入1 ml含有200 μg/ml的庆大霉素和10% FBS的高糖DMEM培养基。在此后的6、24和48 h时使用1%曲拉通100裂解细胞。将裂解样品倍比稀释,每个稀释浓度取10 μl接种到含有卡那霉素(50 μg/ml)和0.05% Tween-80的Middle brook 7H10固体培养皿中,每个梯度样品做3个平行。将培养皿置于37 ℃培养2～3 d。统计培养皿上的菌落个数,进行重组耻垢分枝杆菌巨噬细胞胞内存活实验。

6.RT-PCR和ELISA检测：将小鼠巨噬细胞J774A.1以5×105/孔接种于12孔细胞培养板中,过夜培养,Ms_Rv2333c和Ms_Vec按照感染量MOI=10∶1加入细胞孔中。于6、24和48 h后收集上清培养液,同时用裂解液裂解收集细胞样品。按照细胞RNA提取试剂盒说明书提取裂解细胞样品RNA,并进行反转录反应和荧光定量PCR检测。上清培养液按照ELISA试剂盒处理,检测细胞因子蛋白水平的变化。

7.Western blotting检测：将小鼠巨噬细胞J774A.1以5×105/孔接种于12孔细胞培养板中,过夜培养,Ms_Rv2333c和Ms_Vec按照感染量MOI=10∶1加入细胞孔中。感染3、6、12和24 h后用裂解液裂解收集细胞样品,进行NF-κB、磷酸化细胞外调节蛋白激酶1/2(p-ERK1/2)和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)检测。

三、统计学处理

结 果

一、Rv2333c重组质粒构建

利用特异引物扩增Rv2333c片段,琼脂糖凝胶电泳结果显示得到大小符合预期的扩增产物(图1),然后将目的条带处PCR产物割胶回收并纯化,进行后续实验。菌落PCR显示3个克隆有明显的目的条带(图2),提取质粒进行测序检测,结果显示序列与Rv2333c片段序列一致,说明重组质粒构建成功。

二、Rv2333c在耻垢分枝杆菌中的表达

将Ms_Vec和Ms_Rv2333c挑取单克隆接种于液体培养基,收集细菌蛋白做Western blotting检测。结果显示,在重组耻垢分枝杆菌内,Rv2333c在相对分子质量为58 200处有特异性条带(图3),说明Rv2333c在耻垢分枝杆菌内正常表达。

注 Ms_Rv2333c：重组耻垢分枝杆菌(实验组);Ms_Vec：空载耻垢分枝杆菌。HA：检测抗体图3 Rv2333c在耻垢分枝杆菌内表达

三、Rv2333c表达对耻垢分枝杆菌生长无影响

为探究Rv2333c表达时是否影响耻垢分枝杆菌的生长,研究完成了重组耻垢分枝杆菌生长曲线的测定,并将生长曲线根据生长速率划分为生长前期(0～12 h)、中期(18～42 h)和后期(48 h)3个时间段。结果显示,Rv2333c的表达对耻垢分枝杆菌生长无影响,Ms_Rv2333c和Ms_Vec不论在细菌生长前期、中期还是后期差异均无统计学意义(表1和图4)。

四、Rv2333c在感染初期抑制巨噬细胞调亡

为了更进一步探究Rv2333c是否对巨噬细胞调亡有影响。Ms_Rv2333c和Ms_Vec以感染量MOI=10∶1感染巨噬细胞,在6、24和48 h后检测细胞活性。结果显示,相较于Ms_Vec,Ms_Rv2333c在6 h时LDH释放量明显下调,对巨噬细胞的细胞毒性降低(表2和图5)。

表1 Ms_Vec和Ms_Rv2333c体外生长速率比较

注 Ms_Rv2333c：重组耻垢分枝杆菌(实验组);Ms_Vec：空载耻垢分枝杆菌图4 重组耻垢分枝杆菌生长曲线测定

表2 Ms_Vec和Ms_Rv2333c对细胞毒性的影响

注 Ms_Rv2333c：重组耻垢分枝杆菌(实验组);Ms_Vec：空载耻垢分枝杆菌。 ***为P<0.001图5 Rv2333c对巨噬细胞J774A.1活性的影响

五、Rv2333c对耻垢分枝杆菌在巨噬细胞内存活能力的影响

为进一步探究Rv2333c抑制巨噬细胞调亡是否由细菌在细胞内复制繁殖引起,笔者进行了巨噬细胞内菌落计数实验。Ms_Rv2333c和Ms_Vec以感染量MOI=10∶1感染巨噬细胞,6、24和48 h后裂解细胞,然后将含菌裂解液倍比稀释后转接培养于7H10培养皿,培养2～3 d后统计单克隆数量。结果显示,不同时间Ms_Rv2333和Ms_Vec两组菌落形成单位的差异均无统计学意义(表3和图6)。

表3 Ms_Vec和Ms_Rv2333c在巨噬细胞内菌落存活情况

注 Ms_Rv2333c：重组耻垢分枝杆菌(实验组);Ms_Vec：空载耻垢分枝杆菌图6 重组耻垢分枝杆菌在巨噬细胞内的菌落计数

六、Rv2333c促进IL-1β、IL-6 和IFN-γ mRNA的表达

注 IL-1β为白细胞介素1β;IL-6为白细胞介素6;IFN-γ为γ-干扰素。Mock：空白对照组,Ms_Rv2333c：重组耻垢分枝杆菌(实验组),Ms_Vec：空载耻垢分枝杆菌。 ***为P<0.001; **为P<0.01图7～9 Rv2333c促进IL-1β、IL-6 和IFN-γ mRNA的表达。图7为重组耻垢分枝杆菌感染巨噬细胞后IL-1β mRNA表达情况;图8为重组耻垢分枝杆菌感染巨噬细胞后IL-6 mRNA表达情况;图9为重组耻垢分枝杆菌感染巨噬细胞后IFN-γ mRNA表达情况

为探求Rv2333c是否与炎症因子分泌有关,将Ms_Rv2333c和Ms_Vec以感染量MOI=10∶1感染巨噬细胞,6、24和48 h后提取细胞总RNA,检测IL-1β、IL-6 和IFN-γ mRNA表达情况。结果显示,相较于Ms_Vec,Rv2333c在感染早期即可抑制IL-1β mRNA的表达,而感染后期则促进IL-1β mRNA的表达;但在整个感染过程中,IL-6和IFN-γ mRNA的表达均上调(表4和图7～9)。

表4 Ms_Vec和Ms_Rv2333c对巨噬细胞内炎症因子mRNA的影响

七、Rv2333c促进IL-6、NF-κB表达和ERK1/2磷酸化

Ms_Rv2333c和Ms_Vec以感染量MOI=10∶1感染巨噬细胞,在6、24和48 h后收集细胞上清培养液,检测IL-6表达情况。结果显示,相较于Ms_Vec,Ms_Rv2333c在感染巨噬细胞早期即可促进IL-6表达(表5和图10)。

表5 Ms_Vec和Ms_Rv2333c对巨噬细胞内IL-6表达的影响

注 Ms_Rv2333c：重组耻垢分枝杆菌(实验组),Ms_Vec：空载耻垢分枝杆菌。 *为P<0.05图10 Rv2333c促进巨噬细胞IL-6表达

注 Ms_Rv2333c：重组耻垢分枝杆菌(实验组),Ms_Vec：空载耻垢分枝杆菌。NF-κB：核因子激活B细胞的κ-轻链增强;p-ERK1/2：磷酸化细胞外调节蛋白激酶1/2;GAPDH：甘油醛-3-磷酸脱氢酶。 ***：P<0.001。 *：P<0.05图11～13 Rv2333c促进NF-κB表达和ERK1/2磷酸化。图11为蛋白免疫印迹分析Rv2333c对NF-κB和p-ERK1/2表达的影响;图12为Rv2333c促进NF-κB表达的蛋白免疫印迹灰度值分析;图13为Rv2333c促进p-ERK1/2表达的蛋白免疫印迹灰度值分析

为探究Rv2333c是否参与NF-κB途径及MAPK途径。将Ms_Rv2333c和Ms_Vec以感染量MOI=10∶1感染巨噬细胞,在3、6、12和24 h后提取细胞蛋白,用anti-NF-κB、anti-p-ERK1/2和anti-GAPDH抗体检测细胞内蛋白表达情况。结果显示,与Ms_Vec相比,Ms_Rv2333c促进NF-κB 表达和ERK1/2磷酸化(表6和图11～13)。

表6 Ms_Vec和Ms_Rv2333c对NF-κB和p-ERK1/2表达的影响

讨 论

结核分枝杆菌中存在着多种外排泵蛋白,它们往往与抗生素的转运有关联[6-7]。结核分枝杆菌感染机体过程中,首先会被巨噬细胞吞噬,并且会通过逃逸破坏吞噬溶酶体,引发细胞产生炎症等反应[8-9],如通过影响MAPK途径、TNF-α途径、NF-κB 途径和NLRP3炎症复合体途径[10],最终导致巨噬细胞死亡。在逃逸吞噬溶酶体的过程中,各种菌体蛋白,包括膜蛋白、胞质蛋白和分泌蛋白等会发挥不同的生理作用[11]。此外,外排泵在细胞内主要发挥生理作用,如在细菌毒力和适应性反应中发挥作用,而运输抗生素是其次要功能[2,12]。但结核分枝杆菌质子泵Rv2333c在细菌感染宿主过程中,能否对巨噬细胞内MAPK途径、NF-κB途径和NLRP3炎症复合体途径的发生起到重要作用,其分子机制如何?目前相关报道较少。本研究首次证实了Rv2333c参与调控巨噬细胞内NF-κB 和p-ERK1/2 的表达,揭示了结核病临床治疗效果不佳的原因不仅与结核分枝杆菌耐药性相关,更重要的是结核分枝杆菌参与调控宿主细胞免疫反应,其意义在于为临床联合治疗结核病提供新的策略和思路。

结核分枝杆菌在感染巨噬细胞早期即可通过抑制细胞凋亡的方式为细菌在巨噬细胞内的增殖创造条件,如结核分枝杆菌Rv3529c[13]。结核分枝杆菌中存在多种外排泵蛋白[14-15],有研究表明,Rv2333c在结核分枝杆菌感染巨噬细胞的模型中表达水平会增加,并推测Rv2333c对细菌在巨噬细胞内的存活很重要[16-17]。而本研究细胞毒性检测结果证实Rv2333c在感染发生早期即可抑制细胞调亡,但有趣的是,通过巨噬细胞内菌落计数,发现Rv2333c并不影响细菌自身在巨噬细胞内的存活。由此可以推测,Rv2333c可能通过影响细胞的某些通路变化来发挥作用。

巨噬细胞的调亡与其炎症反应及通路的变化有关。Rv2333c在感染发生早期可抑制细胞死亡,但在侵染中后期则可通过促进IL-1β mRNA表达促进炎症反应的发生,以达到菌体扩散进一步感染机体的目的。在炎症反应中,成熟体IL-1β外排是一个引发细胞死亡的重要信号[3,18],而IL-6和IFN-γ则在促进巨噬细胞清除分枝杆菌方面发挥作用[19]。由此说明,Rv2333c参与调控细胞的炎症反应,以协助结核分枝杆菌在细胞内的存活。与此同时,巨噬细胞中NF-κB可以通过调控溶酶体酶释放到吞噬体的转运过程中,从而降低其杀伤病原体的能力,而阻断NF-κB激活途径可以降低溶酶体和巨噬细胞吞噬溶酶体的正常融合现象[20]。因此,靶向NF-κB途径可能是治疗结核病的一种策略[21]。而研究发现,Rv2333c可以促进IL-6和NF-κB表达,由此推测Rv2333c可以通过参与炎症因子产生的过程协助细菌免疫逃逸,使细菌进入下一阶段的循环感染。一方面,有助于结核分枝杆菌在宿主内的存活,甚至长期潜伏;另一方面,协助结核分枝杆菌宿主体内快速增殖,引起机体产生结核中毒症状。

在MAPK通路中,ERK1/2的磷酸化将会促进NF-κB等因子转入细胞核,进而引发细胞炎症及凋亡的发生[22]。已有研究表明,活化后的ERK1/2进入细胞核参与基因转录水平调控,一方面ERK1/2可抑制FoxO3的转录,抑制细胞凋亡,同时ERK1/2促进一些基因的转录,如p90RSK、c-Fos、N/C-Myc、TIF1A、STAT1/3、ER和ETS等[23-24],而ERK1/2本身可以进入细胞核参与转录调控;另一方面,活化的ERK1/2激活p90RSK进入细胞核参与细胞增殖、蛋白翻译和细胞分化等相关基因转录调控[25]。而且,也有研究报道,结核分枝杆菌Mce2E、Mce3E和Rv3529c等可通过降低上游信号MEK、ERK和IKKα/β的磷酸化水平来阻断ERK和NF-κB信号,从而破坏宿主介导的炎症和免疫应答,提高菌体生存[26]。而Rv2333c是否会同样对其上游信号MEK、ERK和IKKα/β的磷酸化水平有影响,该机制还没有明晰。本研究发现,过表达Rv2333c的耻垢分枝杆菌可以使ERK1/2磷酸化水平明显上升。其意义在于Rv2333c可以通过宿主转录调控协助结核分枝杆菌在胞内的存活及免疫逃逸,进而提高结核分枝杆菌的致病性。

综上说明,Rv2333c参与并调控NF-κB和MAPK信号通路,提高结核分枝杆菌致病性。另外,Rv2333c自身拥有14个跨膜区,其暴露在膜外的区域蛋白可能参与调控宿主细胞免疫反应,但其具体机制仍需进一步探究。结核分枝杆菌在被巨噬细胞吞噬后会被运送至肺部淋巴结,进而激活T细胞。T细胞反应主要由T细胞表位结合的抗原引起,而可以引起T细胞免疫反应的抗原表位都具有作为治疗结核病药物或疫苗的可能性。同时,结核分枝杆菌Rv2333c在菌体耐药性方面发挥了重要作用,若是能够早日探究阐明Rv2333c在协助细菌免疫逃逸方面的分子机制,将更加有助于理解和解析其在菌体内的功能,以及为临床结核病治疗提供强有力的理论支撑。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

作者贡献何萍：设计实验、实施研究及文章撰写;王怡婷：实验数据统计学分析;宋泽萱：数据绘图;夏辉和王胜芬：对文章的知识性内容作批评性审阅;贺文从：Western blotting实验数据收集;郑扬：RT-PCR实验数据采集及处理;赵雁林：设计实验、对文章的知识性内容作批评性审阅