超临界CO2 萃取桑枝黄酮工艺的研究

李文馨，殷 勇，孙惠桉，陈 菊，陆 敏，王雪雅

（1.贵州省农业科学院蚕业研究所，贵州贵阳 550006；2.贵州省农业对外经济合作中心，贵州贵阳 550001）

桑枝（Ramulus mori）属于桑科桑属植物桑（Morus albaL.）的一年生干燥嫩枝，属于原卫生部于2002 年发布的《关于进一步规范保健食品原料管理的通知》（卫法监发〔2002〕51 号）中《可用于保健食品的物品名单》，收录在《中国药典》中，具有祛风湿、利关节、益肺气等作用[1-2]。根据相关文献报道，桑枝富含多种生物活性成分，如黄酮、香豆素、多糖以及生物碱等，其中黄酮类成分是主要成分之一[3-4]。

根据其基本结构黄酮可分为黄酮类、黄酮醇类、二氢黄酮类、二氢黄酮醇类以及其他黄酮类等，广泛分布于植物的叶片、花和果实中，部分与糖结合成苷类形式存在，少部分以游离形式存在[5]。近几年，黄酮类物质的研究相对较多，对心血管系统、神经系统、内分泌系统等具有药理作用[6-7]。

超临界萃取技术是以超临界流体的性质为基础，在高压下，使需要萃取的溶质溶解于超临界流体中，再进行降压，或者升温，降低溶质的密度，从而降低在超临界流体中的溶解度，使其从流体溶液中析出，实现萃取指定溶质的技术[8]。近年来被普遍应用于医药、生物、食品和化学等领域，具有处理温度低、提取率高、对人体无害和安全稳定等特点[9-11]。与其他提取方法相比，存在明显优势[12]。目前，关于桑枝中总黄酮的提取方法主要是浸提法和超声波提取法[13-14]。

本文以桑枝为研究对象，采用超临界CO2萃取技术，以桑枝总黄酮得率为指标，通过正交试验确定桑枝黄酮萃取的工艺参数，可为桑枝黄酮的综合利用和开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

桑枝：市售，采收地为安徽省亳州地区，将干燥后的桑枝粉碎过筛，取30 ～40 目为桑枝粉，冷藏备用；CO2：纯度≥99.9%；NaNO2、Al(NO3)3、NaOH、无水乙醇：国药集团化学试剂有限公司；芦丁标准品：北京索莱宝科技有限公司。

1.2 主要仪器与设备

SFE-4 超临界CO2萃取仪：美国应用分离公司；Multiskan GO 酶标仪：Thermo Fisher Scientific 公司；Centrifuge 5424 离心机：Eppendorf 公司；BSA224SCW 电子分析天平：德国赛多利斯公司；DHG-9240A 电热鼓风干燥箱：上海煜南仪器有限公司；FW135 粉碎机：天津市泰斯特仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 超临界CO2萃取

准确称取桑枝粉2 g 装入萃取釜中，达到设定温度时，加压调至设定值，设定CO2流速为3 L·min-1，以无水乙醇作为夹带剂，调整夹带剂流速，循环萃取。待萃取完毕，收集萃取液，过滤定容，待测。分别考察不同的萃取温度、萃取压力、萃取时间和夹带剂流速对于桑枝总黄酮得率的影响。

1.3.2 单因素试验

分别考察萃取温度（30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃和50 ℃）、萃取压力（40 MPa、45 MPa、50 MPa、55 MPa和60 MPa）、 萃取时间（30 min、45 min、60 min、75 min 和90 min）、 夹带剂流速（0.500 mL·min-1、0.625 mL·min-1、0.750 mL·min-1、0.875 mL·min-1和1.000 mL·min-1）对桑枝总黄酮得率的影响。

1.3.3 正交试验

为全面考察超临界CO2萃取中各因素的影响，在单因素试验结果的基础上开展正交试验，以萃取温度、萃取压力、萃取时间和夹带剂的流速为考察因素，以桑枝总黄酮的得率为指标，采用4 因素3 水平正交试验进行优化，确定超临界CO2萃取桑枝黄酮的最佳工艺条件，试验的各因素水平见表1。

表1 正交试验因素水平表

1.3.4 总黄酮得率的测定

（1）标准曲线的绘制。准确称取芦丁标准品，加入无水乙醇定容到50 mL，摇匀，即为芦丁标准溶液。准确吸取标准溶液0 mL、1 mL、2 mL、3 mL、4 mL 和5 mL，置于10 mL 容量瓶中，加入5%NaNO2溶液0.5 mL，混合均匀后静置5 min，加入10% Al(NO3)3溶液0.5 mL，混合均匀后静置5 min，再加入4% NaOH 溶液4 mL，以50%乙醇溶液定容，摇匀后放置15 min，测定OD510nm，横坐标为芦丁浓度，纵坐标为吸光度值，绘制标准曲线[15]。

（2）桑枝总黄酮含量的测定。准确吸取待测样品液1 mL，按照上述步骤测定吸光度值，总黄酮含量根据标准曲线的回归方程计算。

（3）桑枝总黄酮得率的计算。根据总黄酮含量计算桑枝中总黄酮得率，计算公式为

式中：c为提取液总黄酮含量，mg·mL-1；v为提取液定容后的体积，mL；m为桑枝粉的质量，mg。

2 结果与分析

2.1 标准曲线

标准曲线的线性回归方程与系数如图1 所示。

图1 芦丁标准曲线图

2.2 单因素试验结果

2.2.1 萃取温度对桑枝总黄酮得率的影响

由图2 可知，随着温度的升高，桑枝总黄酮得率呈现先升高后降低的趋势，当温度达到40 ℃时，桑枝总黄酮得率最大。在超临界CO2萃取过程中，温度的影响主要表现在两个方面。①随着温度的升高，CO2流体密度降低，溶解能力下降，不利于萃取；②在一定压力条件下，温度的升高可提高溶质在CO2中的热运动，从而增大相应的溶剂蒸汽压，使得萃取物的挥发性扩散系数增强，有利于萃取[16-17]。因此，确定最佳萃取温度为40 ℃。

2.2.2 萃取压力对桑枝总黄酮得率的影响

由图3 可知，随着压力的升高，桑枝总黄酮得率总体呈上升趋势，且在50 MPa 时得率最高，一般认为增加压力，在增加CO2的密度的同时还会减少传质距离，有利于传质效率的增加[18]。当压力升高到55 MPa 时，总黄酮得率出现下降趋势，随着压力的升高，流体对流性和扩散性下降，传质速率降低[19]。压力的增大也会促进基质的溶胀，从而加快有效成分向外扩散的速率，促进萃取过程中的传质[20]。同时，萃取压力较高，组织会发生形变、疏松，细胞壁受到破坏，通透性提高，使总黄酮溶出性增强，这也可能是压力达到60 MPa 时，总黄酮得率出现小幅度上升的原因[21]。因此，确定最佳萃取压力为50 MPa。

图3 萃取压力对桑枝总黄酮得率的影响图

2.2.3 萃取时间对桑枝总黄酮得率的影响

由图4 可知，桑枝总黄酮得率随着萃取时间的延长而增加。萃取时间从30 min 增加到45 min，总黄酮得率增加得比较快，萃取时间大于45 min，得率增加得比较缓慢，这是因为萃取刚开始，CO2流体与桑枝粉颗粒接触不充分，总黄酮得率较低，随着萃取时间的延长，CO2流体与桑枝粉颗粒的混合越来越充分，传质速率提高，桑枝粉中被萃取的总黄酮含量快速增加，从而总黄酮得率增加较快；当萃取达到一定时间后，由于桑枝粉颗粒中剩余的未被萃取的总黄酮含量较少，总黄酮得率不会随着萃取时间的进一步延长而明显增加。因此，确定最佳萃取时间为45 min。

图4 萃取时间对桑枝总黄酮得率的影响图

2.2.4 夹带剂流速对桑枝总黄酮得率的影响

由图5 可知，当夹带剂无水乙醇流速在0.750 mL·min-1时，桑枝总黄酮得率最高。夹带剂流速在一定范围内的增快，有利于总黄酮得率的增加，可推断是在此浓度范围内，夹带剂流速的变快有利于桑枝粉中黄酮类化合物的溶出。但当夹带剂流速达到一定数值后，会缩短桑枝粉与夹带剂的接触时间，影响黄酮类化合物在溶剂中的溶解，降低夹带剂的使用效率，从而降低了总黄酮得率。CO2是非极性物质，这导致其在某些分离过程中存在很大的局限性[22]：对于烃类物质和弱极性的脂溶性物质溶解能力较好，但对于具有强极性的有机化合物则需增大萃取压力或使用夹带剂来实现分离，因而单纯的超临界CO2萃取只适合极性较低的亲脂性物质，黄酮类物质一般极性较大[23]。实验表明，在不加夹带剂的条件下只能得到少量易挥发性的小分子物质，黄酮类化合物的得率极低，因此针对黄酮类化合物的提取，夹带剂的添加十分必要[24]。综上，确定最佳夹带剂流速为0.750 mL·min-1。

图5 夹带剂流速对桑枝总黄酮得率的影响图

2.3 正交试验结果

由表2 可知，每个因素对桑枝总黄酮得率的影响程度都有所差别，且影响程度大小分别为夹带剂流速（D）＞萃取压力（C）＞萃取温度（A）＞萃取时间（B），根据各因素影响水平选取各因素的最佳水平A2B2C1D2，即萃取温度40 ℃、萃取时间45 min、萃取压力45 MPa 以及夹带剂流速0.750 mL·min-1。

表2 正交试验结果与极差分析表

由表3 可知，萃取温度、萃取时间、萃取压力和夹带剂流速对桑枝总黄酮得率均有极显著影响，由F值可得出各因素对桑枝总黄酮得率显著性影响的顺序为夹带剂流速、萃取压力、萃取温度和萃取时间，这与极差分析的结果一致。

表3 正交试验方差分析结果

按优选的工艺进行验证实验，平行操作3 次，桑枝总黄酮得率平均值为2.4817 mg·g-1，RSD 值为3.491%，高于表2 中的其他组合，表明该工艺能较好地提取桑枝总黄酮，为最佳萃取条件。

3 结论

本文选择超临界CO2萃取桑枝总黄酮，采用正交试验进行工艺优化。结果表明，超临界CO2萃取桑枝黄酮的最佳工艺条件为萃取时间45 min、萃取温度40 ℃、萃取压力45 MPa 和夹带剂流速0.750 mL·min-1，在此条件下，桑枝总黄酮得率为2.481 7 mg·g-1，其中夹带剂流速对桑枝总黄酮得率的影响最为显著，萃取压力次之，萃取温度和萃取时间的影响相对较小。