ATP 生物发光技术用于食品接触表面清洁效果评价的验证研究

赵 嵩

（马鞍山市食品药品安全检查中心，安徽马鞍山 243000）

腺嘌呤核苷三磷酸（Adenosine Triphosphate，ATP）又称三磷酸腺苷。ATP 是一切生命体能量的直接来源，普遍存在于动植物、细菌、真菌细胞和食物残渣中，而无生命的碎屑物质中不存在ATP[1]。生物活性物质中的ATP含量是相对恒定的，借助“荧光素-荧光素酶”发光反应可对ATP 进行定量测试，从而反映出生物细胞量的残留。ATP 与荧光素反应发出的荧光强度（Relative Light Unit，RLU）与活细胞数量基本呈正比例关系[2]。荧光值越高，表明ATP 的量越多，也就意味着表面的残留物越多，清洁状态越差。因此，ATP 检测法就被用来快速检验物品表面是否洁净。

RLU 值越高代表存在微生物污染风险的可能性越大，但ATP 不能替代微生物涂抹检测，一般ATP的灵敏度可达到10-15mol ATP 标准物质（有的品牌甚至更高），以细菌为例基本也要达到103才能达到ATP 的检测灵敏度[3]。研究表明，只有纯微生物培养物而没有任何食物残渣的情况下，荧光强度（RLU）和菌落数（Colony-Forming Units，CFU）呈很好的正相关关系[4]。

ATP 生物发光技术由于具有操作简单、快速、方便的特点，能够简单快速验证清洁消毒效果而被广泛应用于食品、制药、医疗和养殖等行业。随着ATP 生物发光技术的普及，市场也涌现了大量的ATP 卫生监测系统品牌，如3M、海净纳、龟甲万、天隆、美正、巅峰、绿洲等品牌，其价格和性能差异较大，也造成了用户选择的困惑。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

两个品牌ATP 卫生监测系统（包括ATP 荧光检测仪和表面ATP 采样拭子）；Pipet-lite 移液枪（美国RAININ 公司）；sx500 高压灭菌锅（日本TOMY 公司）；ATP 标准品（Merck，货号：A1852-1VL）、金黄色葡萄球菌（ATCC 6538）、大肠杆菌（ATCC 25922）、啤酒酵母菌（ATCC 10231）。

1.2 使用方法

从2 ～8 ℃环境中取出ATP 表面采样拭子，放置10 ～20 min 使其恢复至室温状态。撕开包装袋，取出采样拭子。拔出含有润湿棉签的手柄，若涂抹表面，则按Z 字形涂抹待测表面10 cm×10 cm 的区域；若检测ATP 液体标准品，则将20 μL 待测标准品滴加至棉签上。后将棉签插回拭子内并按下，使其与底液接触，将检测管左右摇晃5 ～10 s，充分混匀后，插入对应品牌的ATP 荧光检测仪，点击快速检测即可。

1.3 标准品验证方法

1.3.1 灵敏度

灵敏度是验证一个系统/方法的重要性能指标。先进行阴性值检测，来确定ATP 的本底值。两种品牌分别取6 支拭子，无需取出棉签，直接按下手柄使棉签与反应液接触，按照1.2 进行操作。灵敏度验证方法为取ATP 标准品，稀释多个浓度梯度，取1×10-13mol和1×10-15mol 两个浓度，按照1.2 进行分别检测，重复8 次。对比不同ATP 标准品浓度检测值与阴性值，与阴性有显著差异的最低检测浓度为其灵敏度。

1.3.2 衰减率

ATP 反应激发后，其荧光信号会随时间的延长逐步衰减，考虑到检测人员在现场检测的过程中易受外界因素的影响，衰减过快可能会影响检测结果。衰减率的验证方法为测定拭子在5 min 内的荧光检测值衰减率，吸取20 μL 不同浓度梯度ATP 标准品稀释液，测定两个品牌的ATP 在反应开始后5 min 内的荧光衰减率，分别在反应1 min、2 min、3 min、4 min 和5 min 时进行读值。

1.3.3 重复性

精密度是保证获得良好准确度的先决条件，一般情况下，测量精密度不好，就不可能有良好的准确度，而重复性是精密度的一个重要度量方式。取一份高浓度（1×10-13mol）ATP 标准品稀释液，分别检测两个品牌ATP 在同一浓度下的重复性，检测方法参考1.2。同一浓度ATP 标准品重复测试10 次，计算10 次结果的相对标准偏差（Relative Standard Deviation，RSD），重复性用RSD 表示。

1.4 实际检测效果验证方法

1.4.1 标准菌株检测

选取较为常见的革兰氏阳性细菌（大肠埃希氏菌，ATCC 25922）、革兰氏阴性细菌（金黄色葡萄球菌，ATCC 6538）和真菌（酵母菌，ATCC 10231），分别检测两个品牌ATP 对不同菌体的检测灵敏度。

取新鲜菌液，稀释至10-1、10-2、10-3、10-4和10-5梯度，从两个品牌的ATP 表面采样拭子中取出棉签，用移液枪准确移取20 μL 菌液滴于棉签头上，等待30 s，然后将棉签插回检测管内并按下，使其与底液接触，将检测管左右摇晃5 ～10 s，插入对应的ATP 荧光检测仪，等待30 s，开始检测。将得到的荧光值与菌落数一一对应。把不同浓度菌液的检测荧光值与ATP 拭子自身阴性值进行对比，有显著差异的最低浓度即为菌液的检测灵敏度。

1.4.2 实际表面检测

对桌面进行清洁消毒后，将桌面划分为相邻的20 块10 cm×10 cm 的面积，分别用2 个品牌的ATP进行检测，操作方法参照1.2。

2 结果与分析

2.1 灵敏度验证结果

由表1 可知，在标准品浓度为1×10-15mol 的 ATP水平上，两个品牌ATP 仍能检出RLU 值，且结果与阴性有显著差异；10-15mol ATP 浓度下，品牌一检测值约是品牌二的1.8 倍，阴性值约为1.5 倍，倍数关系基本一致，由于在10-15mol ATP 浓度的荧光值与阴性荧光值有较大差异，故二者的检测灵敏度一致，均为10-16mol ATP。

表1 品牌一ATP 卫生监测系统灵敏度验证结果

2.2 衰减率验证结果

采用两个品牌的ATP 卫生监测系统检测不同浓度ATP 标准溶液，由表2 可知，品牌一在浓度1×10-13mol 反应第5 min 时荧光值是最高荧光值的95%；在浓度1×10-15mol 反应第5 min 时，荧光值是最高荧光值的97%。品牌二在浓度1×10-13mol 反应第5 min 时荧光值是最高荧光值的94%；在浓度1×10-15mol 反应第5 min 时，荧光值是最高荧光值的89%。从数据上看，两个品牌的衰退率都满足实验要求（25%以内）[5]，但品牌一的衰减率表现更佳。

表2 ATP 卫生监测系统衰退率验证结果

2.3 重复性验证结果

在同浓度ATP 水平下，两个品牌ATP 卫生监测系统10 次检测结果的RSD 均为9%，偏差值小于15%，均能满足实验要求，详见表3。

表3 ATP 卫生监测系统重复性验证结果

2.4 标准菌株验证结果

采用金黄色葡萄球菌（ATCC6538）、大肠杆菌（ATCC25922）、白色念珠菌（ATCC10231）3 种常见菌株，在不同菌株浓度下进行ATP 的验证。结果显示，两个品牌的ATP 卫生监测系统的检测值显示出稳定的倍数关系，具体验证结果见表4、表5、表6，且随着菌株浓度的降低，检测值均呈现较好的梯度关系。菌株在高浓度下，检测值或存在偏低情况，与低浓度不完全呈线性关系，但影响较小。

表4 金黄色葡萄球菌（ATCC6538）测试结果

表5 大肠杆菌（ATCC25922）测试结果

表6 白色念珠菌（ATCC10231）测试结果

2.5 实际表面检测结果

选取同一桌面的相邻区域，分别用两个品牌的ATP 表面采样拭子进行涂抹取样和检测，并计算其RSD。从表7 结果可以看出，两个品牌的检测值及其趋势表现基本一致。

表7 两个品牌实际表面检测结果

3 结论

通过上述验证，两个品牌的ATP 卫生监测系统灵敏度一致，均为1×10-16mol，在衰减率、重复性测试上表现基本一致，两个品牌在菌株检测和实际表面样品检测中，检测结果与线性趋势基本一致，说明两个品牌的ATP 卫生监测系在菌株裂解效力和检测灵敏度上有很好的一致性。在实际验证中，用户可根据以上验证方案，选择重复性和衰减率更佳的品牌，至于灵敏度，可根据用户对洁净度要求情况来选择，此外还需要结合性能和价格综合考虑，最终筛选出最合适的ATP 卫生监测系统。