膜性肾病靶抗原与分子标志物研究进展

陈子哥 李 懿 综述 鲍 浩 审校

［作者单位］南京大学医学院附属金陵医院(东部战区总医院)硕士研究生(陈子哥,李 懿) 国家肾脏疾病临床医学研究中心(南京,210016)

膜性肾病(MN)是一种与免疫系统密切相关的肾小球疾病,从2003—2006年(10.4%)到2011—2014年(24.1%),MN在我国原发性肾小球肾炎肾活检病例中占比显著增加[1]。其发病机制在于体内产生针对肾小球足细胞特定抗原的自身抗体,两者形成免疫复合物。免疫复合物在肾小球基膜(GBM)的沉积,可致补体系统激活,使足细胞损伤,肾小球滤过膜通透性增加,出现肾病综合征。持续的足细胞损伤伴随炎症反应,使患者肾功能逐渐减退[2]。随着高通量质谱和测序技术的应用,MN的靶抗原研究领域取得了重大进展。M型磷脂酸酯酶A2受体(M-type phospholipase A2 receptor,PLA2R),是最常见的MN靶抗原,70%～80% 的MN患者血清中可检出抗PLA2R抗体[3]。随后又相继发现含血小板反应蛋白1型结构域7A(THSD7A)、exostosin 1/exostosin 2(EXT1/EXT2)、神经表皮生长因子样蛋白1(NELL-1)、信号素3B(SEMA3B)、神经细胞黏附分子1(NCAM1)、丝氨酸蛋白酶1(HTRA1)、原钙黏蛋白7(PCDH7)等[4]。研究新型靶抗原有助于深入理解MN复杂的病理生理机制,并为开发新的诊疗手段提供理论依据[5-6]。此外,MN患者尿液和血液标本中一些蛋白质、代谢物和非编码RNA(ncRNA)水平与健康对照存在显著差异,这些分子标志物在MN的诊断、病情监测和预后评估中具有显著意义。本文就MN靶抗原和分子标志物识别与鉴定的研究进展作综述。

MN靶抗原识别与鉴定

MN靶抗原的识别涉及一系列步骤,旨在从复杂的生物样本中确定并验证特定的抗原分子,包括选择合适的生物样本,进行提取或纯化后使用相关抗体捕获和沉淀目标抗原,使用液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)等技术对沉淀蛋白进行分析,并与蛋白质数据库匹配以确定潜在抗原,进一步在不同的生物样本或模型中验证靶抗原的存在和功能。靶抗原的鉴定包括使用免疫组织化学、免疫荧光显微镜检测等证实该抗原及其在肾小球表达位置、是否存在循环抗体等。对已识别与鉴定的MN靶抗原特征的总结见表1。

PLA2R的识别与鉴定MN作为一种自身抗体介导的肾小球疾病,由于靶抗原未知,血清学诊断方法一直难以确定。2009年,Beck等[7]假定MN患者血清中存在针对正常人肾小球蛋白提取物的抗体,将两者进行免疫印迹分析,在37例特发性MN(IMN)患者中有26例(70%)的血清样本与肾小球提取物发生结合,蛋白条带分子量为185 kD。而30例正常对照、15例非MN蛋白尿患者以及7例其他自身免疫性疾病患者的血清在相同条件下均未与肾小球提取物发生反应。8例继发性MN患者血清样本均对185 kD抗原无反应性。经N-糖苷酶F去糖化处理后,结合的蛋白条带迁移至145 kD。切取蛋白条带上185 kD和145 kD对应的区域,进行LC-MS/MS。假定靶抗原对应的肽序列在185 kD和145 kD样本中均可鉴定出,据此使用相应抗体和重组抗原进行免疫印迹分析,发现抗PLA2R抗体识别出的条带分子量与MN患者血清识别的肾小球蛋白条带相同。用MN患者血清免疫印迹检测重组人PLA2R,检测到较肾小球提取物略小的条带。而当两种样本去糖化处理后,它们迁移到相同的位置,这表明PLA2R人体蛋白和重组蛋白的糖基化略有差异。MN患者的血清样本与转染无关质粒的细胞提取物无反应性,证明结合反应特异性。鉴定出185 kD蛋白的MN血清样本均与重组PLA2R结合反应,进一步证实185 kD蛋白为PLA2R。

使用抗PLA2R抗体染色,通过免疫荧光显微镜观察到PLA2R表达于足细胞表面。通过聚合酶链式反应和免疫印迹检测培养的人足细胞,进一步证实足细胞表达PLA2R。免疫荧光染色未显示系膜细胞表达PLA2R。从4例IMN患者的肾活检标本中洗脱IgG,将其与肾小球蛋白和重组PLA2R反应,证实MN患者肾活检标本中的IgG能与PLA2R发生结合反应。荧光染色共聚焦显微镜分析显示,PLA2R与IgG4共定位,呈颗粒状分布于足细胞表面。在MN患者的血清样本和健康对照的血清样本均未检出PLA2R,聚乙二醇沉淀或Protein G免疫沉淀也未检出循环中的PLA2R-IgG免疫复合物。

THSD7A的识别与鉴定2014年,Tomas等[8]筛选118例IMN患者的血清样本,与肾小球提取物免疫印迹分析,44例抗PLA2R阴性的MN患者中6例患者的血清样本,识别出一种大小约为250 kD的蛋白。在波士顿队列中,110例抗PLA2R阴性的MN患者中9例患者的血清样本识别出该250 kD的蛋白,而255例抗PLA2R阳性的MN患者血清与250 kD蛋白均无反应。切取与免疫印迹信号相对应的凝胶区域,通过质谱分析,并根据新鉴定抗原分子质量、糖基化和肾小球表达等特征生成候选蛋白列表,使用相应特异抗体检测候选抗原,最终确定了250 kD的蛋白为THSD7A。使用抗THSD7A特异性抗体对肾活检样本进行免疫荧光染色,显示THSD7A在肾小球中呈显著的线性表达。THSD7A的染色定位与位于足细胞裂孔膜的nephrin非常相似,且这两种分子显著共定位,提示THSD7A位于足细胞足突附近。用抗IgG1～IgG4抗体检测THSD7A自身抗体IgG亚型,证实IgG4是血清抗THSD7A的主要IgG亚型。在循环中未检出可溶性THSD7A或THSD7A免疫复合物。将抗THSD7A抗体注射到小鼠体内,会引起严重的肾病综合征,表现为蛋白尿、水肿和高脂血症[17]。

EXT1/EXT2的识别与鉴定2019年,Sethi等[9]对7例肾活检PLA2R阳性MN和15例PLA2R阴性MN进行激光捕获显微切割联合质谱分析(LMD-MS)以鉴定未知抗原,检测到5例PLA2R阴性MN患者肾小球中存在EXT1和EXT2,EXT1的平均总谱数为65.3±34.6,EXT2的平均总谱数为83.4±38.4,并通过免疫组织化学染色证实。对209例PLA2R阴性MN患者IHC染色显示,21例患者EXT1/EXT2阳性;而40例PLA2R阳性MN患者染色均阴性。在EXT1/EXT2相关的MN中,四类IgG均被检测到,其中IgG1是主要亚型。26例EXT1和EXT2阳性患者,肾组织免疫组化染色显示该抗原沿GBM呈颗粒状分布,系膜、包囊壁未见染色;其中9例患者诊断狼疮性肾炎。对验证性队列IHC染色显示,16例PLA2R和THS7DA阴性MN患者中3例EXT1/EXT2阳性,18例V型狼疮性肾炎中8例EXT1/EXT2阳性,14例V+Ⅲ/Ⅳ型狼疮性肾炎中1例EXT1/EXT2阳性。重组蛋白与兔抗人EXT1/EXT2血清有较强的反应性,但与检测的7份患者血清均无反应性,显示在这些血清样本中未检出EXT1/EXT2循环抗体。

NELL-1的识别与鉴定2020年,Sethi等[10]使用激光捕获显微切割35例PLA2R阴性的MN肾小球,然后进行质谱分析,6例患者肾小球组织中NELL-1具有高光谱计数,平均每例的总谱计数为63.1±21.6。23例PLA2R阳性的MN患者肾小球中质谱分析未检出NELL-1。对另外91例PLA2R阴性MN的免疫组化染色,检测出23例NELL-1阳性病例。在NELL-1阳性MN肾小球组织中检测到四类IgG,其中IgG1是含量最多的亚型。29例阳性病例免疫组织化学显示NELL-1沿GBM呈明亮的颗粒状分布,未见明显系膜染色。共聚焦显微镜检测显示,NELL-1和IgG沿GBM共定位,进一步证实上皮下沉积物含有NELL-1和IgG。5例阳性患者血清非还原条件下均对NELL-1有反应性,说明血清中存在循环抗NELL-1抗体。

SEMA3B的识别与鉴定同年,Sethi等[11]通过LMD-MS在70例PLA2R阴性MN患者肾小球中检测到2例患者SEMA3B阳性。后续筛选90例患者又发现1例SEMA3B阳性。3例SEMA3B阳性患者平均总谱计数为23.7±16.5,免疫组织化学证实3例患者SEMA3B染色阳性。进一步研究发现SEMA3B相关MN患者儿童为多,在59例儿童MN患者中检测到6例SEMA3B阳性。阳性病例免疫组织化学染色显示SEMA3B沿GBM呈颗粒染色,未见明显系膜染色。SEMA3B阳性颗粒与GBM上的IgG颗粒状染色一致。共聚焦显微镜检测确定SEMA3B和 IgG在GBM上共定位。使用人SEMA3B重组蛋白在非还原和还原条件下对5例患者血清进行免疫印迹分析,其中4例在还原条件下对SEMA3B有反应性,存在循环抗SEMA3B抗体。

PCDH7的识别与鉴定2021年,Sethi等[12]通过串联质谱在10例MN患者的肾小球中检测到蛋白PCDH7,平均总谱计数为13.2±6.6。阳性病例免疫组织化学染色显示PCDH7均沿GBM呈亮颗粒状染色,2例可见节段性毛细血管壁PCDH7染色,未见明显系膜、包囊壁染色。共聚焦显微镜检测显示PCDH7和IgG沿GBM共定位。使用重组人PCDH7进行了免疫印迹分析,在非还原条件下,小鼠抗人PCDH7在约140 kD处检测到PCDH7条带;用6例PCDH7阳性MN患者的血清检测到相同的条带,证实血清中存在循环抗PCDH7抗体。而PLA2R阳性MN、IgA肾病和微小病变肾病患者血清中未检出PCDH7抗体。

NCAM1的识别与鉴定Caza等[13]将13例抗原未知的MN肾小球的进行LMD-MS分析,并与12例已知抗原的MN(包括8例PLA2R和4例EXT1/EXT2阳性MN)进行比较,以确定未知抗原蛋白。其中3例患者与12例已知抗原MN肾小球的质谱图谱进行比较,差异倍数最大的蛋白均为NCAM1;且该3例均为狼疮性肾炎患者。共聚焦显微镜检测显示,阳性的MN患者NCAM1沿肾小球毛细血管袢分布,与IgG基本共定位。后续免疫荧光染色显示,212例膜性狼疮性肾炎中12例患者NCAM1阳性,101例IMN患者中2例NCAM1阳性。2例患者的血清非还原条件下与重组NCAM1反应,在120 kD处检测到条带,说明部分狼疮性肾炎患者存在循环抗NCAM1抗体。

HTRA1的识别与鉴定Al-Rabadi等[14]使用MN患者的血清样本,通过免疫印迹检测肾小球蛋白提取物,3例MN患者中检测到约50 kD的条带。用PLA2R阳性患者和健康对照者的血清均未检出该抗原。使用IgG4对肾小球提取物进行免疫沉淀,切取50 kD凝胶区域后质谱分析,鉴定出HTRA1蛋白。兔抗HTRA1抗体对肾小球蛋白免疫印迹等实验,证实患者血清识别的条带是HTRA1。通过免疫荧光染色,观察到足细胞中HTRA1呈核周点状或网状分布。正常人肾的HTRA1免疫组化染色显示足细胞胞体中度染色。用胶体金标记抗体在超微结构水平研究HTRA1在小鼠肾脏中的定位,显示HTRA1存在于足突的囊泡结构和足突间隙。通过对相关血清样本的IgG免疫沉淀分析,未检出HTRA1-IgG的循环免疫复合物。

β受体蛋白3(TGFBR3)的识别与鉴定Caza等[15]在MN患者肾活检组织中通过免疫沉淀洗脱后质谱分析(IP-MS),在2例膜性狼疮肾炎活检标本中鉴定出TGFBR3,免疫荧光染色也证实TGFBR3蛋白在这2例患者的沉积物中存在。通过共聚焦显微镜发现,TGFBR3与肾小球免疫沉积物中的IgG共定位。后续对199例膜性狼疮肾炎患者活检标本免疫荧光染色,其中11例(6%)患者TGFBR3阳性;而152例PLA2R阴性MN患者肾组织TGFBR3染色均阴性。TGFBR3相关膜性狼疮肾炎病例中IgG亚型染色未呈现出一致的模式。在相关病例的血清中未检出抗TGFBR3循环抗体。

神经元源性神经营养因子(NDNF)的识别与鉴定Sethi等[16]对250例PLA2R阴性MN患者肾活检样本进行LMD-MS,发现在3例患者(1例梅毒相关MN)NDNF阳性。后续验证分析5例梅毒相关MN均为NDNF阳性。免疫组化显示NDNF沿GBM呈颗粒状定位。共聚焦显微镜显示NDNF和IgG沿GBM共定位,少量颗粒状沉积于系膜区。PLA2R阳性MN和EXT 1/2阳性MN患者中均未检出NDNF。兔抗人NDNF检测NDNF测得的条带,与NDNF相关MN活检样本洗脱的IgG检测NDNF的条带相同。IgG亚型显示沿GBM分布的IgG1、IgG2和IgG3,但未见IgG4染色。

其他可能的靶抗原Caza等[18]使用免疫沉淀从142例PLA2R/THSD7A/EXT/NELL-1四阴性病例和278例已知抗原类型病例的冷冻活检组织提取免疫复合物,进行质谱分析,并通过免疫荧光染色与IgG共定位,确定潜在的抗原。在已知抗原类型的278个病例中未检出新抗原,在142例四阴性病例中识别出Ficolin3(FCN3)、巨噬细胞甘露醇受体1(CD206)、早期内质网抗原1(EEA1)、癫痫相关6同源物2(SEZ6LZ)、利钠肽受体3(NPR3)、巨噬细胞刺激因子1(MST1)、血管素(VASN)阳性各1例。通过免疫荧光染色与IgG共定位的方法,在165例PLA2R阴性IMN的队列中识别出1例SEZ6L2、7例VASN、6例EEA1、5例MST1与1例FCN3,在142例膜性狼疮肾炎患者的队列中识别出4例VASN、7例EEA1、2例MST1与4例FCN3。共发现七种潜在的靶抗原包括FCN3、CD206、EEA1、SEZ6L2、NPR3、MST1、VASN。这些蛋白在已知抗原类型的病例中没有富集。

MN的分子标志物

基于质谱分析技术的蛋白质组和代谢组分析检测出MN与健康对照尿液和血液标本中多种蛋白和代谢物水平的差异。基于测序技术的转录组学分析提示,ncRNA在MN患者的尿液、血液和肾脏中的表达水平与健康对照不同。这些生物标志物尚未得到广泛验证,但它们的发现为MN的诊断和病情监测提供了依据和新的方向,深化了对MN分子机制的理解。

蛋白标志物2015年,Root等[19]利用同位素标记技术发现,MN患者尿液微泡溶酶体膜蛋白2(LIMP2)水平是正常对照的2倍。2017年Pang等[20]利用串联质谱标签(TMT)系统结合LC-MS/MS,分析和比较IMN患者和健康对照者的尿液蛋白,鉴定出249种蛋白质,其中α-1-抗胰蛋白酶(A1AT)和afamin (AFM)在IMN患者尿液中含量增加。2020年,Tie等[21]使用了毛细管等电聚焦质谱(CIEF-MS)比较IMN和继发性MN患者的尿白蛋白类型。CIEF-MS检测到继发性MN患者尿白蛋白以三种电荷形式存在(一个碱性峰、一个主峰和一个酸性峰),而IMN患者尿白蛋白仅检测到一个主白蛋白峰,提示尿白蛋白电荷异质性模式检测可用于两者的鉴别。Yu等[22]利用纳米高效液相色谱联合质谱(HPLC/MS)筛选钙调神经磷酸酶抑制剂治疗后IMN缓解组和未缓解组的差异血清蛋白。其中缓解组血清淀粉样A1蛋白(SAA1)水平显著高于未缓解组,提示SAA1是预测IMN患者钙调磷酸酶抑制剂治疗效果的候选标志物。

代谢标志物2017年,Wang等[23]采用气相色谱/质谱(GC/MS)分析63例IMN患者和15例正常对照者尿液中挥发性有机物的含量。发现6种挥发性有机物(胺基甲酸单铵盐、2-戊酮、2,4-二甲基戊醛、叠氮氢、硫脲和4-庚酮)在两者间有显著差异。此外,2019年Taherkhani等[24]通过核磁共振和GC-MS/MS分析了66例MN患者、31例健康对照和72例其他肾病对照的尿液代谢组,发现7种代谢物(α-羟基丁酸、3,4-二羟基扁豆酸、5α-胆甾酮、2-羟基戊二酸内酯、烟酰胺、表前列醇和棕榈酸)可作为MN的诊断指标。

ncRNA标志物2014年,Chen等[25]报道了MN患者外周血淋巴细胞差异表达的微小RNA(miRNA),利用高通量测序技术分析了MN患者和健康对照者外周血淋巴细胞的miRNA表达谱,两组间共发现326个差异表达miRNA。2017年,Li等[26]发现,与健康对照组相比,miR-217在MN血浆与肾组织中表达水平均显著下调,体外上调足细胞miR-217水平可抑制靶基因TNFSF11的表达,保护足细胞。miR-217通过负调控靶基因TNFSF11的表达参与足细胞凋亡。Jin等[27]利用环状RNA(circRNA)芯片技术在IMN患者和健康对照外周血中检测出955个差异表达的circRNA(645个上调,310个下调),其中circ_101319表达上调能用于IMN的诊断。Huang等[28]发现长链非编码RNA(lncRNA)X染色体特异性失活转录物(XIST)在MN小鼠的肾小球和肾小管上皮细胞中表达上调,其表达与MN的严重程度呈正相关。

小结:随着高通量质谱技术和测序技术的迅速发展,MN的靶抗原和分子标志物研究领域取得了重大进展。这些技术不仅能够从复杂的生物样本中精确地识别和验证特定的抗原分子,而且深化了对MN复杂病理生理机制的认识。通过蛋白质组学、代谢组学和转录组学分析方法,发现了包括蛋白、代谢产物、ncRNA在内的MN分子标志物。这些靶抗原和分子标志物可用于疾病诊断和预后评估,也可能成为MN的潜在治疗靶点。一系列潜在的靶抗原与其他生物标志物有待进一步识别、鉴定与广泛验证。这将需要多中心、大样本量的研究,更全面的生物信息学分析和功能实验,以确保这些新发现的临床应用价值和科学合理性。