基于LC-MS/MS技术同时定量分析片仔癀中特征胰酶水解肽△

李文正，刘文静，曹妍，李玮，赵晨，刘丛盛*，宋青青*，宋月林

1.北京中医药大学 中药学院 中药现代研究中心，北京 100248；

2.漳州片仔癀药业股份有限公司，福建 漳州 363000

片仔癀是国家一级中药保护品种，具有清热解毒、凉血化瘀、消肿止痛的功效[1]。现代药理学研究表明，片仔癀具有抗炎、抗肿瘤、保肝等多种作用[2-5]，临床应用广泛。目前已公开的药味包括植物药三七，以及天然麝香、蛇胆和牛黄3 味名贵动物药[4]，其中三七皂苷、麝香酮、胆汁酸等小分子化合物已被深入研究，并作为片仔癀质量标志物用于其质量评价[6-10]。蛋白、多肽等大分子化合物虽也表现出广泛的药理活性，如麝香多肽具有抗炎、抗癌的作用[11-12]，三七中含有抗真菌蛋白[13]，但未对其进行深入分析和研究。

鸟枪法蛋白组学通过酶解样品中的蛋白，采用液相色谱-质谱法（LC-MS）对肽段进行分离鉴定，从而实现蛋白的全谱分析。该策略能够实现复杂样品中蛋白高通量的定性、定量分析[14]，尤其适用于富含大量蛋白的动物类中药的分析。但基于该平台的多肽定量分析灵敏度较差、动态线性范围窄，难以满足样品中种类多且含量差异大的蛋白的全面精准定量分析。三重四极杆（QqQ）-MS 的选择反应监测（SRM）被视为绝对定量的金标准[15]，前后2 个四极杆（Q1、Q3）作为质量过滤器，中间四级杆（Q2）作为碰撞池发生碰撞诱导解离产生碎片离子，设定前体离子和碎片离子分别通过Q1和Q3可以增强选择性，提高灵敏度，定量线性范围更是增加到5 个数量级[15]。然而，SRM 建立的关键在于获得被测物的最佳质谱参数。Skyline 软件能够预测SRM 参数[16]，但受不同分析仪器的限制，其推荐的SRM 参数并不能使所有QqQ-MS 发挥定量优势。本课题组前期建立了在线能量分辨（online ER）-MS，可以在各种QqQ-MS 平台实现不依赖于对照品的质谱参数优化[17-18]，提高了方法的灵敏度，扩宽了线性范围。

本研究基于鸟枪法蛋白组学策略，利用nano LC-Q Exactive HF Orbitrap-MS 结合UniProt 数据库（https://www.uniprot.org/）分析并鉴定片仔癀中蛋白类成分，筛选特征肽，采用online ER-MS 优化质谱参数，建立反相液相色谱（RPLC）-SRM 定量分析方法，测定了11 批片仔癀中的3 个胰酶水解特征肽含量，可为片仔癀的质量标准提升提供参考。

1 材料

1.1 仪器

ME204 型电子分析天平（瑞士梅特勒-托利多仪器公司）；5424R 型离心机（德国艾本德公司）；MQD-S2P 型恒温双层摇床（上海旻泉仪器有限公司）；UltiMate 3000 型纳升级超高效液相色谱系统、Q Exactive HF 型质谱仪（美国赛默飞公司）；LC-20ADXR 型高效液相色谱仪（日本岛津公司）；Qtrap 5500 型质谱仪（美国Sciex 公司）；10 kDa 超滤管（美国赛多利斯公司）。

1.2 试药

二辛可宁酸（BCA）试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；三氯乙基磷酸酯（TCEP，北京博奥拓达科技有限公司）；碘代乙酰胺（美国Sigma 公司）；比伐卢定（上海源叶生物科技有限公司）；胰蛋白酶（美国普洛麦格公司）；碳酸氢铵和尿素（北京化工厂）；质谱级甲酸和乙腈（美国赛默飞公司）；超纯水由实验室Milli-Q 型纯水系统制备；多肽ALSSALHER、TLLEGEESR、VAPLGEEFR 由上海源叶生物科技有限公司合成（纯度≥98%）。

各批片仔癀由漳州片仔癀药业股份有限公司提供（表1），样品存放于北京中医药大学中药学院中药现代研究中心。

表1 11批片仔癀样品信息及其总蛋白质量分数 %

1.3 混合对照品溶液制备

分别取多肽对照品ALSSALHER、TLLEGEESR、VAPLGEEFR 适量，精密称定，用纯水溶解，配制成质量浓度为1 mg·mL–1的储备液。精密吸取各对照品储备液，用纯水制备成终质量浓度均为10 μg·mL–1的混合对照品溶液，用纯水逐级稀释，得到系列质量浓度的对照品溶液，待用。

取比伐卢定适量，精密称定，用纯水配成质量浓度为1 mg·mL–1的内标（IS）储备液，稀释至质量浓度为100 μg·mL–1，待用。

精密吸取各对照品溶液50 μL，分别加入等体积的内标溶液，得到系列质量浓度的含内标的混合对照品溶液。

1.4 供试品溶液制备

精密称定各批片仔癀50 mg，分别加入甲醇1 mL，超声提取30 min，在4 °C、7607×g离心10 min，去上清液；加入50 mmol·L–1碳酸氢铵水溶液1 mL，超声提取30 min，7607×g离心，取上清液，重复操作，合并上清液至4 mL 离心管，冷冻干燥16 h，加入纯水200 μL 复溶，得到片仔癀总蛋白溶液，BCA法测定总蛋白浓度。随后，采用过滤辅助提取法制备片仔癀多肽样品。取一定体积的片仔癀总蛋白溶液（蛋白质量为2.5 mg），在95 °C 加热5 min，放至室温，加入TCEP，尿素补足至300 μL使TCEP终浓度为10 mmol·L–1，在67 °C 加热10 min，然后放至室温。将样品转移至10 kDa超滤管，15 871×g离心30 min后加入100 mmol·L–1碘乙酰胺溶液100 μL，避光反应30 min，加入8 mmol·L–1尿素100 μL，15 871×g离心30 min；加入50 mmol·L–1碳酸氢铵水溶液200 μL，15 871×g离心30 min，重复2次，弃去超滤液；在超滤管中加入胰蛋白酶（胰酶∶蛋白为1∶50），于37 °C、200 r·min–1的摇床中酶解16 h，更换离心管，离心收集超滤液，加入水100 μL，再次离心，收集超滤液，合并2 次超滤液，冷冻干燥，加入纯水100 μL复溶，得到片仔癀酶解多肽样品。吸取上述酶解样品50 μL，加入等体积内标溶液，即得供试品溶液。

1.5 Nano LC-Q Exactive HF Orbitrap-MS分析

采用nano LC-Q Exactive HF Orbitrap MS 系统，分析片仔癀酶解多肽样品。EASY-SprayTM色谱柱（100 mm×0.75 mm，3 μm，美国赛默飞公司）；进样量为2 μL；流动相为0.1%甲酸水（A）-0.1%甲酸乙腈（B），梯度洗脱（0～5.0 min，5%～8%B；5.0～68.0 min，8%～35%B；68.0～75.0 min，35%～50%B；75.0～80.0 min，50%～100%B；80.0～85.0 min，100%B；85.0～85.1 min，100%～5%B；85.1～90.0 min，5%B）；柱温为60 °C；流速为0.5 μL·min–1。质谱条件：电喷雾离子源（ESI），正离子模式，标准化碰撞能（CE）为35%，活化时间为10 ms，MS1全扫描范围m/z350～1500，分辨率为60 000；MS2谱图以FTMS模式采集，扫描范围m/z120～1970，分辨率为7500。

将质谱数据导入MaxQuant 1.6.10，使用Andromeda 肽段搜索引擎及UniProt 数据库检索，参数设置如下：蛋白和多肽假阳性率（FDR）≤1%；酶解方式为胰蛋白酶酶切（Trypsin）/P；酶切遗漏数为2；固定修饰为半胱氨酸烷基化；可变修饰为甲硫氨酸的氧化和蛋白N端乙酰化。

1.6 基于RPLC-SRM的片仔癀特征肽定量分析

采用LC-Qtrap MS/MS系统对片仔癀酶解多肽样品中3 个特征肽进行定量分析。色谱柱为HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.8 μm，美国Waters 公司）；柱温为40 °C；流速为0.2 mL·min–1；进样量为5 μL；流动相为0.1%甲酸水（A）-0.1%甲酸乙腈（B），梯度洗 脱（0～2.00 min，12%～15%B；2.00～3.00 min，15%～30%B；3.00～6.00 min，30%～35%B；6.00～7.00 min，35%～55%B；7.01～12.00 min，12%B）。质谱检测采用ESI正离子模式，离子源参数：气帘气（CUR）为35 psi（1 psi≈6.895 kPa），碰撞气（CAD）为High，喷雾电压为5500 V，温度（TEM）为450 °C，离子源气体1（GS1）为55 psi，GS2为55 psi。

采用online ER-MS 对3 个特征肽离子对的质谱参数进行优化，首先将高分辨质谱采集得到的前体离子与MS2中响应高的子离子配对，进而派生出一系列拟离子对（PITs），给予PITs 阶梯式CE，通过拟合裂解曲线获得最佳碰撞能（OCE）。以VAPLGEEFR 为例，其前体离子[M+2H]2+m/z为509.29，MS2中主要碎片离子m/z为847.43（y7+）、750.38（y6+）、637.30（y5+）、424.22（y72+），构建4对候选离子对m/z509.3→847.4、509.3→750.4、509.3→637.3、509.3→424.2，进而衍生出4 组PITs，如m/z509.3→847.4 可以衍生出1 组PITs 509.290→847.401、509.290→847.402、509.290→847.403等，以2 eV为步长，每个PIT扫描时间为5 ms，采集CE 为6～50 eV 的峰面积。峰面积经归一化处理后，导入GraphPad Prism 8.0软件进行高斯曲线拟合，获得各离子对裂解曲线，曲线顶点对应的CE 即为OCE。VAPLGEEFR 的其余离子对m/z509.3→750.4、509.3→637.3、509.3→424.2，特征肽ALSSALHER、TLLEGEESR 的离子对及相应CE 均按上述方法优化。

1.7 方法学验证

1.7.1 线性和灵敏度 分析1.3 项下各质量浓度混合对照品溶液，以被测成分峰面积/内标峰面积作为纵坐标（Y），以质量浓度为横坐标（X）进行线性回归，得到标准曲线与线性范围。以信噪比（S/N）约为3的被测成分质量浓度作为检测下限（LLOD），以S/N 约为10 的被测成分质量浓度作为定量下限（LLOQ）。

1.7.2 精密度考察 在被测成分的线性范围内，取高（500 ng·mL–1）、中（125 ng·mL–1）、低（31 ng·mL–1）质量浓度进行日内精密度考察，每个质量浓度连续进样6次，记录峰面积。

1.7.3 重复性考察 按1.4 项下方法平行制备5 份供试品溶液，进样分析，记录峰面积。

1.7.4 稳定性考察 取同一份供试品溶液，在4 °C保存，分别在0、2、4、8、12 h 分别进样测定，记录峰面积。

1.8 特征肽的含量测定

按1.4 项下方法制备11 批片仔癀供试品溶液，按1.6 项下方法建立的定量方法进样分析，将峰面积比值（分析物峰面积/内标峰面积）代入标准曲线，求得待测物质量浓度，计算各批片仔癀中目标多肽含量。

2 结果与讨论

2.1 总蛋白样品制备条件的优化

为提高片仔癀样品总蛋白的提取率，本研究分别考察了不同提取溶液（RIPA 裂解液、水、50 mmol·L–1碳酸氢铵水溶液、甲醇和50 mmol·L–1碳酸氢铵水溶液）、料液比（1∶10、1∶20、1∶50）、提取时间（0.5、1.0、2.0 h）对提取效率的影响，通过BCA 法测定总蛋白含量。结果表明，采用50 mmol·L–1碳酸氢铵水溶液提取蛋白效率显著高于RIPA 裂解液和水，同时，采用甲醇提取片仔癀样品，弃去上清液后用50 mmol·L–1碳酸氢铵水溶液提取，与单独使用50 mmol·L–1碳酸氢铵水溶液的蛋白提取效率近乎一致，且进一步减少了基质中脂溶性杂质的干扰；料液比1∶20与1∶50提取得到的总蛋白含量差异无统计学意义，但均高于料液比1∶10时提取总蛋白含量；不同提取时间得到的总蛋白量差异无统计学意义。最终，片仔癀样品提取条件为采用料液比1∶20，先甲醇提取0.5 h 并去除上清液，沉淀用50 mmol·L–1碳酸氢铵水溶液再次提取0.5 h。BCA法测得各批片仔癀总蛋白质量分数见表1。

2.2 片仔癀中蛋白多肽的定性分析

高分辨nano LC-Q Exactive HF Orbitrap-MS 采集的片仔癀酶解多肽样品的总离子流图见图1。使用MaxQuant 1.6.10 软件对采集到的质谱数据进行处理，利用Andromeda 与UniProt 数据库鉴别多肽序列，并归属蛋白来源。最终，从片仔癀胰酶水解多肽样品中鉴定了343个肽段，来源于200个蛋白，以酶和骨架蛋白为主。各蛋白的氨基酸数目为18～4563，匹配肽段数为1～13，序列覆盖率为0.33%～100.00%，鉴定得分前20 的蛋白见表2，其中16 个蛋白来源于牛，1个蛋白来源于人参。

图1 片仔癀酶解多肽样品的nano LC-Q Exactive HF Orbitrap-MS总离子流图

表2 片仔癀中鉴别得分前20的蛋白

在此基础上，选择无修饰、无漏切位点、响应高、稳定性好且长度适宜的特征肽ALSSALHER、TLLEGEESR 和VAPLGEEFR 进行定量分析。ALSSALHER 来源于酶（alpha-amylase A type-1/2，P0C1B3）、TLLEGEESR 来源于骨架蛋白（keratin,type Ⅱ cytoskeletal 1，P04264）、VAPLGEEFR 来源于载脂蛋白（apolipoprotein A-I，P15497）。

2.3 RPLC-SRM定量方法的建立

2.3.1 RPLC-SRM 方法的优化 为了实现RPLCSRM 对3 个特征肽定量测定，除了在色谱上对待测物的有效分离，避免其流出而造成的离子化竞争，更需要设置适宜的待测物质谱参数，提高其质谱响应。虽然多肽质谱参数可以通过Skyline 软件预测得到，或是通过注射对照品手动优化获得，但不可避免会有检测灵敏度低、多肽对照品消耗量大、优化过程费时等缺点。Online ER-MS 策略无需对照品便能实现质谱参数的精确优化，获得优于Skyline 预测的质谱参数。

以VAPLGEEFR 为例阐明CE 优化过程。首先，通过高分辨质谱采集到多肽VAPLGEEFR 的MS1前体离子信息[M+2H]2+m/z为509.29，MS2主要碎片离子为酰胺键断裂生成的m/z918.47（y8+）、847.43（y7+）、750.38（y6+）、637.30（y5+）、580.28（y4+）、451.23（y3+）、424.22（y72+）、322.19（y2+）、268.17（b3+）、175.12（y1+）（表3，图2），选择其中响应较高的碎片离子m/z为847.43、750.38、637.30、424.22，构建4 对候选离子对m/z509.3→847.4、509.3→750.4、509.3→637.3、509.3→424.2，进而衍生出4 组PITs（m/z509.290→847.431、509.290→847.432、509.290→847.433等，m/z509.290→750.381、509.290→750.382、509.290→750.383 等，m/z509.290→637.301、509.290→637.302、509.290→637.303 等，m/z509.290→424.221、509.290→424.222、509.290→424.223 等）。以2 eV 为步长，在CE 为6～50 eV 时，赋予每个PIT 1个CE，每个PIT扫描时间5 ms。由于Qtrap的Q1和Q3分辨率低，无法识别PITs之间50 mDa以下的差异，因此能够采集得到同一化合物不同CE下对应的峰面积，也能通过Analyst软件SRM模式进行自检。将多肽VAPLGEEFR 4组PITs在不同能量下的峰面积进行归一化后导入GraphPad Prism 8.0 软件，分别采用高斯曲线拟合裂解曲线，m/z509.3→847.4 的高斯曲线方程为Y=13.2×exp{–0.5[(X–23.3)/7.8]2}，OCE 为23.3 eV；m/z509.3→750.4的高斯曲线方程为Y=14.2×exp{–0.5[(X–28.9)/7.6]2}，OCE为28.9 eV；m/z509.3→637.3的高斯曲线方程为Y=30.5×exp{–0.5[(X–28.6)/7.4]2}，OCE为28.6 eV；m/z509.3→424.2 的高斯曲线方程为Y=100.9×exp{–0.5[(X–20.6)/5.0]2}，OCE为20.6 eV（图3）。与Skyline 软件推荐的结果相比，多肽VAPLGEEFR 4个候选离子对相同，且各离子对的CE预测值均为24.8 eV，不能达到各离子对的最佳响应，如离子对m/z509.3→424.2在24.8 eV 时的响应仅为在OCE（20.6 eV）时的70%，故online ER-MS能够获得最佳质谱参数用于建立多肽定量方法。虽然多肽VAPLGEEFR 4 个候选离子对中m/z509.3→424.2响应最高，但该离子对专属性差，同时能检测到另一色谱峰且与VAPLGEEFR 分离度差，因此为了保障分析方法的专属性、灵敏度，最终选择m/z509.3→637.3（28.6 eV）作为定量离子对。

图2 片仔癀胰酶酶解样品中特征肽VAPLGEEFR的MS2谱图及结构注释

图3 多肽VAPLGEEFR候选离子对的裂解曲线

表3 片仔癀3个特征肽多级质谱及其定量离子对、CE信息

另2 个特征肽ALSSALHER 与TLLEGEESR 同样采用online ER-MS 策略进行分析，最终多肽ALSSALHER 的定量离子对为m/z492.3→799.4，高斯曲线Y=100.0×exp{–0.5[(X–25.0)/6.6]2}，OCE为25.0 eV，多肽TLLEGEESR的定量离子对为m/z517.3→819.4，高斯曲线Y=104.2×exp{–0.5[(X–24.4)/7.6]2}，OCE为24.4 eV（表3）。

将已优化好的3个多肽质谱参数输入SRM列表，初步建立SRM 方法，进一步通过优化流动相和洗脱程序来完善分析方法。与其他甲醇-水等流动相体系相比，选用乙腈-甲酸水体系时，各多肽离子对的响应提高，且色谱峰形良好。通过优化色谱洗脱条件，最终各分析物及内标的出峰时间为1.89～8.03 min，能够实现快速分离和分析（图4）。

图4 片仔癀3个特征肽及内标的提取离子流图

2.3.2 方法学验证 方法学验证结果见表4。3 个特征肽LLOD 与LLOQ 分别为3.9、7.8 ng·mL–1，线性范围为7.8～10 000.0 ng·mL–1，日内精密度RSD≤13.45%，重复性RSD 8.46%～27.51%，稳定性RSD≤35.41%，方法灵敏度高，线性关系、精密度与重复性良好，符合多肽的定量要求。

表4 片仔癀3个特征肽的RPLC-SRM定量方法学验证结果

2.4 各批片仔癀定量结果

11 批片仔癀目标多肽含量的测定见表5。结果显示，3 个特征肽在11 批片仔癀样品中均被检出，ALSSALHER 质量分数为 0.06～0.44 μg·g–1，TLLEGEESR 质量分数为 0.08～0.26 μg·g–1，VAPLGEEFR 质量分数较高，为0.27～1.09 μg·g–1。除PTH9之外，3个特征肽在其余10批片仔癀中的质量分数均为VAPLGEEFR>ALSSALHER>TLLEGEESR，不同批间均一性较好。

表5 RPLC-SRM定量分析11批片仔癀中目标多肽的质量分数

3 结论

本研究采用LC-MS 实现了片仔癀中蛋白的鉴定及特征肽的定量分析。基于鸟枪法蛋白组学策略，采 用nano LC-Q Exactive HF Orbitrap-MS，结 合UniProt 数据库，共从片仔癀中鉴别了来源于200 个蛋白的343 个肽段，从中筛选3 个特征肽（ALSSALHER、TLLEGEESR、VAPLGEEFR）作为其质量标志物进行分析。基于不依赖于对照品的online ER-MS 策略，获得了3 个目标多肽的定量离子对及OCE，其优化结果显著优于Skyline软件预测的质谱参数，且与利用对照品手动优化相比，节省了多肽对照品及分析时间。建立的RPLC-SRM 分析方法方法学验证结果良好，11 批片仔癀中3 个特征肽的含量稳定，各批间样品均一性较好，其中多肽VAPLGEEFR 含量最高。本研究可为片仔癀的质量标准提升及含有动物药药味的中成药质量分析提供参考。