知母标准汤剂的质量评价方法及指标成分的量值传递规律探索

李鹏跃，赵金荣，2，薛晓霞，代云桃*

1.中国中医科学院 中药研究所，北京 100700；

2.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040

汤剂亦称汤液，是指将饮片加水煎煮，去渣取汁而得到的液体制剂。汤剂是我国应用最早的剂型之一，也是目前中医临床应用最广泛的剂型。中药饮片标准汤剂是以中医理论为指导、临床应用为基础，参考现代提取方法，经标准化工艺制备而成的单味中药饮片水煎剂[1]。

知母入药始载于《神农本草经》[2]，为百合科知母属植物知母Anemarrhena asphodeloidesBge.的干燥根茎，春、秋二季采挖，除去须根和泥沙，晒干；或除去外皮，晒干[3]。知母用药历史悠久，是中药复方的重要组成药味之一，具有清热泻火、滋阴润燥之效，临床上用于外感热病、高热烦渴、肺热燥咳、骨蒸潮热、内热消渴、肠燥便秘[3]。2018年4月国家中医药管理局同国家药品监督管理局制定并颁布《古代经典名方目录（第一批）》，其中包含知母的经典名方有7 首，包括桂枝芍药知母汤、清金化痰汤、玉女煎、清骨散、达原饮、升陷汤、二冬汤[4]。建立知母标准汤剂质量评价方法对这些经典名方中知母药味的质量控制具有重要参考价值。

现代研究表明，知母所含活性成分主要为皂苷类、黄酮类等，其中皂苷类成分根据其苷元结构的不同可分为螺甾皂苷、呋甾皂苷两大类；黄酮类的主要成分为氧杂蒽酮，如芒果苷（MGF）、异芒果苷、新芒果苷等[5-6]。已有文献报道知母皂苷BⅡ（TB-Ⅱ）具有抗氧化、抗炎、降糖、抗抑郁等作用[7-10]，MGF具有降血糖、抗炎、抗肿瘤、抑菌等作用[11]。知母药材中两者含量均较高，《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）2020 年版规定，TB-Ⅱ质量分数不低于3%，MGF 质量分数不低于0.7%[3]，因此适合作为知母标准汤剂质量评价的指标成分。知母的产地主要为我国河北、山西、山东、陕西、甘肃、内蒙古、辽宁、吉林和黑龙江等地，朝鲜也有分布。知母产地最早记载于汉代《神农本草经》：“知母，味苦寒……生川谷。”[2]《名医别录》记载：“知母生河内川谷，二月八月采根暴干。”[12]《本草图经》记载：“知母生河内川谷，今濒河诸郡（今甘肃兰州）及解州（今山西永济）、滁州（今安徽滁州）亦有之。”[13]《本草蒙筌》记载：“多生徐解二州。”[14]《药物出产辨》记载：“知母产直隶东陵西陵最为出名。”[15]综上所述，河北易县所产西陵知母最为道地。西陵知母在河北易县及其周边有大量栽培，野生资源较少。野生品主要分布在河北易县、涞水、涞源、满城等地的阳坡，栽培品在河北省保定市大部分地区均有引种，尤以疏松的腐殖质壤土栽培为宜。《中药志》记载：“知母主产于河北易县、怀来、房山、涞源、承德、张家口，此外山西盂县、长治，河南济源、林县、内蒙古、甘肃，陕西及东北各省均产。”[16]本研究以知母为研究对象，购买来自河北、山西、内蒙古3 个产地的10 批知母饮片，以标准化工艺制备知母标准汤剂[1]，参考《中国药典》2020 年版中知母的含量测定方法，建立知母标准汤剂的含量测定方法，计算10 批知母汤剂中的指标成分（MGF、TB-Ⅱ）的含量及转移率范围，进而分析饮片与标准汤剂间指标成分的量值传递规律，为制定水煎液及其产品的质量控制方法提供参考。

1 材料

ACQUITY UPLC H-class 型超高效液相系统[配备光电二极管阵列（PDA）检测器，美国Waters 公司]；1200 型高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；2000 型蒸发光散射检测器[ELSD，美国奥泰科技（中国）有限公司]；HC-3018 型高速离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司）；XSR105/A 型十万分之一电子分析天平[梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司]；KQ-500DE 型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；DK-98-ⅡA 型电热恒温水浴锅（天津泰斯特仪器有限公司）；101 型电热鼓风干燥箱（北京中兴伟业仪器有限公司）。

10 批知母饮片来源信息见表1，经中国中医科学院中药研究所代云桃研究员鉴定，饮片基原均为百合科植物知母Anemarrhena asphodeloidesBge.的干燥根茎。对照品MGF（批号：111839-201706，纯度：94.5%）、TB-Ⅱ（批号：111607-201704，纯度：94.5%）均购于中国食品药品检定研究院；水为娃哈哈纯净水；甲醇、乙腈为色谱纯；其他试剂均为分析纯。

表1 知母来源信息

2 方法与结果

2.1 知母标准汤剂的制备

取知母饮片100 g，置于圆底烧瓶中，加7 倍量水，放置浸泡30 min，加热沸腾后，文火保持微沸30 min，趁热滤过，药渣再加6 倍量水，加热沸腾后，文火保持微沸30 min，趁热滤过，合并2 次滤液，并减压浓缩至500 mL，即得。

2.2 标准汤剂供试品溶液的制备

MGF 含量测定供试品溶液：取所得知母标准汤剂，用甲醇稀释20 倍，12 000 r·min–1离 心5 min（离心半径为5.79 cm），取上清液，即得；TB-Ⅱ含量测定供试品溶液：取所得知母标准汤剂，用甲醇稀释10 倍，12 000 r·min–1离心5 min（离心半径为5.79 cm），取上清液，即得。

2.3 对照品溶液制备

精密称取MGF 对照品适量，加稀乙醇制成1.6 mg·mL–1MGF 对照品母液。精密称取TB-Ⅱ对照品适量，用二甲基亚砜制成1.6 mg·mL–1TB-Ⅱ的对照品母液。

2.4 指标成分色谱分析方法

2.4.1 MGF色谱分析方法

2.4.1.1 色谱条件 HSS T3色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），流动相为0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱（0～3 min，10%～13%B；3～6 min，13%～14%B；6～7 min，14%～90%B），柱温为40 ℃，流速为0.4 mL·min–1，检测波长为258 nm，进样量为1 µL。色谱图见图1。

图1 知母标准汤剂的MGF含量测定的UPLC-PDA图

2.4.1.2 方法学考察 线性关系考察：取2.3 项下对照品溶液，加甲醇稀释，得MGF质量浓度分别为0.320、0.160、0.128、0.080、0.064、0.032、0.016 g·L–1的溶液，按2.4.1.1 项下色谱条件测定，以质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），得MGF 线性回归方程为Y=9 744.9X–13.769（r=0.999 6），线性范围为0.016～0.320 g·L–1。

精密度考察：取ZM09 知母标准汤剂适量，按2.2 项下方法制备供试品溶液，按2.4.1.1 项下色谱条件连续进样6 次，计算MGF 峰面积的相对标准偏差（RSD）为0.6%，表明仪器精密度良好。

重复性考察：取知母标准汤剂ZM09共6份，按2.2 项下方法制备供试品溶液，按2.4.1.1 项下色谱条件测定，计算MGF 平均质量分数为1.02%，RSD为4.0%，表明该方法重复性良好。

稳定性考察：取ZM09 知母标准汤剂适量，按2.2 项下方法制备供试品溶液，分别于制备后0、1、4、6、8、12、24 h 按2.4.1.1 项下色谱条件测定，计算MGF 峰面积的RSD 为1.5%，表明知母标准汤剂供试液在24 h内稳定。

加样回收率试验：取已知MGF含量的ZM09知母标准汤剂200 μL，按1∶1添加对照品，按2.2项下方法分别平行制备6份供试品溶液，按2.4.1.1项下色谱条件测定，计算MGF的平均加样回收率为101.68%，RSD为1.1%，说明该方法准确可靠（表2）。

表2 知母标准汤剂中MGF含量测定的加样回收率试验

2.4.2 TB-Ⅱ色谱分析方法

2.4.2.1 色谱条件 同《中国药典》2020 年版方法[3]，采用Thermo Aclaim™ RD C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以乙腈-水（25∶75）为流动相，柱温为30 ℃，流速为1.0 mL·min–1，进样量为10 μL，利用ELSD 检测，漂移管温度为104 ℃，载气流速为2.8 L·min–1。理论板数按TB-Ⅱ峰计算应不低于10 000。色谱图见图2。

图2 知母标准汤剂的TB-Ⅱ含量测定的UPLC-ELSD图

2.4.2.2 线性关系考察 取2.3 项下对照品溶液，加甲醇稀释，得TB-Ⅱ质量浓度分别为1.060、0.530、0.265、0.106、0.053 g·L–1的溶液，按2.4.2.1 项下色谱条件测定，以质量浓度的自然对数为横坐标（X），峰面积自然对数为纵坐标（Y），得TB-Ⅱ的线性回归方程为Y=0.945 3X+7.867 7（r=0.997 0），线性范围为0.053～1.060 g·L–1。

2.5 知母饮片及标准汤剂指标成分的含量测定

知母饮片中MGF、TB-Ⅱ的含量测定方法依照《中国药典》2020年版，标准汤剂中MGF、TB-Ⅱ的含量测定方法依照2.4 项下分析方法测定。样品分析结果显示，10批知母饮片和标准汤剂中MGF的质量分数分别为1.66%～2.04%和0.88%～1.12%，平均值分别为1.89%和0.98%，均在均值的±30%范围内（分别为1.33%～2.46%和0.69%～1.27%）。10 批知母饮片和标准汤剂中TB-Ⅱ的质量分数分别为3.28%～6.81%和0.88%～2.53%，平均值分别4.73%和1.71%，其中3 批知母饮片（ZM07、ZM9、ZM10）中TB-Ⅱ的质量分数不在均值的±30%范围内（3.31%～6.15%），表明该研究所用不同产地知母饮片中TB-Ⅱ含量波动范围较大，其中山西万荣县知母饮片TB-Ⅱ含量最高；4 批知母汤剂（ZM04、ZM07、ZM9、ZM10）中TB-Ⅱ的质量分数不在均值的±30%范围内（1.20%～2.22%），该结果可能是由研究所用不同产地知母饮片中TB-Ⅱ含量的波动大所致。

2.6 知母标准汤剂其他质量属性测定

按公式（1）计算指标成分的转移率。

式中W表示1 g 饮片经标准汤剂提取出的MGF或TB-Ⅱ的质量，M表示1 g 饮片按《中国药典》2020 年版方法测定的MGF 或TB-Ⅱ的质量（表3）。结果显示，10 批知母饮片到汤剂MGF、TB-Ⅱ的转移率分别为45.83%～57.27% 和26.94%～43.49%，平均值分别为51.87%和35.72%，均在其均值的±30%范围内（36.31%～67.43%、25.01%～46.44%）。

表3 知母含量测定与汤剂特征参数结果

分别取2.1 项下的标准汤剂50 mL，90 ℃干燥至恒重，称取浸膏的质量，根据公式（2）计算标准汤剂的出膏率。

结果显示，10批知母标准汤剂的出膏率为29.0%～45.0%，平均值为37.2%（表3），均在其均值的±30%范围内（26.0%～48.4%）。

将pH 计校正，吸取2.1 项下的标准汤剂，在25 ℃条件下测定其pH，平行测定3 次，取平均值（表3）。结果显示，10 批知母标准汤剂的pH 为4.96～5.40，平均值为5.17，均在其均值的±30%范围内（3.62～6.73）。

3 讨论

本研究于《中国药典》2020 年版知母药材含量测定方法的基础上建立知母标准汤剂中TB-Ⅱ的HPLC-ELSD 含量测定方法，以及知母标准汤剂中MGF 的HPLC-PDA 含量测定方法。优化了MGF 分析的流动相和洗脱条件，方法学考察结果显示所建立的MGF含量测定方法准确、重复性好，能用于知母准汤剂中MGF的含量测定。

转移率反映了标准汤剂制备工艺对指标成分的影响，也反映了制备工艺的稳定性。而标准汤剂中指标成分的含量与所用饮片中指标成分的含量密切相关。10 批知母汤剂中的指标成分的含量及转移率结果显示，知母饮片、标准汤剂中分别有3、4 批样品的TB-Ⅱ不在其均值的±30%范围内，该结果表明本研究所用不同产地知母饮片中TB-Ⅱ含量波动范围较大[17]。但是TB-Ⅱ、MGF 从10 批知母饮片到标准汤剂的转移率范围在均值的±30%范围内，提示TB-Ⅱ、MGF 在知母标准汤剂制备过程中转移情况稳定，表明本研究所用的标准汤剂制备工艺参数稳定。上述结果提示不同产地引起的知母饮片中TB-Ⅱ的含量波动会传递到知母标准汤剂中[17]。因此，在后续知母标准汤剂及所有源于知母水煎液的经典名方制剂研究中，建议对知母饮片中的指标成分（MGF、TB-Ⅱ）含量范围进行限定或者进行混批操作，以缩小原料引起的知母标准汤剂及经典名方制剂质量波动。

本课题组前期对15 批二冬汤基准样品中知母药味的指标成分（MGF、TB-Ⅱ）质量分数及转移率进行了分析[18]，二冬汤中包括了天冬、麦冬、天花粉、知母、人参、甘草、荷叶、黄芩8 个药味。与知母标准汤剂相比，二冬汤基准样品中MGF转移率的均值降低，而TB-Ⅱ转移率的均值升高，知母饮片在制备为标准汤剂及二冬汤基准样品的过程中MGF、TB-Ⅱ 2 个指标成分的转移率变化趋势不同，推断导致此结果的原因可能包括二冬汤基准样品其余药味成分对知母药味中成分溶出的影响。除了知母外，二冬汤中天冬、麦冬、天花粉、知母、人参、甘草5 个药味均含有皂苷类成分，根据相似相溶原理，可能这些药味中皂苷类成分促进了知母饮片中皂苷类成分的溶出，从而导致TB-Ⅱ转移率高于知母标准汤剂。因此，在含有同一药味的不同经典名方基准样品研究中，不同复方中同一药味转移率可能不相同，造成这一现象的原因可能来自复方中其余药味饮片成分的影响。