高分辨非靶代谢组学方法研究臻通集胶囊对高脂血症模型大鼠的影响△

侯红平，王彩霞，魏晓露，高云航，赵晓晓，宋玲，陈腾飞，练东银，李丽丽，彭博*，张广平*

1.中国中医科科学院 中药研究所，北京 100700；

2.河北御芝林生物科技有限公司，河北 石家庄 050035

血脂异常通常表现为血总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）升高，高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）降低及上述血脂异常共同存在的混合型血脂异常，根据病因可分为原发性和继发性2 类，前者多见于遗传性疾病，后者主要见于糖尿病、肝肾疾病等全身性系统性疾病。2017 年全球疾病负担（global burden of disease，GBD）的中国资料表明，低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）异常是中国心血管疾病（CVD）的第三大归因危险因素[1]。而2012—2015 年心血管健康研究（CHS）显示，在我国年龄≥35 岁的居民血脂异常总体患病率为34.7%，知晓率、治疗率、控制率分别为16.1%、7.8%、4.0%，整体控制情况较差[2]。因此，对高脂血症预防和治疗的研究具有非常重要的意义。

臻通集胶囊是以三七粉、黄芪提取物、丹参提取物、银杏叶提取物、葛根提取物、余甘子提取物、玉竹提取物为主要原料制成的保健品。上述成分经实验证明具有辅助调血脂和增强免疫力的作用[3-5]，在本课题组前期实验中也证实臻通集胶囊能够改善血脂异常的症状[6]，但其调节血脂代谢的机制尚不明确。本研究通过高分辨非靶代谢组学方法研究臻通集胶囊对高脂血症模型大鼠的影响，为其治疗和预防高脂血症提供参考。

1 材料

1.1 仪器

TBA-120FR 型全自动生化分析仪（佳能集团）；Triple TOF 6600 型质谱仪（AB Sciex 公司）；5430R型低温高速离心机（Eppendorf 公司）；1290 Infinity LC型超高压液相色谱仪（Agilent公司）。

1.2 试药

臻通集胶囊（批号：202102010702，河北御芝林药业有限公司）；TG 试剂盒（批号：01130C11）、TC 试剂盒（批号：01126D11）、HDL 试剂盒（批号：10222A11）、LDL 试剂盒（批号：10223A11）均购于北京安图生物工程有限公司；乙腈（Merck公司）；甲醇（Fisher公司）。

1.3 实验动物

无特定病原体（SPF）级SD 大鼠40 只，雄性，体质量180～220 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK（京）2016-0011，饲养于中国中医科学院中药研究所屏障环境动物房，实验经中国中医科学院中药研究所动物福利伦理委员会批准（伦理批准号：2021B125）。

2 方法

2.1 动物分组与给药

随机取6 只大鼠作为对照组，给予正常饲料，其余所有大鼠给予高脂饲料（基础饲料+15%猪油+20%蔗糖+1.2%胆固醇+0.2%胆酸钠），连续喂养4 周后，检测动物血清中的TG 和TC，与对照组比较明显升高且差异具有统计学意义，视为模型成功。剔除不合格大鼠，其余大鼠根据TC值随机分层分组，分为模型组和高、中、低剂量给药组，每组6只。

对照组大鼠正常饮食。模型组和给药组大鼠给予高脂饲料的同时，高、中和低剂量组分别给予臻通集胶囊0.432、0.216、0.108 g·kg–1（2.0、1.0、0.5 倍临床等效剂量），灌胃给药，每天1 次，连续给药8周。

2.2 动物处理及指标检测

末次给药后，大鼠麻醉，腹主动脉采血，离心分离血清，全自动生化仪检测血清中TC、TG、HDL-C 和LDL-C 的含量。取部分中剂量的大鼠肝组织用于高分辨非靶代谢组学的研究。

2.3 高分辨非靶代谢组学分析

2.3.1 肝脏组织提取方法 大鼠肝脏组织解冻，取适量样本加入预冷的甲醇-乙腈-水溶液（2∶2∶1），涡旋混合，低温超声30 min，–20 ℃静置10 min，14 000×g、4 ℃离心20 min，取上清液，真空干燥，质谱分析时加入乙腈水溶液（乙腈-水，1∶1）100 μL复溶，涡旋，14 000×g、4 ℃离心 15 min，取上清液进样分析。

2.3.2 质量控制（QC）样本制备 QC 样本是由待测样本等量混合制成，在待测样本超高效液相色谱-质谱法（UPLC-MS/MS）进样前、进样中和进样后上机检测。

2.3.3 色谱-质谱分析 色谱条件：Agilent 1290 Infinity LC型超高效液相色谱系统（Waters ACQUITY UPLC BEH Amide 型色谱柱，100 mm×2.1 mm，1.7 µm）；柱温为25 ℃；流速为0.5 mL·min–1；进样量为2 μL；流动相A 为水+25 mmol·L–1乙酸铵+25 mmol·L–1氨水，流动相B 为乙腈；梯度洗脱（0～0.5 min，95%B；0.5～7.0 min，95%～65%B；7.0～8.0 min，65%～40%B；8.0～9.0 min，40%B；9.0～9.1 min，40%～95%B；9.1～12.0 min，95%B）。

质谱条件：采用Triple TOF 6600 型质谱仪进行样本一级、二级谱图的采集。分别采用电喷雾离子源（ESI）正离子和负离子模式进行检测。

2.4 数据处理

血脂水平的数据以（-x±s）表示，采用SPSS 25.0软件进行单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。代谢组学数据经ProteoWizard 3.0.6428软件转换成.mzXML 格式，然后采用XCMS 84 软件进行峰对齐、保留时间校正和提取峰面积。对XCMS 提取得到的数据首先进行代谢物结构鉴定、数据预处理，再进行实验数据质量评价和数据分析。

3 结果

3.1 大鼠血清中的血脂水平检测

与对照组比较，模型组大鼠血清中TG、TC、HDL-C 和LDL-C 水平均明显升高，差异具有统计学意义，说明造模成功。臻通集胶囊高剂量能明显降低大鼠各项指标的水平（P<0.05，P<0.01），中剂量能降低TG、TC 和LDL-C 水平（P<0.05），见表1。

表1 各组大鼠血清中TG、TC、HDL-C和LDL-C的水平（,n=6）

表1 各组大鼠血清中TG、TC、HDL-C和LDL-C的水平（,n=6）

注：与对照组比较，*P<0.05，***P<0.001；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01。

3.2 实验方法考察

3.2.1 QC 样本相关性 对QC 样本进行Pearson 相关性分析，相关性图谱见增强出版附加材料。一般r>0.9 表明相关性较好。实验结果表明，QC 样本间的r均大于0.9，说明实验重复性较好。

3.2.2 总体样本Hotelling′s T2 检验 Hotelling′sT2检验通过多元变量建模对样本进行检验，定义了95%或99% 置信区间，可用于离群样本的诊断。Hotelling′sT2 检验结果见图1。结果表明QC 样本均在99%置信区间内[7]，说明实验的重复性好。

图1 臻通集胶囊给药后大鼠血清总体样本Hotelling′s T2检验

3.3 总体样本主成分分析（PCA）

将所有实验样本和QC 样本提取得到的峰进行PCA，见图2。实验结果表明，正、负离子模式下QC样本紧密聚集在一起，说明实验的重复性好。同时，对照组和模型组明显分离，说明模型成功。经臻通集胶囊给药后，各组均向对照组方向回调，说明臻通集胶囊对高脂血症具有良好的干预作用。

图2 臻通集胶囊给药后大鼠血清总体样本PCA

3.4 代谢组学分析

3.4.1 差异代谢物的筛选结果 与对照组比较，模型组共检测出138 个差异代谢物；与模型组比较，臻通集胶囊给药组共检测出123 个差异代谢物，正离子模式的72个差异代谢物有24个在给药后得到了纠正，负离子模式的51 个差异代谢物有9 个在给药后得到了纠正（表2、表3）。其中，变量重要性投影（VIP）值表示变量投影重要度，值越大，表示越重要；P值越小，表示差异越显著[8]。

表2 臻通集胶囊给药组和模型组在正离子模式下的差异代谢物

表3 臻通集胶囊给药组和模型组在负离子模式下的差异代谢物

3.4.2 差异代谢物表达差异倍数分析 以差异代谢物的log2FC（FC 为差异倍数）为横坐标，显著性差异代谢物为纵坐标，分析给药组和模型组的差异代谢物表达，并对差异代谢物进行分类。正离子模式的差异代谢物主要包括L-肉碱、甜菜碱、胞苷、L-脯氨酸肉碱、亚油酸肉碱、DL-苯丙氨酸、UDP-D-半乳糖；负离子模式的差异代谢物主要包括肌苷、替尼泊苷、亮氨酸、L-谷氨酰胺、L-缬氨酸、亮氨酸、D-脯氨酸、甲基丙二酸等。差异代谢物表达差异倍数分析及分类见增强出版附加材料。

3.4.3 差异代谢物的亚类分析 给药组和模型组差异代谢物进行亚类分析，正离子模式的差异代谢物亚类主要集中在哌啶、脂肪酰基、鞘脂、呋喃、肽模拟物等方面；负离子模式的差异代谢物亚类主要集中在甘油磷脂、类黄酮、嘌呤核苷酸和香豆素等方面。差异代谢物表达差异火山图及亚类分析图见增强出版附加材料。

3.4.4 差异代谢物生物信息学分析

3.4.4.1 聚类分析 显著性差异代谢物（VIP值>1，P<0.05）的层次聚类分析结果显示，聚在同一簇内的代谢物具有相似的表达模式，可能具有相似的功能或者共同参与同一代谢过程和细胞通路。正离子模式的差异代谢物主要聚集在腺苷5-单磷酸、还原型甘油磷酸胆碱、脱氧腺苷、半胱氨酸-甘氨酸、L-谷胱甘肽等方面，负离子模式的差异代谢物主要聚集在L-谷氨酰胺、尿酸、腺嘌呤、抗坏血酸、谷氨酸、D-脯氨酸等方面。显著差异代谢物的层次聚类分析图见增强出版附加材料。

3.4.4.2 相关性分析 对显著性差异代谢物间的代谢密切程度进行相关性分析。正、负离子模式均集中在脂质、核酸、有机酸及其衍生物、有机氮化合物、有机氧化合物等方面。显著性差异代谢物的相关性网络图见增强出版附加材料。

3.4.4.3 京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路注释与分析 将正、负离子模式筛选到的差异代谢物合并，对其进行KEGG（http://www.kegg.jp/）通路注释与分析，见图3。然后对KEGG 代谢通路整体变化进行差异丰度得分分析，见图4。涉及的代谢通路包括雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路、环磷酸鸟苷酸依赖性蛋白激酶（cGMP-PKG）信号通路、叉头转录因子（FoxO）信号通路、蛋白质消化和吸收、嘧啶代谢、微生物消化和吸收、甘油磷脂代谢、氨基酸生物合成、嘌呤代谢等。

图3 臻通集胶囊给药组和模型组大鼠血清中差异代谢物KEGG通路富集分析

4 讨论

代谢组学主要通过对特定细胞、器官或生物体中的低相对分子质量代谢物（<2000）进行定量分析，是1999 年由Nicholson 等[9]提出，主要用来研究生物体受刺激后所发生的各种代谢应答变化，可以直观反映机体的代谢状况。目前，代谢组学最常用的判别归类分析方法包括以PCA 为主的无监督的判别分析方法及以偏最小二乘法-判别分析（PLS-DA）为主的有监督的判别分析方法[10]。

本研究中，模型组大鼠血清中的TG、TC、HDL-C 和LDL-C 较对照组均明显升高，且PCA 显示，对照组和模型组分离明显，说明模型成功。而臻通集胶囊给药后，高剂量和中剂量组的TG、TC、LDL-C，高剂量组的HDL-C 较模型组明显降低，且差异有统计学意义。中剂量为臻通集的有效剂量，在此基础上，比较了模型组和臻通集中剂组的代谢组学差异。

前期进行了实验方法学的考察，QC样本间的相关性系数均大于0.9，且QC 样本均在置信区间内，表明实验的重复性较好。PCA 显示，经臻通集胶囊给药后，各组均向对照组方向回调，说明臻通集胶囊对高脂血症具有良好的干预作用，与上述血脂水平变化相一致。与对照组比较，模型组共检测出138 个差异代谢物，其中正离子模式有66 个差异代谢物，负离子模式有72 个差异代谢物。给药组与模型组比较，共检出123 个差异代谢物，其中正离子模式有72 个差异代谢物，主要包括甘油磷酸胆碱、氨基酸、腺苷、谷胱甘肽、磷酸胆碱、胞嘧啶、乳酸、l-花生四烯酰肉碱等；负离子模式有51 个差异代谢物，主要包括尿嘧啶、氨基酸、谷氨酸、尿酸、吲哚乳酸、腺嘌呤等。上述差异代谢物主要集中在木脂素、新木脂素及相关化合物，羧酸及其衍生物，肉桂酸和衍生物，香豆素及其衍生物，吲哚类衍生物，异黄酮，木脂素内酯，有机磷酸和衍生物等。

经生物信息学分析，臻通集干预大鼠高脂血症的代谢过程涉及多个信号通路，主要包括mTOR 信号通路、cGMP-PKG 信号通路、FoxO 信号通路、蛋白质消化和吸收、嘧啶代谢、微生物消化和吸收、甘油磷脂代谢、氨基酸生物合成、嘌呤代谢等。这与臻通集含有银杏叶提取物、葛根提取物、余甘子提取物等多个调脂成分密切相关[11-12]。

磷脂腺肌醇3-激酶（PI3K）-蛋白激酶B（Akt）-mTOR信号通路是典型的自噬通路，该通路通过调节蛋白质合成和降解、改善细胞能量代谢等多种途径发挥重要的生理功能，激活该通路可增强肝脏细胞的自噬表达，能够有效调节血脂、改善肝脏脂质沉积等[13-14]。FoxO1是位于PI3K/Akt下游的关键因子，在肝脏糖脂代谢的调节中具有至关重要的地位。研究表明，通过调节PI3K/Akt 通路，促进FoxO1 磷酸化，能够调节血脂水平，缓解高脂血症[15-18]。文献报道，次黄嘌呤异构体别嘌呤醇能够改善患者高尿酸血症，利于改善患者的血脂代谢情况[19]。李玉红等[20]研究发现，糖脂清可以改善四氧嘧啶糖尿病小鼠的生长状况，降低小鼠空腹血糖浓度和血清中TG的含量，提示嘧啶代谢参与血脂水平的调节。

综上，臻通集胶囊能够有效改善高脂血症大鼠的血脂水平，与其能够调节嘌呤代谢、嘧啶代谢、甘油磷脂代谢、mTOR 信号通路，cGMP-PKG 信号通路等密切相关。