灰藓科4种藓类植物孢子萌发与原丝体发育特征

黄士良 贾素巧 王晓蕊 李琳

摘 要 通过室内人工培养的方式，在微米量级下观察灰藓科灰藓属（Hypnum）灰藓（H.cupressiforme）、黄灰藓（H.pallescens）、多蒴灰藓（H.fertile），金灰藓属（Pylaisia）金灰藓（P.polyantha） 4种藓类植物孢子萌发和原丝体发育过程，详细记录其发育过程的性状特征。结果显示：（1）4种藓类植物的孢子均为单细胞，直径平均值为10～40  μm。（2）黄灰藓孢子为壁内萌发，灰藓、多蒴灰藓、金灰藓孢子为壁外萌发。4种藓类植物发育初期均未出现初生假根，有次生假根出现。4种藓类植物在发育中出现了块状原丝体和丝状原丝体两种形态，其原丝体在发育初期均没有产生初生轴丝体，均是在原丝体发育后期，轴丝体由绿丝体分化产生。（3）参照Nishida对藓类植物孢子萌发和原丝体发育类型划分标准，对灰藓科4种藓类植物的原丝体发育特征进行归类分析，灰藓属黄灰藓原丝体发育类型为高领藓型（Glyphmitrium-type）；灰藓属灰藓、多蒴灰藓，金灰藓属金灰藓3种藓类植物原丝体发育类型均为真藓型（Bryum-type）。

关键词 灰藓科；孢子萌发；原丝体发育；孢子萌发型

藓类植物孢子萌发、原丝体发育和配子体发生阶段是其生活史中一段复杂的过程，其间呈现出的性状特征成为种属间形态分类的有力依据[1]。随着研究的不断深入，越来越多的藓类植物原丝体发育阶段被人们所熟悉，其发育过程性状特点也成为藓类植物分类学上的有益补充。Nishida[2]是对藓类植物原丝体发育和孢子萌发型系统性研究比较早的国外专家。2009年，Pressel等[3]对不同种类苔藓植物原丝体各个阶段发育的特点进行了一系列的试验观察。2020年，Sangeeta等[4]研究了植物激素在苔藓原丝体分化中的相互作用，认为生长素、乙烯和环腺苷酸通过提高细胞内钙浓度而促进原丝体的分化。Johri[5]研究了生长素在苔藓原丝体分化中的作用，认为在固定悬浮培养中，原丝体细胞分化状态受孢子接种密度和生长素水平的调控。2016年，Natalia等[6]研究了药用苔藓原丝体悬浮培养体系的建立，并对培养基、营养条件、初始pH、接种量等提高生物量的关键因素进行评价。国内最早对苔藓植物原丝体发育进行系统研究的学者是高谦等，1986年，高谦等[7]研究藓类植物孢子萌发和原丝体发育对苔藓植物的各分类群之间的关系和种系发生及系统演化，此后，关于藓类植物原丝体发育的研究较少，直到21世纪初，相关报道逐渐增多。自2002年以来，赵建成等[8]及黄士良等[9-11]系统研究了百余种侧蒴藓类和顶蒴藓类植物孢子萌发和原丝体发育特征，他们的研究为中国藓类植物发育学研究提供了重要的基础资料。

灰藓科（Hypnaceae）是侧蒴藓类植物中最具多样化的一个类群，是藓类植物中较大的科，分布世界各地，该科多数种类属于旱生性藓类植物，科内属间和种间差异甚微，灰藓科是藓类植物学家公认的分类难度较大的科 ，在灰藓属中表现尤为突出[12]。由于灰藓科灰藓属和金灰藓属中藓类植物生态幅度宽广，生境存在多样性，种类存在多形，常产生变异类型的种，单凭配子体的形态显微結构较难区分，因此，通过研究两属藓类植物孢子萌发、原丝体发育及配子体发生特征，从发育学角度对灰藓科植物分类提供直接或间接的佐证依据。同时，灰藓属部分藓类植物具有药用价值，通过对该属藓类植物配子体发育进行基础性研究，以期为深入开展苔藓的人工栽培、开发和利用提供基础数据。

目前，中国灰藓科的相关研究多从灰藓科分类与区系的角度开展，关于灰藓科植物原丝体发育的系统性研究未见报道。本研究选择中国产灰藓科具有孢子体的2属4种藓类植物，详细观察了其孢子萌发、原丝体发育、配子体分化的过程，并系统分析了该科4种藓类植物发育特征，旨在探索灰藓科植物系统分类、生态学与发育学的相关性。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料取自灰藓科4种藓类植物标本成熟孢蒴内的孢子。

灰藓Hypnum cupressiforme，李琳 N0064（HBNU），2016年8月11日，河北省平山县驼梁山（38°43′14.64″N， 113°48′54.18″E），海拔1 200 m，土生。

黄灰藓Hypnum pallescens，黄士良 N0045（HBNU），2018年8月10日，河北隆化县茅荆坝林场（41°31′34.09″ N， 118°07′8.25″E），海拔1 100 m，腐木生。

多蒴灰藓Hypnum fertile，黄士良 N0036（HBNU），2016年8月11日，河北省平山县驼梁山（38°43′0.11″ N， 113°48′56.50″E），海拔1 100 m，腐木生。

金灰藓Pylaisia polyantha，黄士良 N0029（HBNU），2019年8月6日，河北省鹿泉市封龙山（37°54′6.30″N， 114°18′53.15″E），海拔400  m，岩面薄土。凭证标本存放于河北师范大学植物标本馆（HBNU）[12]。

1.2 试验方法

参照文献［9］和［11］的试验方法进行。

1.3 试验步骤

培养基的制备：在一定量的改良Knop营养液中加入2%琼脂，加热熔化后，倒入60 mm的培养皿中，凝固后即可使用[9]。

孢子悬液的制备：把孢蒴浸入75%的酒精溶液中，20 s后取出，并在无菌蒸馏水中清洗5次；然后，用镊子和解剖针将孢子取出并散入无菌蒸馏水中，制成适当浓度的孢子悬液[9，11]。

孢子悬液转移：用移液器将稀释的孢子悬液接种于培养基上。

相关参数：培养皿加盖后放在光照培养箱（产品型号为KRG-250A）中培养。温度23 ℃±2 ℃，相对湿度大于80%，光照强度24   μmol/（m2·s），光照时间12  h/d。

镜检要求：自接种培养之日起，每隔24 h镜检孢子发育情况，每次镜检标本量为15～20个孢子的发育情况，详细记录个体的发育状况，并进行显微照相及绘图。

2 结果与分析

通过显微镜下观察灰藓科4种藓类植物孢子萌发与原丝体发育过程，记录每种孢子萌发特点及原丝体发育过程的性状特征（图1），对发育特征进行归类统计（表1）。

2.1 孢子特征

4种藓类植物的孢子均为单细胞，体积较小，大小不均匀，直径平均值为10～40  μm。根据表1的孢子特征归类可以看出，孢子形状均为球形或近球形，近极面观多为圆形或近圆形（图1-1、1-2、1-3、1-4）。孢子表面纹饰大体相近，一般为细疣状或瘤状。

2.2 孢子萌发与原丝体发育特征

2.2.1 孢子萌发特征 由图1和表1可知，4种藓类植物中黄灰藓为壁内萌发（图1-6），灰藓、多蒴灰藓、金灰藓为壁外萌发（图1-5、1-7、1-8）。灰藓与金灰藓为多极萌发，多蒴灰藓与黄灰藓为1～3极萌发。

2.2.2 初生假根与次生假根 4种灰藓科藓类植物在培养期内均未出现初生假根，其中黄灰藓和灰藓均在原丝体发育中期由绿丝体分化形成次生假根。4种藓类植物在配子體发育形成后，在配子体基部产生假根。

2.2.3 原丝体与轴丝体的分化 4种藓类植物在发育中出现了块状原丝体和丝状原丝体两种形态。黄灰藓孢子为单细胞孢子，属于内生孢子萌发类型，在培养36 h后开始壁内萌发，产生2个相等细胞的块状原丝体；随后，其中一个细胞的原生质膜突破外壁开始凸出孢外，形成绿丝体原始细胞，并不断伸长；绿丝体原始细胞在伸长的同时，产生的2个相等细胞继续分裂，形成由4～6个细胞组成的块状原丝体（图1-6）。块状原丝体的每个细胞都开始分化产生绿丝体原始细胞，测量块状原丝体的直径约为53   μm。7  d时，60％的块状原丝体出现1～3极萌发现象（图1-10），20％的块状原丝体上产生的绿丝体已经分化产生1～4个细胞，绿丝体长达到170   μm，绿丝体细胞长50   μm，直径12   μm。第20天时，原丝体的密度逐渐增大，轴丝体大量产生，交互生长，特别是在绿丝体基部，密度最大（图1-13）。在绿丝体顶端细胞或侧枝开始分化出次生假根。

灰藓、多蒴灰藓和金灰藓3种藓类植物属于外生孢子萌发类型，在发育过程中仅出现丝状原丝体（图1-7，1-8）。其中多蒴灰藓和金灰藓孢子均在培养60 h后，开始壁外萌发。多蒴灰藓在培养7 d后，80%的孢子已经萌发，萌发极向为1～4极萌发；14 d后，多蒴灰藓以绿丝体基部细胞为中心出现大量绿丝体分枝（图1-11）；19 d后，在绿丝体顶端分化出现气生绿丝体，伸向基质外部空间生长。在培养5 d后，金灰藓孢子开始出现3极萌发现象，丝状绿丝体产生侧枝，侧枝和绿丝体接近垂直生长（图1-14）；在绿丝体二级侧枝形成后，部分深入到基质中分化形成假根。灰藓在培养90 h后孢子开始壁外萌发；第7天时，95%以上的孢子已经萌发，萌发极向为1～4极；第15天时，绿丝体产生大量二级侧枝，分化出现次生假根（图1-9、1-12）。

4种藓类植物原丝体在发育初期均没有产生初生轴丝体，均是在原丝体发育后期，轴丝体由绿丝体上分化产生。黄灰藓在培养至第17天时，绿丝体顶端细胞开始分化产生轴丝体细胞。金灰藓在培养至第23天时，绿丝体顶端细胞开始分化产生斜壁细胞，分化成轴丝体。灰藓在培养至第26天时，绿丝体前端开始分化产生轴丝体。多蒴灰藓在培养至第30天时，绿丝体顶端细胞开始分化产生轴丝体细胞。

2.2.4 配子体发生方式 4种藓类植物的配子体发生存在2种方式：第1种是配子体原始细胞在绿丝体基部细胞上分化产生，如金灰藓培养至第35天时、灰藓培养至第26天时和多蒴灰藓培养至第45天时，3种藓类植物均在绿丝体基部细胞上分化产生芽体，即配子体原始细胞（图1-16、1-18、1-19）；第2种是配子体原始细胞在绿丝体和轴丝体上同时产生，如黄灰藓培养至第24天时，在绿丝体和轴丝体上开始分化产生配子体原始细胞（图1-17）。金灰藓培养至第40天、灰藓培养至第32天、多蒴灰藓培养至第50天和黄灰藓培养至第31天时记录观察，4种藓类植物配子体均已经出现4～10片幼叶（图1-20、1-21、1-22、1-23）。

2.2.5 原丝体细胞异形和断裂 金灰藓在培养至第9天，部分绿丝体细胞内的叶绿体数量开始逐渐减少，同时叶绿体形状出现萎缩，绿丝体细胞长度拉伸，形状变成细长型；14 d后，金灰藓绿丝体基部细胞体积逐渐变大，形状呈近圆球形，随后，绿丝体基部细胞之间的细胞壁逐渐消失；16 d后，金灰藓原丝体细胞发生缢裂，形成细胞数目不等的多个断裂原丝体段，各自独立生长（图1-15）。黄灰藓、多蒴灰藓和灰藓3种藓类植物原丝体在发育过程中均未发现有原丝体细胞断裂现象。

金灰藓、多蒴灰藓和灰藓3种藓类植物原丝体细胞均为丝状长圆柱形细胞（图1-11、1-12、1-14），而黄灰藓在培养至第18天时，绿丝体的分枝继续增多，从绿丝体基部细胞到顶端细胞上的分枝数逐渐减少，原丝体细胞多数发育成椭圆形细胞，整个原丝体系统呈现一个不规则圆形，原丝体由中间向四周散射生长（图1-17）。

2.3 孢子萌发型

根据灰藓科4种藓类植物孢子萌发、原丝体发育和配子体细胞分化特点，将孢子萌发型划分成真藓型和高领藓型2种类型。其中灰藓属灰藓、多蒴灰藓和金灰藓属金灰藓3种藓类植物孢子萌发型为真藓型。真藓型发育主要特征为丝状原丝体由长圆柱形细胞组成，原丝体系统包含绿丝体和轴丝体，配子体的原始细胞由绿丝体分枝的基部细胞产生。灰藓属黄灰藓孢子萌发型为高领藓型。高领藓型发育主要特征为原丝体系统缺乏轴丝体，块状原丝体的所有细胞在伸长的壁内形成，假根由块状原丝体或配子体基部发育而来。

3 结论与讨论

3.1 孢子萌发型与灰藓科植物系统发育

由于植物发育过程所表现出的性状特征具有稳定性，因此，藓类植物原丝体发育过程所表现出来的特征、规律也与其分类关系具有密切的相关性[1]。灰藓科被认为是藓类植物分类难度较大的科，将原丝体发育性状作为该科植物分类的依据，具有重要的意义。王利松等[12]遵循Frey和Stech的系统，将金灰藓属从灰藓科移除，置于金灰藓科（Pylasiaceae）中。本研究中，金灰藓［Pylaisia polyantha （Hedw.） Bruth & Schimp.，贾渝等，2013，2018］孢子萌发方式、假根的产生、原丝体形态、绿丝体与轴丝体的分化、配子体发生方式及原丝体细胞形态等特征均与灰藓、多蒴灰藓具有共性，只有原丝体细胞在发育过程中发生缢裂这一特征与灰藓属3种植物产生差异，关于金灰藓在2倍孢子体发育阶段，是否存在更多差异性，还需要进一步探索。

4种藓类植物仅存在真藓型和高领藓型2种孢子萌发型，其中以真藓型为主。日本学者Nishida[2]研究过的南亚灰藓（Hypnum oldhamii）和大灰藓（Hypnum plumaeforme）孢子萌发型均为真藓型，2种藓类植物孢子均为壁外萌发，产生丝状原丝体，配子体原始细胞在绿丝体或轴丝体上分化产生，2种藓类植物原丝体发育过程特征和本研究中的4种藓类植物发育过程特征具有共性，不同之处在于原丝体发育过程没有出现缢裂现象，这一点和金灰藓原丝体发育中的缢裂现象依然有区别。灰藓属中孢子萌发类型以真藓型为主，这为本属藓类植物原丝体发育特征具有较为进化的特性提供了有力依据[2，9-11]。

在原丝体的性状演化顺序上，块状原丝体与丝状原丝体相比，块状原丝体特征是相对低等的，丝状原丝体是原丝体发育形态中的较为进化的性状特征[1-2]。在本研究的4种灰藓科藓类植物中，黄灰藓原丝体发育过程中出现相对低等的块状原丝体特征。4种灰藓科植物在原丝体发育过程中都是以丝状原丝体为主体，说明丝状原丝体为其单倍体发育阶段的重要特征[13]。

3.2 孢子萌发型与灰藓科植物的生态适应

藓类植物孢子萌发型与其生存环境存在密切相关性，如泥炭藓型的片状原丝体是对多水环境的适应，而黑藓类的块状原丝体是与极干旱环境相适应。块状原丝体是在孢壁内萌发形成，原丝体与外界接触面积减少，也就相应减少了植物体内水分的蒸发和流失，因此，干旱少雨的极端环境促使部分藓类植物在孢子萌发和原丝体发育阶段出现块状原丝体性状[2，11]。

本研究中灰藓科2个属的藓类植物多生于腐木、树干、土层、林下岩面等，具有多种多样的生境特征，发育过程只存在真藓型和高领藓型两种萌发类型。萌发型为高领藓型的黄灰藓发育过程中出现块状原丝体，但块状原丝体状态仅存在于孢子萌发初期，存在时间较短，而丝状原丝体存在状态时间较长，说明其生存环境并不是极端干旱环境，这与采集时的环境特点相符。与块状原丝体相比，黄灰蘚的丝状原丝体细胞多为短圆柱型和椭圆形细胞，这也进一步说明其生存环境相对比较干旱的特点。本研究中孢子萌发型以真藓型的藓类占多数，且发育过程中只出现丝状原丝体，这种性状与笔者早期所研究的真藓科（Bryaceae）、丛藓科（Pottiaceae）藓类植物原丝体发育类型有着共性特点[7-8，11]，由此推断，丝状原丝体是生存发育共性选择，是对环境适应较为进化的性状特征。进化的标志特征是为适应大环境所产生的共性的适应性状，孢子萌发型选择真藓型的藓类植物，在发育过程中也恰恰呈现出这种共性特征[11]。

3.3 孢子萌发型与灰藓科植物生殖策略

3.3.1 原丝体发育特征与生殖策略 从藓类植物生境的多样性可以看出生殖策略的多样性，面对高大的被子植物，藓类植物的生境选择存在压力，因此，身体矮小的藓类植物为了扩大种群数量，保持生殖策略的多样性，从而拥有更强大的适应性。

4种灰藓科植物在试验条件下，均完成从孢子萌发到原丝体发育，再到配子体产生的过程（图1-20，1-21，1-22，1-23）。因实验室培养条件优越，水分充足，很少藓类植物在试验条件下产生孢子体。说明在外界环境优越，尤其是水分充足的条件下，藓类植物生殖策略选择了r型生态对策，选择通过无性生殖达到扩大种群目的，避免发生有性生殖带来的生物能量过度消耗[1-2，10]。

金灰藓原丝体细胞在发育中，部分发生细胞缢裂，产生独立于原丝体系统的段状原丝体，这些断裂下来的原丝体依然保持生命力，继续生长，在适宜的环境中可以继续分化生长，发育成新的原丝体系统（图1-15），这种细胞缢裂现象在刘保东等[14]研究过的波叶仙鹤藓原丝体发育过程中也出现过，波叶仙鹤藓轴丝体细胞在横向壁连接处，发生膨胀，两个细胞的接触面积逐渐减小，最后形成“球面接触”而易于断裂（即本文中提到的原丝体细胞的缢裂），脱落后的轴丝体小段则很快逆转为绿丝体继续生长。因此，推测这种现象与原丝体无性繁殖相关，进一步说明金灰藓和波叶仙鹤藓在原丝体发育阶段，只要生长发育环境条件优越，随时可以采取选择无性繁殖的生殖策略，达到快速扩大种群数量的目的。由此也可以看出，在藓类植物生活史中，只要条件允许，可以随时选择无性繁殖的生物学特征[1，11]。原丝体的溢裂现象，也是植物体面对优越的生长条件，进行快速繁殖，达到扩大种群目的的无性繁殖策略。这种现象在丛藓科藓类植物发育过程中也出现过，且种类更多，说明植物面对极端干旱环境，调整生殖策略的灵活性[11]。在野外采集时，4种藓类植物均生长有孢子体，采集生境为林下腐土、腐木或岩面，生境相对实验室内环境干旱很多，因此，植物体面对相对干旱的环境，选择了有性生殖策略，及时完成生活史，产生孢子体以度过恶劣环境。可以看出，对于同一种藓类植物，孢子体产生的时间受制于生境水分的满足度。

4种灰藓科植物中，除了黄灰藓配子体原始细胞分化产生的位置在绿丝体和轴丝体的产生（图1-17），其他的3种藓类植物均在绿丝体上产生（图1-16，1-18，1-19），说明4种藓类植物配子体产生方式的单一性。黄灰藓产生块状原丝体是对干旱生境的适应，在生活史中的生殖阶段，配子体原始细胞分化产生时间为24 d，为4种藓类植物中时间最短的一个种类，其配子体原始细胞发生位置也采用了两种方式，既在绿丝体上产生也在轴丝体上产生，这与该种藓类植物面对干旱环境，采用丰富的生殖策略有着高度相关性。

3.3.2 雌雄同株与生殖策略 分析藓类植物演化史，雌雄异株的藓类植物和雌雄同株的藓类植物生殖特征有较多差异性。但藓类植物生殖条件中最重要的因素是水，生存在阴湿环境，形体比较矮小，伏地生长等特征都是适应借助水媒介完成有性生殖作用，这和其处在进化上的位置有重要的相关性[2，7，10]。如丛藓科藓类植物原丝体发育特征研究证实，对于生长在干旱环境中的藓类植物，雌雄异株的数量明显高于雌雄同株，这是藓类植物进化中，生殖逐步摆脱水的制约，具备更高级性状的表现[11，14-15]。本研究中4种灰藓科植物均为雌雄同株[12]，其野外生境多为腐木生或土生，说明灰藓科灰藓属和金灰藓属藓类植物生殖策略选择上存在差异，雌雄同株的藓类植物对环境的适合度比雌雄异株的藓类植物要低，生活史中对环境水分依赖度强，无性生殖阶段时间长，无性繁殖对种群数量扩增贡献度大[2-6]。要得出更科学的灰藓科藓类植物发育特征与该科进化的相关性，还需对该科不同种藓类植物的发育特征进行细致入微的研究。

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Abstract In order to explore spore germination of  Hypnaceae  family， the spore germination and protonema development of four species in  Hypnaceae， H.cupressiforme， H.fertile， H.pallescens of genus Hypnum and P.polyantha of genus Pylaisia were observed and described at the micron level by means of indoor artificial cultivation. The results indicated that：（1） the spores of the four mosses were composed of single cells， with an average diameter of 10-40  μm; （2） the spores germinated on inside of the wall in H.pallescens and on outside of the wall in the other three species; （3） the four species had common features during their development，which inculded the appearance of no primary rhizoids ，but apearance of secondary rhizoids at the early stage.The appearance of the two forms of massive protonema and filiform protonema produced no primary axonema at the early stage and differentiated caulonema from chloronema at the late stage of protonema development; （4）  Nishidas  classification standard for moss spore germination， spore germination of the four hypnaceae species were analyzed and determined， the H.pallescens belonged to Glyphmitrium-type and H.cupressiforme， H.fertile and P.polyantha belonged to Bryum-type.

Key words Hypnaceae; Spore germination;Protonema development; Sporeling type