陕北地区苹果根际促生菌的筛选及其促生效应

邓振山 李买平 郝雷 陈凯凯 柳晓东 姜影影 贺晓龙

摘 要 为进一步开发苹果根际促生菌资源，以陕北苹果树根际土壤为材料进行根际促生细菌的筛选。以溶磷、解钾和产铁载体作为标准，测定初筛菌株的多种促生能力，并通过16S rDNA序列同源分析，对筛选出的促生效果最好的菌株进行分类鉴定，并采用单菌单独接种和多菌混合接种的小麦盆栽试验，测定其促生效应。结果表明：从陕北不同产地苹果根际土壤中筛选获得131株细菌，具有溶磷能力的菌株共17株，占总分离菌株的10.68%，其中11株细菌能够溶解无机磷，6株细菌能够溶解有机磷；可产铁载体的有24株，占总分离菌株的18.32%，YS-28和YC-31具有解钾能力。基于16S rDNA序列比对和系统发育分析将其中的24株归属于芽孢杆菌属（Bacillus）、假单胞菌属（Pseudomonas）、白色杆菌属（Leucobacter）、红球菌属（Rhodococcus）。从中筛选出属于芽孢杆菌属（LC-22、YC-31、LC-19）和假单胞菌属（LC-2）的高活性菌株的小麦盆栽试验结果表明，与对照组相比，经LC-22、YC-31和LC-19混合菌液处理，小麦幼苗鲜质量增加96.12%；经LC-22、LC-19和LC-2混合菌液处理，小麦叶绿素含量增加41.31%。可见：从苹果根际土壤中所筛选的促生菌株，可以作为微生物肥料储备菌种。

关键词 苹果；根际促生菌；促生效应：盆栽试验

苹果（Malus  domestica），属蔷薇科（Rosaceae）苹果属（Malus  Mill）的植物，为落叶乔木。目前，中国苹果种植在空间分布上呈现出以陕西省和山东省为中心的“双中心”分布特征，且陕西逐渐成为中国重要的苹果生产大省[1]。近年来，由于果农片面依靠肥料养分投入和过分追求产量而施用大量化肥，破坏了土壤中微生态的平衡，导致土壤板结、养分失调等诸多严重的资源环境问题。植物根系与微生物互作对于植物养分吸收，耐受胁迫及抗病等方面具有重要作用，生物菌肥是一种新型的环境友好型肥料，其内所含的植物根际促生菌等有益微生物不仅能给植物提供营养、降低病虫害发生，对植物起到增产的作用，而且还能改善土壤质量，防止其二次污染[2]。因此，对进一步揭示其生态学意义及功能菌株的开发和利用具有重要意义。

根际是指受植物根系及其植物根部活动直接影响的根系周围1～2 mm内的土壤微域[3-4]。该生态位包含有大量微生物如真菌、细菌、放线菌等，其中细菌在该区域的种类和数量最为丰富，通常将这些细菌称之为根际细菌[5]。植物促生细菌是指在植物生长和发育过程中能直接或间接地促进植物生长发育或对病原菌有拮抗作用的有益细菌的统称[6-7]。它们可以自由生活在植物根际土壤周围，也可以定殖在植物根系表皮或内部，通过活化植物根系周围土壤中的养分，来提高植物对土壤营养成分的吸收和利用，有利于植物的健康生长。

近年来，由于根际土壤微生物丰富的物种多样性，使其越来越成为微生物研究的前沿和热点。张伟等[8]以豌豆根际土壤为研究对象，确定了根际土壤细菌的植物促生活性。杨光柱等[9]基于高通量测序的苹果根际土壤细菌组成与多样性分析，结果表明苹果根际土壤中，存在Pseudomonas、Bacillus、Arthrobacter、Erwinia、Flavobacterium、Rhizobium、Serratia和Microbacterium等促生微生物。这说明苹果根际土壤细菌具有丰富的多样性，是宝贵的功能微生物种质资源库，对其挖掘有重要的理论和实践意义。但陕北地区苹果根际土壤微生物多样性以及与植物互作增效的分子机制的相关研究鲜有报道，如何充分发挥苹果与根际微生物良性互作、提高苹果对土壤养分的吸收利用效率仍然是急需解决的瓶颈问题。

本试验以陕北地区苹果根际土壤为研究对象，采用梯度稀释法和平板分离法，对筛选到的可培养细菌多样性及其促生功能进行研究，旨在挖掘陕北地区苹果根际促生菌种质资源，为微生物肥料和微生物菌剂方面的研发应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材  料

1.1.1 样品的采集与处理 于2020年9月从陕西延安市宝塔区、延长县、洛川县和宜川县4个区县（表1），每个区县选3个乡镇，每个乡镇选择3个以上的健康果园，15 a树龄，砧木为昭通海棠，品种为‘红富士。每个果园采样点按照五点取样的方法，每个取样点随机选取相隔一定距离且长势良好的红富士苹果树6棵，以每棵果树树干为中心，分别在东南西北4个方向上距离树干1～2 m范围内用铁锹垂直下挖30～50 cm左右将根暴露出来，釆集根际土壤样品，包装带回实验室，暂时存放于4 ℃冰箱中，2 d内处理完成。

1.1.2 供试培养基 PDA培养基：葡萄糖20 g，琼脂15～20 g，马铃薯200 g，蒸馏水1 000 mL，pH自然。NA培养基：蛋白胨10 g，NaCl 5 g，琼脂15～20 g，牛肉膏5 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.2～7.4。R2A培养基：酸性酪蛋白水解物0.5 g，蛋白胨0.5 g，葡萄糖0.5 g，酵母粉 0.5 g，淀粉0.5 g，K2HPO4·3H2O 0.3 g，MgSO4·7H2O 0.05 g，丙酮酸钠 0.3 g，琼脂15 g，蒸馏水1 000 mL。pH 7.2～7.5。PYG培养基：酵母粉0.2 g，葡萄糖5 g，牛肉膏3 g，细菌蛋白胨5  g，NaCl 0.5 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，琼脂15 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.2～7.5。PKO培养基：葡萄糖10 g，（NH4）2SO4 0.5 g，KCl 0.3 g，NaCl 0.3 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，FeSO4 ·7H2O 0.03 g，MnSO4 ·4H2O 0.03 g，Ca3（PO4）2 5 g，琼脂15 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.0～7.2。无机磷培养基：葡萄糖10 g，KCl 0.3 g，NaCl 0.3 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，（NH4）2SO4 0.5 g，FeSO4·7H2O 0.03 g，MnSO4 ·4H2O 0.03 g，Ca3（PO4）25 g，酵母提取物0.5 g，琼脂15 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.0～7.2。蒙金娜有机磷培养基：葡萄糖10 g，KCl 0.3 g，NaCl 0.3 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，（NH4）2SO4 0.5 g，FeSO4 ·7H2O 0.03 g，MnSO4 ·4H2O 0.03 g，酵母提取物0.5 g，卵磷脂 1 g，琼脂15 g，蒸馏水 1 000 mL，pH 7.0～7.2。解钾培养基：NH4NO3 3.0 g，NaCl 0.2 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，CaSO4·7H2O 0.1 g，蔗糖15 g，钾长石粉5 g，琼脂15 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.0～7.5。CAS检测培养基：20%蔗糖溶液1 mL，10%酸水解酪蛋白3 mL，1 mmol·L-1 CaCl2 100 μL，0.1 mo·L-1磷酸盐缓冲液（pH=6.8） 0.5 mL，CAS染液（a液：将0.012 g CAS溶于10 mL去离子水中，与2 mL 1 mmol·L-1FeCl3混合；b液：將0.015 g CTAB溶于8 mL去离子水中；将a液与b液混合）5 mL。

1.2 方 法

1.2.1 苹果根际土壤细菌的分离纯化 采用稀释梯度法[10]对苹果根际土壤细菌进行筛选。将收集到的根际土壤称取10 g，加入盛有90 mL无菌水和玻璃珠的250 mL灭菌三角瓶中，置于摇床上160 r·min-1振荡30 min，将根际土壤充分溶解，使土壤中的微生物完全释放出来，既得10-1浓度的土壤悬浊液，静置30 s。在超净工作台里，用1 mL无菌吸管吸取10-1浓度的土壤悬浊液于装有9 mL无菌水试管中，吹吸3次混匀，既得10-2浓度的土壤悬浊液。依次从10-2 连续稀释到10-5 ，即得一系列土壤稀释液，用移液枪分别吸取10-3到10-5土壤悬液50 μL，分别接种于已制好的R2A、NA和PYG培养基上，用无菌的涂布器涂抹均匀。每个浓度梯度分别接种3个平板，于28 ℃恒温静置培养3～5 d。待培养基中有可见菌落时，将菌落挑取移入相应培养基纯化，并进行菌落形态描述、编号后，置于4   ℃冰箱中，备用。

1.2.2 菌株促生能力的测定 溶磷能力的测定：将供试菌株接种于牛肉膏蛋白胨培养基上进行活化后分别接种在无机磷和蒙金娜有机磷培养基上，每组设置3个重复，倒置在28 ℃恒温培养箱中培养5～7 d，观察菌落周围有无透明圈出现，若出现透明圈，则初步说明该菌株具有溶磷能力[11]。用测微尺分别测量菌落直径（d）和溶磷圈直径（D）[12-13]，并计算可溶性指数（D/d）值，可溶性指数越大，则说明该菌株溶磷能力越强。

解钾能力检测：将待测菌株在牛肉膏蛋白胨培养基上培养36 h，然后点接在解钾培养基上，28 ℃恒温培养48 h，观察菌落四周透明的解钾圈。若存在透明圈，说明该菌株具有解钾能力。分别测量菌落直径（d）和透明圈直径（D），可溶性指数（D/d）值，可溶性指数越大，则说明该菌株解钾能力越强[14]。

产铁载体能力的测定：将待测菌株接种于CAS培养基上，28 ℃恒温培养48 h，如果平板上生长的菌株能够产生铁载体，检测平板中的蓝色便会褪去，从而证明该菌株具有产铁载体的能力[15]。

1.2.3 促生菌株16S rDNA序列测定及分子鉴定 16S rDNA 序列的PCR扩增：将待测的供试菌株进行划线培养，记录其形态特征。按照菌落PCR[15]方法扩增促生菌株的16S  rDNA，采用细菌通用引物，序列为：P1（5′-CGGGATCCA-GAGTTTGATCCTGGCTCAGAACGAACGCT-3′）和P6（5′-CGGGATCCTACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC-3′）[16]。所用引物由擎科生物合成。

试验扩增目的基因所用的PCR反应体系为2×Es Taq Masterase 25 μL，上游引物P1（10 μmo·L-1）1 μL，下游引物P6（10 μmo·L-1）1 μL，模板DNA  1 μL，ddH2O加至50 μL。PCR反应条件：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，55  ℃复性30 s，72 ℃延伸30 s，31个循环，72 ℃，5 min。1%琼脂糖凝胶电泳来检测PCR扩增产物，条件为90 V、30 min，在紫外分析仪上观察扩增结果。

16S rDNA序列测定、序列比对及系统发育学分析：将16S rDNA序列扩增产物送至上海生工生物工程有限公司进行测序，所用引物与PCR扩增时所用引物相同。将获得的16S rDNA序列提交到NCBI的GenBank基因库，获得GenBank号。同时进行序列比对，与数据库中的已知序列进行同源性分析，选用邻接法构建系统发育树，分析菌株的系统发育学特征[17]。

1.2.4 菌株促生長试验 促生菌株间亲和性测试：使用两两交叉划线法测试各菌株之间的拮抗作用[15]。将促生特性良好的供试菌株每两个交叉，通过平板划线接种至牛肉膏蛋白胨固体培养基上，在28 ℃恒温箱中培养3～5 d，每隔24 h观察交叉点的菌株生长状况，判断两细菌间有无抑制作用[18]。如果交叉处菌株可以正常生长，则说明菌株间不存在拮抗作用，即可共同培养[15]。

促生菌株接种剂的制备：选择上述促生特性最好的4株供试菌株LC-22、YC-31、LC-19和LC-2作为代表菌株，分别接种于PYG液体培养基中，37 ℃，160 r·min-1培养1～2 d。待菌株充分生长后，分别将4株供试菌株发酵液8 000 r·min-1离心5 min，去上清并用无菌水重悬至菌悬液浓度为1×109 cfu·mL-1（OD660≈1）。在每个250 mL的三角瓶内装入100 mL PYG液体培养基，高温灭菌后按照表2中的处理要求分别接种20 mL上述各菌悬液（2株：V∶V=1∶1；3株：V∶V ∶V=1∶1 ∶1；4株：V∶V ∶V ∶V=1∶1 ∶1 ∶1），于37 ℃、160 r·min-1培养2～3 d，8 000 r·min-1离心5 min，去上清并用无菌水重悬至菌悬液浓度为1×109 cfu·mL-1（OD660≈1），即得菌株接种剂[19]。

接种处理：挑取饱满、无霉变、无破损的小麦种子（无包衣），用75%的酒精浸泡30 s进行表面消毒，再用无菌水清洗5～8次后，分别置于装有20 mL上述各处理菌株接种剂的无菌培养皿中，于30 ℃恒温培养箱中过夜。装接种剂之前，每个皿中放两层无菌滤纸，以保持浸泡过程中培养皿内的湿度。种子露白后，将露白的种子播种在装有灭菌珍珠岩和蛭石（V∶V=1∶1）的花盆中，每盆播种30粒小麦种子，深度约1 cm左右，每个处理3个重复，并以无菌水保持其水分充足。待小麦苗出齐后，每盆定苗20株，每周接种菌剂100 mL 1次，共4次，对照同样浇灭菌水100 mL，每2 d浇1次无菌水。40 d后测定小麦苗的株高、根长、鲜质量（整个植株）、叶绿素含量等生物量指标[20]。用SPSS 22.0进行数据统计分析。

2 结果与分析

2.1 苹果根际土壤促生菌菌株的筛选

从陕北苹果根际土壤中分离、纯化共获得131株细菌菌株，其中，洛川县29株，编号为LC；宝塔区33株，编号为BT；延长县39株，编号为YS；宜川县30株，编号为YC，占总分离菌株数的比例分别为22.14%、25.19%、29.77%、22.91%。其中17株具有溶磷能力，2株具有解钾能力，24株具有产铁载体的能力。

2.1.1 溶磷能力 各菌株溶解磷能力的检测结果表明：从苹果根际土壤共筛出11株溶无机磷能力较强的细菌，占全部分离菌株的8.4%。可溶性指数大于4的有4株，分别为LC-22、LC-1、 LC-2、LC-7，其中LC-22最高（见表3和图1）；从苹果根际土壤共筛出6株溶有机磷能力较强的细菌，可溶性指数大于3的有3株，分别为BT-23、LC-7、LC-2，其中LC-2最高（见表4），4株同时对无机磷和有机磷都表现出溶解能力，其中LC-2均对无机磷和有机磷有较好的溶解能力。

2.1.2 产铁载体能力 根据各菌株在CAS检测培养基中是否产生橘黄色或无色的晕圈，筛选具有产铁载体能力的细菌菌株。由表5可知，从分离到的131株细菌中共筛到24株产铁载体能力较好的细菌，占全部分离菌株的18.4%。其中，D/d值大于2的有4株细菌，分别为LC-19、YC-18、LC-7、YC-17，且LC-19的D/d值最大，LC-19产铁载体的能力最强。此外，从溶磷特性结果来看，LC-7菌株还具有较强的溶解有机磷和无机磷能力，是一株既能溶磷又能产铁载体的功能菌株。

2.1.3 解钾能力 由表6可知，从分离到的131株细菌中共筛到2株解钾效果较好的细菌。分别为YS-28和YC-31，其中YC-31的可溶性指数最高，表明其解钾能力较强。

2.2 促生菌株间亲和性测试

选择上述促生效果好的菌株YC-31、LC-19、LC-22和 LC-2间两两划线交叉处均有菌株生长，表明这些菌株间无拮抗作用，可以用作混合菌剂的制备。

2.3 菌株16S rDNA序列系统发育分析

根据菌株促生活性测定结果，选择具有较高的单一促生活性或多种促生活性的24个代表菌株，对分离的各类群代表菌株进行16S rDNA序列系统发育分析和鉴定，采用MEGA  7.0的邻接法构建系统发育树（图2），结果显示：这24株具促生特性的苹果根际细菌16S rDNA序列与GenBank数据库中已报道的相关菌株16S rDNA序列的相似性均达到99.01%以上，其GenBank序列号分别是MF988701～MF988725。这24株促生菌分别归属于芽孢杆菌属（Bacillus）、假单胞菌属（Pseudomonas）、白色杆菌属（Leucobacter）、红球菌属（Rhodococcus）的系统发育分支上，说明苹果树根际和根内具促生特性的细菌存在丰富的种属多样性。分支Ⅰ为芽孢杆菌属，共有13株菌，菌株LC-22和YC-21的最相似菌株分别为Terribacillus sp.和Bacillus thuringiensis；BT-4、BT-6、YC-31、YS-2、LC-19的最相似菌株均为Bacillus subtilis；菌株YS-30、YS-17、YC-2、LC-15、BT-11、BT-10的最相似菌株均为Bacillus sp.。分支Ⅱ由菌株YC-12和其他参比菌株组成。菌株YC-12的最相似菌株为Pseudochrobactrum saccharolyticum。分支Ⅲ为假单胞菌属，有10株菌。菌株LC-7、LC-2、YC-4、YS-14、YS-4的最相似菌株分别为Pseudomona smandelii和Pseudomonas silesiensis；LC-8、YC-18、BT-23最相似菌株均为Pseudomonas sp.；LC-1的最相似菌株为Pseudomonas  oryzihabitans。分支Ⅳ由菌株YS-28和其他参比菌株组成。菌株YS-28的最相似菌株为Leucobacter sp.。分支Ⅴ为红球菌属，由菌株YC-3和其他参比菌株组成。菌株YC-3的最相似菌株为Rhodococcus erythropolis。

2.4 盆栽试验

由表7可知， 对小麦的促生效应的表现结果上看，单菌接种与多菌混合接种各处理组均高于对照组（图3），差异显著（P<0.05）。除少数例外，总体上，多菌混合接种明显优于单菌接种。在株高上，与对照组相比较，小麦增加幅度为8.57%～28.5%，其中WXY多菌混合接种处理组对小麦株高的促生影响最为明显（增幅为28.5%），而WYZ处理对小麦株高的影响最小，比对照仅增加8.57%。根际促生菌各处理之间对小麦根长的影响有差异，单菌接種W组、X组、Y组与对照组相比较分别增加56.98%、32.79%、22.37%，单株菌Z组处理下的小麦根长增加幅度最高，达到71.32%，差异显著（P<0.05）。总体上，混合菌液接种处理效果均高于对照（图4），小麦根长增加幅度为5.38%～70.19%，其中根长增幅最少的是WXYZ处理组，仅为5.38%，远低于单菌接种的效果，差异显著（P<0.05）。此结果说明并不是所有多菌接种处理组对小麦的促生效果都优于单菌接种。在小麦的鲜质量上，与对照组相比，无论是单株菌接种组还是混菌接种组，其对小麦幼苗鲜质量均有不同程度的促生效果。单菌接种X组、Z组、W组及Y组与对照组相比较分别增加29.62%、34.62%、60%和70%，差异不显著。与对照组相比较，多菌混合接种各处理组的小麦鲜质量增加幅度为10.38%～96.15%。在叶绿素含量上，除XZ处理组外，其他多菌接种处理组对小麦叶绿素含量的促生影响均优于单菌接种处理组。与对照组相比，XYZ处理组的叶绿素含量增幅最大（37.73），其次是WZ处理组（37.70），其增幅分别为42.31%和33.21%，差异显著（P<0.05）。而小麦幼苗叶绿素含量增幅最小的是W处理组，其与对照组小麦幼苗的叶绿素含量相近。

3 讨  论

王秀呈等[21]对水稻内生菌Herbaspirillum seropedicae溶磷特性进行研究，发现溶磷圈直径与菌落直径的比值为1.5，属于中等溶磷能力的菌株。刘丽辉等[22]研究表明菌株JH50（Herbaspirillum seropedicae）溶磷D/d值为1.87，比参比菌株溶解无机磷能力高出24.6%；菌株JH40柠檬酸菌（Citrobacter bitternis）解钾D/d值达3.63。本研究从苹果根际土壤中筛选到一批具有溶磷解钾功能的根际菌，其中11株溶无机磷能力较强的细菌，占全部分离菌株的8.4%。

菌株LC-22、LC-1、LC-2、LC-7和LC-22溶磷圈直径与菌落直径的比值即可溶性指数均大于4，其中菌株LC-22可溶性指数最高，为8.86。同时筛出6株溶解有机磷能力较强的细菌，其中菌株BT-23、LC-7和LC-2的有机磷可溶性指数均大于3，菌株LC-2溶有机磷能力最强，达到3.99；且4株同时对无机磷和有机磷都表现出溶解能力，其中LC-2均对无机和有机磷的溶解能力均较强（5.25和3.99）。菌株YS-28和YC-31具有解钾功能，其中YC-31的解钾能力最强，可溶性指数最高，为5.5。本研究中所筛选的根际促生细菌的溶磷解钾能力均远高于上述菌株，说明这些菌株可使难溶的无效态的磷和钾转变为可溶的有效态磷和钾，可为选育微生物肥料菌种储备库与菌肥菌种扩充种质资源，具有广阔的应用前景。

本研究结果显示，对小麦幼苗株高促生效果最好的单株菌为YC-31（W）、对鲜质量促生效果最好的单株菌为LC-22（Y）、对根长和叶绿素含量促生效果最好的单株菌LC-2（Z），与对照组相比较，分别增加21.02%、70.01%、71.32%和17.22%；混菌接种对小麦幼苗的株高促生效果最好的组合为WXY、对鲜质量和根长促生效果最好的组合为WXZ，叶绿素含量促生效果最好的组合为XYZ，较对照组分别增加28.55%、96.15%、70.19%和41.31%。除个别处理组外（WXYZ），总体上多株菌接种的促生效果更好，此结果与韩文星等[20]的研究结果一致。

但通过比对各处理组间的促生效果差异发现，并不是所有混菌接种处理组对小麦幼苗的促生效果最好，有的单菌接种的促生效果较混菌接种更为明显，此结果与邓振山等[14]的研究相同。出现这种现象的原因可能是由于多株菌混合后产生了某种物质，从而抑制了菌株产生的促生长因子发生效应。结合以上分析以及各组处理对小麦幼苗的促生效果，结果表明小麦幼苗在混菌接种接种剂WZ、YZ、WXZ、WYZ后，对小麦幼苗的各项生长参数均表现出较好的促进效果。近年来，随着植物根际促生菌与植物间互作机理研究的深入，植物根际促生菌的应用也越来越广泛，其中，有很多研究已经报道了植物根际促生菌对各种作物具有增产、增效的多重促生效果[23]。目前，一些植物根际促生菌被开发成生物菌肥或活体制剂，在农作物上具有防病害、促生长以及改善土壤质量等作用，具有十分广阔的研究和产业化前景。因此，可以将其作为微生物复合菌肥的材料，但还需在田间对各菌株的定殖能力、促生能力和复合菌株中的优势促生菌进一步验证与探究。这还需对其在大田应用中进行菌种活性检测及实际的促生效果等做进一步深入研究，进而应用于实际大田农作物上，并发挥最大的促生效应。

4 结  论

本研究从陕北不同产地苹果根际土壤中分离到131株促生细菌。其中具有溶磷能力的菌株共11株，占总分离菌株的10.68%；可产铁载体的有24株，占总分离菌株的18.32%。在26株具有促生作用的菌株中，13株属于芽孢杆菌属和10株属于假单胞菌属。对初筛菌株进行促生能力的测定，其中4株菌株同时具有多种促生作用。采用16S rDNA序列系统发育分析，结果显示菌株LC-22、YC-31、LC-19属于芽孢杆菌属（Bacillus），菌株LC-2属于假单胞菌属（Pseudomonas）。对促生菌株的系统发育学分析结果显示：芽孢杆菌属和假单胞菌属的占比最大，这与目前报道的大部分芽孢杆菌属（Bacillus）的菌株具有促生特性的结果一致[22]。通过小麦盆栽试验对各促生菌株促生效果的验证结果表明，与对照组相比较，单菌接种与混菌接种的各组处理组对小麦幼苗的生长均具有促进作用。

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Abstract The rhizosphere soil of apple tree in northern Shaanxi area was used as a separation material to screen  growth-promoting bacteria. Based on the analysis of 16S rDNA sequences，the phylogenetic relationships of representative strains were determined，the activity of phosphorus and potassium dissolution and siderophore production were tested，and a pot experiment with a single inoculation and multi-microbe mixed inoculation was conducted to determine their growth-promoting effect. The results showed that a total of 131 strains of bacteria were isolated from apple rhizosphere soil in four different counties and districts in northern Shaanxi，and the growth-promoting ability were measured. Among  them，17 strains had phosphorus-soluble ability，accounting for 10.68% of the total isolates，11 strains could dissolve organic phosphorus and 6 strains could dissolve inorganic phosphorus. 24 strains could produce siderophores，accounting for 18.32%. In addition，strains YS-28 and YC-31 could dissolve potassium. Subsequent 16S rDNA sequence alignments and phylogenetic analyses revealed that these strains could be categorized into 4 genera（Bacillus，Pseudomonas，Leucobacter and Rhodococcus）. 4 highly active strains were screened out，in which LC-22，YC-31，LC-19 belonged to Bacillu，and LC-2 belonged to Pseudomonas. Compared with the control，under mixed treatment of LC-22，YC-31 and LC-19，the fresh mass of wheat seedlings increased by 96.12%; under mixed treatment of LC-22，LC-19 and LC-2，the chlorophyll content in wheat seedlings increased by 41.31%.In conclusion，the growth-promoting bacteria screened out from rhizosphere soil of apple tree have a strong potential to promote rice growth，and can be used as a microbial fertilizer reserve for bacteria. This study laid a solid foundation for the further development of microbial fertilizer.

Key words Apple; Promoting growth rhizosphere bacteria; Promoting effect; Pot experiment