异种肾移植：生理学研究的现状及发展趋势

宋佳华 余一凡 邓文艺 宋相钦 靳帅 李涛 钱坤 王毅

器官移植是各类终末期器官疾病最有效的治疗手段，为了解决器官移植中供者短缺的问题，人们开始探究异种移植。随着猪-非人灵长类动物（non-human primate，NHP）肾移植实验的不断发展，异种移植亚临床研究在世界范围内不断升温，研究者们在异种移植排斥反应、感染等方面积累了大量数据。2021 年9 月和11 月，Montgomery 等[1]分别完成2 例保留患者原肾的α-1, 3-半乳糖基转移酶（α-1,3-galactosyltransferase，GATT1）基因敲除（GTKO）猪-脑死亡肾移植，移植后的猪肾功能正常且术后54 h 内未发生排斥反应。同期，Porrett 等[2]对脑死亡患者行双肾切除术，并移植10-基因编辑猪的双肾，术后74 h 未见发生排斥反应，移植肾灌注良好。在异种移植临床研究中，研究者们普遍认为猪肾的生理功能对患者长期预后将产生重要影响，但是具体促红细胞生成素（erythropoietin，EPO）、肾素-血管紧张素-醛固酮系统（renin-angiotensinaldosterone system，RAAS）、有活性的维生素D3对移植肾功能及患者本身具有何种影响仍然需要大量研究。EPO 生成的减少、电解质紊乱有可能导致移植术后肾功能代谢紊乱、酸碱平衡失调。并且肾移植的优势在于如果器官衰竭或患者出现危及生命的感染，则可以切除移植物，停止所有免疫抑制治疗，并重新引入慢性透析[3]。积极开展异种移植生理学研究，切实推动异种来源EPO、肾素、钙磷平衡实验研究，积累异种来源器官在生理学方面的研究经验，为将来延长异种移植物的存活提供一些理论指导。

1 EPO 与异种移植

EPO 是一种刺激骨髓产生红细胞的激素。生理方面，人类产生EPO 的第一个部位是神经嵴，再从胎儿期的肝脏转移到出生后的肾脏[4]。结构方面，全长人EPO 的一级结构包含166 个氨基酸，其分子量约为30.4[5]。1993 年，Wen 等[6]获得了编码多种哺乳动物成熟EPO 蛋白的互补DNA（complementary D N A，c D N A）序列，通过聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增技术得到猴、猪的EPO cDNA。进而从中推断出成熟EPO 蛋白的氨基酸序列，结合已知的人类序列，推断出人EPO 与猴EPO 相同区间为91%，与猪EPO 相同区间为80%～82%，猪与NHP 的氨基酸同源性也超80%。由此可见，猪的EPO 与人类具有高度的同源性，但并不是完全一致。猪肾产生的EPO 能否在NHP 中发挥作用？猪与NHP 之间有无生理相容性？是否有必要通过基因敲除技术去改变氨基酸差异？目前有关这一方面的研究还比较少，值得深入探讨。

1.1 EPO 及其受体的影响机制

EPO 受体（EPO receptor，EPOR）是一种跨膜糖蛋白，其基因位于19 号染色体短臂，长约5.0～6.5 kb。由8 个外显子和7 个内显子构成，分子量为62，由507 个氨基酸组成。EPOR 是Ⅰ类细胞因子受体超家族的成员，包含一个胞外结构域、一个跨膜结构域，一个缺乏酪氨酸激酶活性和与位于跨膜域近端的保守氨基酸基团（WSXWS）激酶结合，形成同源二聚体、异源二聚体或异三聚体的复合体。其中，同源二聚体将在红系祖细胞上激活并通过Janus 激酶（Janus kinase，JAK）2 触发下游信号通路，紧接着通过信号传导和转录激活因子（signal transducer and activator of transcription，STAT）5、丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）和磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）等下游通路维持红细胞的生成[7]。异源二聚体是由EPOR 单体亚基和β 共同受体CD131 组成，其中EPOR-CD131 需要更高浓度的EPO 才能激活，并与其促进红细胞的生成、组织保护作用如介导抑制促炎因子和抑制凋亡有关[8]。笔者认为，目前器官移植领域缺少异种来源EPO 在不同物种间的研究，EPOR 对其功能的实现存在着显著的影响，是一个潜在的研究方向，并且猪EPO 与人的EPO 结构不同，其能否与人的EPO 结合位点EPOR 结合，是否对人体具有有害作用，目前还没有定论。

1.2 EPO 的贫血治疗作用

在健康的成年人中，肾脏产生的EPO 占循环EPO 的90%[9]。虽然在终末期肾病（end-stage renal disease，ESRD）患者中，肝可以代偿性增加EPO 的合成，但这并不足以预防贫血[10]。在以往的研究中，有研究者报道过狒狒在猪肾异种移植手术后发生贫血，并积极采用外源性EPO 治疗的案例，但其治疗效果仍存在争议。即使猪-NHP 异种模型已进行了大量研究，仍不能明确猪的EPO 在NHP 中是否发挥了作用[11]。猪EPO 能否充分刺激宿主的骨髓仍然值得研究。当然，也可以通过基因工程将人EPO 基因整合入猪细胞中，帮助其克服生理差异。需要注意的是，猪肾的血红蛋白水平较低，这可能会在移植到人类体内时改变EPO 的产生[12]。已有学者提出A 型血的猪GGTA1/胞苷单磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶（cytidine monophospho-N-acetylneuraminic acid hydroxylase，CMAH）双敲除可能导致与贫血症状非常相似的病理学特征的发展[13]。探究异种移植基因敲除猪是否会导致贫血，是否会影响受者造血功能对异种移植研究具有重要意义。当然，贫血也可能跟频繁抽血和骨髓免疫抑制药的应用有关[14]。

在慢性肾病（chronic kidney disease，CKD）患者中，肾脏的周细胞转分化为肌成纤维细胞，随后EPO 的产生能力下降并导致肾性贫血[15]。由此可见，CKD 患者的病变肾脏不能产生EPO。同时，肾血流量影响肾脏的氧供应，缺氧也可增加急性肾损伤的易感性[16]，加速CKD 的进展[17]，这说明EPO 生成同时也受血氧含量的影响[18]。这就要求研究者密切关注异种肾脏在受者体内的表现，例如血管衔接情况、血氧含量、肾脏纤维化程度、肾功能情况等。

1.3 EPO 的免疫调节作用

移植术后需长期服用免疫抑制药，这增加了感染的发生率，对受者而言是一个巨大的挑战，而EPO能够抑制体液免疫，减轻排斥反应。Guglielmo 等[19]通过小鼠实验证明EPO 抑制滤泡辅助性T 细胞（follicular helper T cell，Tfh）的分化，抑制Tfh 依赖的抗体形成及抑制了小鼠同种异体心脏移植的T 细胞依赖性排斥反应。同时也有相关研究表明含有共刺激阻断的免疫抑制方案中添加EPO，可防止人类移植受者的排斥反应和延长移植物存活时间[20]。EPO已被证明可以降低促炎因子水平，增强细胞凋亡和细胞清除，同时促进调节性T 细胞（regulatory T cell，Treg）的诱导[20-21]。由此可见，EPO 具有免疫调节功能，虽然目前EPO 在移植中的作用并不完全清楚，有关异种肾移植方面的研究也比较少。但是目前有关自身免疫性疾病及间质性肾炎的相关文献表明，单核细胞也能产生EPO，EPO 能直接抑制辅助性T 细胞（helper T cell，Th）17 分化，Th17 在促进自身免疫和抗肿瘤免疫方面发挥作用，而异常的Th17 反应可导致黏膜器官炎症、损伤和功能障碍[22]。同时，在移植术后贫血患者使用EPO 过程中抑制Th17 会导致Th17/Treg 之间比例失衡，加速肿瘤的发生[23]，因此，效应Th17 和Treg 之间必须保持平衡，以保证移植术后患者既不会新发肿瘤，也不会引起排斥反应过强。探究EPO 在异种移植中的免疫抑制作用，将有助于减轻排斥反应，延长术后长期存活时间，合理规划免疫抑制药的使用。

1.4 EPO 的肾脏保护作用

缺血-再灌注损伤是肾移植受者常见的手术并发症，Zhou 等[24]研究者表明经EPO 预处理的骨髓间充质干细胞能够缓解移植后缺血-再灌注导致的急性肾损伤，保护细胞免于凋亡，对器官具有较好的保护作用。EPO 除了通过改善缺血-再灌注损伤保护器官外，还能通过纠正贫血来延缓肾功能恶化[25]，贫血的严重程度也与移植物衰竭和死亡密切相关[26]。需要注意的是，肾移植术后早期输血虽可以短期内把血红蛋白提高到正常范围，但是这可能加速肾功能恶化，降低移植物的存活率[27]。因此，既要早期用药防止肾性贫血的发生，又要注意监测，防止肾功能加速恶化。由此可见，EPO 在降低缺血-再灌注损伤、纠正肾性贫血、减缓移植物失功等方面具有一定的保护作用，可延长患者生存期，降低患者二次移植的发生率。

2 RAAS 与异种移植

在异种移植实验中，肾脏解剖学的差异引起了人们的广泛重视，虽然猪肾在大小、形状和功能上与人类的肾脏相似，但与人类的肾脏相比猪肾脏浓缩尿液的能力存在一定差异。这是由于猪肾的肾单位比人类肾脏少，排泄的尿液量更大，虽然大体解剖特征相似，但浓缩尿液的能力与人类肾脏相比效率较低，显著影响着术后长期存活率。异种移植实验中针对RAAS 的研究迫在眉睫。

2.1 RAAS 的肾脏保护作用

肾素由肾脏入球小动脉的近球细胞合成、贮存并释放到血液中。当机体循环血量减少或血压下降时肾血流量减少，刺激肾脏近球细胞肾素分泌增多，肾素能够将血管紧张素原（angiotensinogen，AGT）转变成血管紧张素（angiotensin，Ang）Ⅰ，Ang Ⅰ在血管紧张素转换酶的作用下，形成具有降解缓激肽作用的Ang Ⅱ。Ang Ⅱ具有很高的生物活性，有强烈的收缩血管作用，使血压升高同时促使醛固酮分泌，潴留水钠，刺激交感神经节增加去甲肾上腺素分泌，增加交感神经递质和提高特异性受体的活性等，导致血压升高。

猪-狒狒的体内模型实验表明，猪肾分泌的肾素降低了NHP 中的AGT 活性，猪肾浓缩尿液的能力也下降，并且血浆中Ang Ⅱ的产生被抑制可能导致低血容量和低血压发生[28]。异种移植后，血浆肾素活性和醛固酮水平显著降低[29]，人AGT 在体外不能被猪肾素有效地切割。在CKD 患者，尤其是ESRD 患者中，存在着RAAS 的过度激活[30]。研究提示血浆Ang Ⅱ浓度降低可能是由于猪肾素与狒狒AGT 的反应性降低，这说明RAAS 改善低血容量和低血压的能力受到一定损伤，维持RAAS 的稳定将更好地保护移植肾。在异种移植实验中，RAAS 作为一个低血容量监测激素系统来维持动脉血压，检测RAAS 有助于调节细胞外液和血容量以及全身血管阻力。

2.2 RAAS 的血压维持作用

猪与人存在生理差异，人的AGT 只能被人的肾素识别并切割，而不能被其他哺乳动物的肾素识别并切割[31]，这也许是物种间基因差异导致的识别蛋白质结构过程中的区别。猪肾素具有严格的底物特异性，NHP 的AGT 在体外研究中被证明是猪肾素的不良底物[12]。即使AGT 在所有NHP 中的化学结构都是相同的[28]，但在猪-狒狒的体内研究中也证实猪肾素对NHP 的AGT 活性降低，这可能导致狒狒受体的血管收缩能力降低，并导致在体内保留液体的能力受损，由于人与NHP 的生理相似性，推测猪肾素对NHP 的AGT 活性与人类相同。因此，猪的肾素不能切割人的AGT。目前还不确定猪肾产生的肾素是否会影响血容量状态，应进行进一步的观察和研究。在以往的异种移植实验中时常有发生低血容量和低血压的报道，研究者们一般建议用基因工程生产人的肾素，不建议敲除猪肾素基因，他们认为这会影响猪的健康[32]。同时低血容量和低血压也提示RAAS 可能受损。异种移植后NHP 体内电解质稳态的机制尚不清楚，因为RAAS 在移植后可能受到损害。在异种移植的背景下，猪肾素活性降低可能导致醛固酮的产生减少和低血容量介导的血流动力学不稳定[33]。目前尚不确定在猪移植物中产生的肾素是否能维持人的RAAS 稳定。

2.3 RAAS 对移植受者的影响

在同种肾移植手术中，很少切除患者的原肾。原肾可能产生残留的肾素，但从终末期肾脏分泌的肾素不太可能满足生理需求，特别是需要透析的患者[28]。在CKD 患者中，肾血流随着肾萎缩而减少，并且80%～90%合并有高血压，这主要是由于肾单位大量丢失，导致水、钠潴留和细胞外容量增加，以及肾脏RAAS 激活与排钠减少。在首个测量猪肾移植到免疫抑制NHP 的功能研究中，ESRD 患者接受猪肾移植后，原肾可能会留在原位，并仍可能残留一些过滤功能，但这估计是总肾小球滤过率（glomeruar filtration rate，GFR）的10%。在异种移植中，虽然已有的研究结果表明，移植到狒狒体内的转基因猪肾能够维持狒狒相对正常的肾功能[34]，但进行性肾损伤的结果提示，这是肾单位代偿的结果。因此，了解受体的肾过滤和分泌功能，以及在猪肾移植到NHP 后，其是否随时间变化至关重要。如果猪到人的异种肾移植要想成功，必须提供足够和可持续的GFR。准确评估异种肾移植后GFR 的演变对于临床决策和药物剂量至关重要。因此，使用尿或血浆清除内源性或外源性过滤标志物来测量GFR 成为首个人类异种移植研究的关键因素[33]。

在体内研究测量异种肾移植后NHP 中RAAS 通路的成分将有助于了解猪肾素活性。另一个需要考虑的因素是猪移植物产生AGT 的能力。据笔者检索文献，尚无猪肾移植的体内研究表明猪肾素在NHP 中的活性。如果猪肾素不能以临床显著的速率切割人或NHP 的AGT，可能需要考虑产生基因工程表达人肾素的猪。

3 钙磷代谢与异种移植

随着CKD 的发病率越来越高，CKD 继发钙磷代谢紊乱的临床并发症也越来越多，如继发性甲状旁腺功能亢进、活性维生素D 分泌异常、成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor，FGF）-23 增多等。当然，在异种移植中也不例外。在CKD 及肾移植受者体内钙磷代谢紊乱主要受甲状旁腺激素（parathyroid hormone，PTH）、活性维生素D 及FGF-23 的调节[35]。首先，PTH 使破骨细胞活性和数目增加，导致血钙水平升高。随着骨骼中钙的释放，磷也会被释放出来。因此，PTH 作用于肾脏，重新吸收钙和排泄磷。为了恢复骨中的钙和磷，PTH 还能激活肾脏中的1-α 羟化酶，将维生素D 转化为其活性形式，进一步导致肠道对钙和磷的吸收增加，即PTH 抑制肾小管对磷的吸收，促进肠道钙、磷的吸收。当血磷水平较高时，FGF-23 会从骨中释放出来。FGF-23 是一种强效的磷酸化激素，可导致尿中磷酸盐的排泄增加，并且通过抑制1-α 羟化酶的表达，抑制近端肾小管中1，25-二羟维生素D3的产生，通过增加24-羟化酶的转录来激活降解[36]，从而阻止维生素D 相关的肠道对磷的吸收，并对PTH 水平进行调节。

维生素D-PTH 轴在CKD 患者中发挥了重要作用。CKD 患者早期血钙、磷和PTH 基本维持正常，随着肾功能的恶化，肾脏1，25-二羟维生素D3合成下降[37]。因此，出现低钙和高磷血症，PTH 进一步释放，引起继发性甲状旁腺功能亢进。在尿毒症患者行肾移植术后，随着肾功能的恢复，低钙血症及高磷血症得到纠正。因此，异种移植术后的高钙血症和低磷血症也很常见[29]。在异种移植受者体内，PTH 将作用于异种来源肾脏，并参与钙的重吸收与磷的代谢。骨、甲状旁腺和肾脏之间这种相互依赖的激素关系在异种移植实验中存在许多干扰因素，其正常生理功能可能受到一定影响。例如，猪肾移植入狒狒体内后机体出现了低磷血症[38]；猪的血钙和磷酸盐水平高于人类，这表明在不同物种间钙磷代谢平衡确实存在差异。高钙血症也与早期移植肾功能延迟恢复和红细胞增多有关[39]，维生素D 还可以作为RAAS 的负调节剂。可见，猪肾移植后生理功能之间相互影响，共同调节肾脏的内环境稳态。

此外，在猪-NHP 的实验中，转基因猪肾移植到狒狒体内后存活最长时间超过500 d[40]。但由于这些模型采用的免疫抑制方案与临床差异较大、且模型的生理结构与人体存在差异等限制条件，这些实验未能很好地研究猪肾对人体生理刺激引起的不良反应[41-42]。因此，猪异种移植物对涉及钙和磷酸盐平衡的生理刺激的反应程度也还有待确定[33]。比如，猪肾移植物对人体内产生的FGF-23、PTH 和维生素D 是否有类似的反应，猪肾移植物中的钙敏感受体对血钙水平的变化是否也有类似的反应，这些都值得进一步研究。

4 结 语

在目前移植器官短缺的情况下，对于长期等待肾移植的患者来说，接受猪肾移植的好处明显大于慢性透析[43]。猪和人类的生理机能之间存在着差异，这会导致一些未知的不良反应。猪肾无法激活RAAS，或扰乱人类受者的磷酸盐平衡，或造成肾性贫血，这是异种肾移植的潜在障碍。然而，这些障碍有望通过移植后的早期识别和管理来克服。近年来2 例成功的异种肾移植经验表明，在关注排斥反应、病毒传播、免疫状态等问题的同时，不能忽略对异种移植生理学的研究。在未来，研究者们可以借鉴目前已有的人源化胰岛素、血清蛋白、凝血因子等基因修饰猪的方法去构建模型，探究异种肾移植物生理方面的相关问题。随着异种移植亚临床研究的进一步推进，在不远的将来，异种来源EPO、RAAS、钙磷代谢、维生素D3的生理相容性问题或将成为研究热点。