21种化学药剂对猕猴桃黑点病菌(Diaporthe phaseolorum)的室内毒力及田间防效

王 丽,田玉洁 ,刘 巍,黄丽丽,2, 秦虎强

(1.西北农林科技大学 植物保护学院,陕西杨凌 712100,2.旱区作物逆境生物学国家重点实验室,陕西杨凌 712100)

猕猴桃黑点病(Kiwifruit black spot disease)[1]俗称猕猴桃果实黑头病,也称黑点病,是近年在陕西猕猴桃生产中新出现的一种重大果实病害,该病害在陕西各猕猴桃主产区均有发生,尤以‘翠香’‘徐香’品种上发生较为普遍,危害连年加重。2020年,付博等[2]首次报道认为陕西省周至等地发生的猕猴桃黑点病病原菌为间座壳属真菌(有性态)(Diaportheeres),无性态为拟茎点霉属(Phomopsis);该病菌主要危害猕猴桃果实,也可侵染叶片和嫩枝(室内人工接种),但田间较少见到叶片和嫩枝病症。侵染果实表皮发病后在果实表皮上产生大量黑斑,可导致果实及早成熟、变软、早落,后期果皮变黑、果实变软、果肉腐烂、贮藏期极易腐烂变质等[2],严重影响产量、果肉品质和商品性,当地果农深受其害、损失严重。据2018-2020年夏秋季西北农林科技大学果树病害病原生物学及综合防治研究实验室猕猴桃重点病害防探课题对眉县、周至县两大猕猴桃产区10个乡镇主要栽培品种田间果实黑点病调查结果,发病品种主要为‘翠香’和‘徐香’;一般田块病果率在10%～50%,平均病果率达到30%以上,严重田块病果率达到90%以上,对猕猴桃生产造成巨大损失,加上缺乏防控技术,严重影响和阻碍了猕猴桃产业的持续稳定发展,已成为生产中亟待解决的突出问题。目前尚未见到有关猕猴桃黑点病发生规律及化学防治方面的研究报道。为明确其化学防治技术,采用菌丝生长速率法,测定了21种不同化学药剂对猕猴桃黑点病菌的毒力,并选择其中16种药剂进行田间药效试验,以便筛选出对猕猴桃黑点病有效防治药剂,明确其田间防治效果。

1 材料与方法

1.1 室内药剂毒力测定

1.1.1 供试菌株 猕猴桃黑点病病原菌间座壳属真菌(Diaporthephaseolorum)由西北农林科技大学果树病害病原生物学及综合防治研究团队实验室分离并保存。对病原菌进行活化培养后,将菌饼保存在甘油中,并置于-80 ℃恒温培养箱中培养保存,备用。

1.1.2 供试培养基 PDA培养基制备过程:取新鲜马铃薯200 g,去皮,切成大小均匀的小块,锅内加入≤1 L的水,放入马铃薯块煮沸至适宜程度(用玻璃棒可以轻松戳穿),用纱布将培养基过滤至烧杯中,并称量20 g葡萄糖放入烧杯中,搅拌至完全溶化,加水补足1 L。称取15～20 g琼脂粉备用,分别放入3个500 mL三角瓶中,并将1 L培养基分装于其中,每个三角瓶中加入约400 mL,包扎严密,121 ℃湿热灭菌45 min,备用。

1.1.3 供试仪器及材料 仪器:RQX-380D智能人工气候箱、101A-2ET电热鼓风干燥箱、VS-840K-U超净工作台、BCD-216FTB海尔家用电冰箱、ZPS-160恒温生化培养箱、SX-500高压蒸汽灭菌器等。

材料:培养皿(d=8 cm)、2 mL、10 mL和50 mL离心管、100 mL和400 mL的三角瓶、玻璃棒、量杯、药勺、试管、刻度直尺等常规试验材料。

1.1.4 供试药剂 18.7%丙环·嘧菌酯(丙环唑11.7%+嘧菌脂7%)悬浮剂(SC),先正达(中国)投资有限公司生产;30%氟酰羟·苯甲唑(氟唑菌酰羟胺7.5%+苯醚甲环唑12.5%)悬浮剂(SC),先正达(中国)投资有限公司生产;25%吡唑醚菌酯乳油(EC),巴斯夫植物保护(江苏)有限公司生产;43%戊唑醇悬浮剂(SC),拜耳作物科学(中国)有限公司生产;30%苯甲·丙环唑(苯醚甲环唑15%+丙环唑15%)乳油(EC),先正达(中国)投资有限公司生产;50%腐霉利可湿性粉剂(WP),日本住友化学株式会社生产;30%啶 酰·咯菌腈(啶酰菌胺24%+咯菌腈6%)悬浮剂(SC)[3],陕西上格之路生物科学有限公司生产;1.8%辛菌胺醋酸盐水剂(AS)[4],陕西省西安嘉科农化有限公司生产;20%烯肟·戊唑醇(戊唑醇10%+烯肟菌胺10%)悬浮剂[5],沈阳科创化学品有限公司生产;10%苯醚甲环唑水分散粒剂(WG),深圳诺普信农化股份有限公司生产;27%寡糖·吡唑酯(氨基寡糖素2%+吡唑醚菌酯25%)水乳剂(EW),海南正业中农高科股份有限公司生产;20%抑霉唑水乳剂(EW),一帆生物科技有限公司生产;24%腈苯唑悬浮剂(SC),美国陶氏益农有限公司生产;25%抑霉·咯菌腈(抑霉唑20%+咯菌腈5%)悬乳剂(SE),一帆生物科技集团有限公司生产;62%嘧环·咯菌腈(咯菌腈25%+嘧菌环胺37%)水分散粒剂(WG),先正达(中国)投资有限公司生产;40%百菌清可湿性粉剂(WP)[6],四川稼得利科技开发有限公司生产;50%多菌灵可湿性粉剂(WP),山东华阳科技股份有限公司生产;80%甲基托布津可湿性粉剂(WP),西安204所农用化学品有限公司;5%氨基寡糖素水剂(AS),海南正业中农高科股份有限公司;糖醇钙(Ca≥180 g/L)水剂(AS),河南萃可多生物科技有限公司;硝酸氨钙(Ca≥18%,N≥15%)可溶性粒剂(SG),天津市天力化学试剂有限公司。

1.1.5 菌株的活化与材料准备 将保存于 -80 ℃的供试菌饼转接到PDA培养平板上,于 28 ℃无光照条件进行扩繁;准备培养皿、试管、离心管、量杯、烧杯、蒸馏水等仪器与材料,为接下来的试验做准备。

1.1.6 药剂浓度梯度设置及含药培养基制备 药剂浓度梯度设置见表1。根据表2预试验设置浓度梯度稀释药液,各药剂的每个质量浓度梯度取450 μL加入装有45 mL PDA培养基的三角瓶中,摇匀,平均倒入3～4个培养皿中(即3～4个重复),待接菌。

表1 供试药剂及质量浓度设置Table 1 Tested reagent and mass concentration setting

表2 21种药剂对猕猴桃黑点病菌毒力测定结果Table 2 Toxicity test of 21 fungicides against Diaporthe phaseolorum

1.1.7 药剂室内毒力测定 采用杀菌剂的菌丝生长速率法[7-8]。首先取出在PDA培养基上转接活化5 d后的猕猴桃黑点病菌,在无菌操作台中用内径为6.0 mm的灭菌打孔器沿菌落边缘切取菌饼,并按菌丝面朝下的方式接种于含药平板中央,密封后放入28 ℃恒温培养箱内,连续培养5 d后测量各处理菌落直径。以不含药剂的 0.1%的吐温80水溶液处理作空白对照,每处理做4个重复。采用十字交叉法垂直测量,求其平均值。根据4次重复的试验结果,求出各处理浓度梯度的平均菌落生长直径,并计算不同处理浓度对猕猴桃黑点病的菌丝生长抑制率[9]。

菌落生长直径=各处理菌落直径-菌饼直径(6.0 mm)

菌丝生长抑制率=[(对照菌落直径-处理菌落直径)/对照菌落生长直径]× 100%

1.2 田间药效试验药剂

1.2.1 试验地情况 试验地点:试验田设置在陕西省周至县广济镇上二屯村,土壤肥力、土质状况中等,近几年‘翠香’品种黑点病发生较重,试验园栽培管理、土壤及水肥条件均中等一致。供试猕猴桃品种为‘翠香’,植株行距约4 m,株距约 2 m,树龄约8～10 a,长势一般。

1.2.2 试验处理 试验设:①18.7%丙环·嘧菌酯SC 600 g/hm2(1 500倍);②62%嘧环·咯菌腈WG 600 g/hm2(1 500倍);③20%氟酰羟·苯甲唑SC 600 g/hm2(1 500倍);④43%戊唑醇SC 225 g/hm2(4 000倍);⑤20%抑霉唑水乳剂(EW)900 g/hm2(1 000倍);⑥25%吡唑醚菌酯EC 720 g/hm2(1 250倍);⑦50%腐霉利WP 600 g/hm2(1 500倍);⑧10%苯醚甲环唑WG 600 g/hm2(1 500倍);⑨硝酸氨钙 (SG) 1 500 kg/hm2(土施);⑩戊唑醇(430 g/L)悬浮剂(SC)450 g/hm2(2 000倍);24%腈苯唑悬浮剂(SC)900 g/hm2(1 000倍);27%寡糖·吡唑酯水乳剂(EW)900 g/hm2(1 000倍);30%啶酰·咯菌腈悬浮剂(SC)900 g/hm2(1 000倍);1.8%辛菌胺醋酸盐(AS)900 g/hm2(1 000倍);20%烯肟·戊唑醇悬浮剂(SC)900 g/hm2(1 000倍);5%氨基寡糖素SL(1 800 g/hm2)+糖醇钙SL(1 800 g/hm2)(500倍);不施药空白对照。

1.2.3 试验方法 试验1于2020年6月24日、7月8日共施药两次,8月15-17日药效调查;试验2于2021年7月7日、7月31日,共施药两次,8月15日药效调查;每试验处理10～15株,试验重复3次。均使用HY-16L-B2背负式手动喷雾器,按照施药剂量兑水喷雾,尽量使药剂均匀全面地覆盖在叶片正背面,药液量为60 kg/666.7 m2。

1.2.4 试验调查 分别于施药前及最后一次施药后10～15 d调查田间发病情况,每个处理小区调查5株,每株随机调查100个果实,记录调查病果率及病级,计算各供试药剂处理病情指数及防效;同时,施药后3、7 d观察果树对不同药剂处理的反应及安全性。

病害病情调查分级标准:以病斑面积占整个果实表面积百分率来分级,共分6级。

0级:果实表面无病斑;1级:果实表面病斑面积≤5%;3级:果实表面病斑面积>5%,≤15%;5级:果实表面病斑面积>15%,≤30%;7级:果实表面病斑面积>30%,≤45%;9级:果实表面病斑面积>45%。病果率(%)=(病果数/调查果实数)×100

病情指数=[∑(各级病果数×级值)/(最高级值9×调查总果实数)]×100

防治效果=[1-(CK0× PT1)/(CK1× PT0)]×100%

式中:CK0空白对照区药前病指; PT1处理区药后病指; CK1空白对照区药后病指; PT0处理区药前病指。

1.3 数据统计与分析

采用 DPS数据处理系统分析软件[10],对室内毒力测定结果各药剂浓度梯度值及其相应的菌丝生长抑制率进行回归分析,分别计算21种杀菌剂对猕猴桃黑点病菌菌株的EC50、相关系数、回归方程;对田间药效试验结果进行方差分析,采用Duncan氏新复极差法进行多重比较和差异显著性比较。

2 结果与分析

2.1 21种杀菌剂对猕猴桃黑点病菌室内毒力测定结果

表2结果显示,①供测试的21种杀菌剂中有20%烯肟·戊唑醇SC、30%啶酰·咯菌腈、43%戊唑醇SC、18.7%丙环·嘧菌酯SC、20%氟酰 羟·苯甲唑SC、27%寡糖·吡唑酯EW、30%苯甲·丙环唑EC、25%抑霉·咯菌腈SE和24%腈苯唑SC 9种药剂对黑点病菌具有极强的抑菌效果,其EC50值均达0.05～1.12 μg/mL,表现为极度敏感;②20%抑霉唑EW、1.8%辛菌胺醋酸盐AS及50%腐霉利WP对黑点病菌也具有良好的抑菌效果,其EC50值为14.02～37.37 μg/mL,表现为高度敏感;③5%氨基寡糖素SL其EC50值为118.49 μg/mL,为中度敏感;62%嘧环·咯菌腈WG和25%吡唑醚菌酯EC的EC50值分别为195.32 μg/mL和189.02 μg/mL,均表现为低度敏感;④10%苯醚甲环唑WG及40%百菌清WP对黑点病菌的抑菌效果差,EC50值分别为 1 736.87 μg/mL和2 904.23 μg/mL,远大于350 μg/mL,为不敏感;⑤而50%多菌灵WP和80%甲基托布津WP及糖醇钙(Ca≥180 g/L)AS、硝酸氨钙(Ca≥18%,N≥15%)SG对猕猴桃黑点病菌毒力最差,基本无抑菌效果。

2.2 不同药剂对猕猴桃黑点病田间防治效果

供试16种药剂对猕猴桃黑点病在田间(表3)均表现出极显著防治效果。其中:苯甲·丙环唑30% EC 450 g/hm2(2 000倍)防效最好,达到90.36%,显著优于其他药剂处理;其次为氟唑菌酰羟胺·苯醚甲环唑20% SC 600 g/hm2(1 500倍)、嘧环·咯菌腈62% WG 600 g/hm2(1 500倍)、腈苯唑24%SC 900 g/hm2(1 000倍)、丙环唑·嘧菌脂18.7% SC 600 g/hm2(1 500倍)、啶酰·咯菌腈30% SC 900 g/hm2(1 000倍)及戊唑醇43%SC 450 g/hm2(2 000倍)6种药剂处理,平均防效达到84.32%～86.9%;第3为烯 肟·戊唑醇20%SC 900 g/hm2(1 000倍)、抑霉唑20%EW 900 g/hm2(1 000倍)、寡糖·吡唑酯27% EW 900 g/hm2(1 000倍)、腐霉利50% WP 750 g/hm2(1 500倍)、氨基寡糖素5%SL 1 800 g/hm2+糖醇钙SL 1 800 g/hm2(500倍)、吡唑醚菌酯25% EC 720 g/hm2(1 250倍)及硝酸氨钙(SG) 1 500 kg/hm2(土施) 7种药剂处理,平均防效达到64.94%～81.78%;而以苯醚甲环唑10%WG 600 g/hm2(1 500倍)及辛菌胺醋酸盐 1.8%AS 900 g/hm2(1 000倍)2种药剂处理防效略差,平均防效均低于60%,均低于硝酸氨钙SG 1 500 kg/hm2土壤施用处理。

表3 不同化学药剂处理对猕猴桃黑点病田间药效试验结果Table 3 Results of field efficacy test for 16 chemicals against kiwifruit black scab

3 讨 论

明确杀菌剂对靶标菌的毒力,对于选择靶标作物的防治药剂具有重要的参考价值[12-13]。研究结果显示,供试的21种药剂除50%多菌灵WP、80%甲基托布津WP两种杀菌剂及糖醇钙、硝酸铵钙两种钙肥外,均对猕猴桃黑点病菌(Diaporthephaseolorum)有显著抑制作用并对病害有良好防治效果,其中烯肟·戊唑醇w=20%悬浮剂(SC)、啶酰·咯菌腈w=30% SC、戊唑醇w=43%SC、丙环·嘧菌酯w=18.7%SC、氟酰羟·苯甲唑w=20%SC、寡糖·吡唑酯w=27% EW、苯甲·丙环唑w=30% EC、抑霉·咯菌腈w=25% SE、腈苯唑w=24% SC、抑霉唑w=20% EW、辛菌胺醋酸盐w=1.8% AS及w=50%腐霉利WP 12种药剂对黑点病菌具有强的抑菌效果,其EC50值均达0.05～37.37 μg/mL,黑点病菌对其表现为极度敏感或高度敏感;氨基寡糖素w=5% AS、嘧环·咯菌腈w=62% WG和吡唑醚菌酯w=25% EC的EC50值分别为118.49 μg/mL、195.316 4 μg/mL和255.18 μg/mL,表现为中度敏感、或低度敏感;而苯醚甲环唑w=10% WG、百菌清w=40% WP、多菌灵w=50% WP、甲基托布津w=80% WP及糖醇钙(Ca≥180 g/L)AS、硝酸氨钙(Ca≥18%,N≥15%)SG分别对猕猴桃黑点病菌的抑菌效果差或无抑菌效果,其EC50值远大于350 μg/mL,为不敏感。供试16种药剂对猕猴桃黑点病田间防治效果极显著,其中:苯甲·丙环唑w=30% EC 450 g/hm2、氟唑菌酰羟胺·苯醚甲环唑w=20% SC 600 g/hm2、嘧环·咯菌腈w=62%WG 600 g/hm2、腈苯唑w=24%SC 900 g/hm2、丙环唑·嘧菌脂w=18.7% SC 600 g/hm2、啶酰·咯菌腈w=30%SC 900 g/hm2及戊唑醇w=43% SC 450 g/hm27种药剂处理平均防效达到 84.32%～90.36%;烯肟·戊唑醇w=20%SC 900 g/hm2、抑霉唑w=20% EW 900 g/hm2、吡唑醚菌酯w=25% EC 720 g/hm2、腐霉利w=50% WP 750 g/hm2、寡糖·吡唑酯w=27% EW 900 g/hm2及硝酸氨钙(SP)1 500 kg/hm26种药剂处理,平均防效达到64.92%～81.78%;而以苯醚甲环唑w=10% WG 600 g/hm2、辛菌胺醋酸盐w=1.8%AS 900 g/hm2及氨基寡糖素w=5% SL 1 800 g/hm2+糖醇钙SL 1 800 g/hm23种药剂处理防效略差,平均防效为 47.77%～ 59.73%,均低于硝酸氨钙SP 1 500 kg/hm2土壤施用处理。

室内毒力测定和田间试验结果显示,寡糖·吡唑酯w=27% EW 900 g/hm2、辛菌胺醋酸盐1.8% AS 900 g/hm2(1 000倍)虽对黑点病菌(Diaporthephaseolorum)具有极强的毒力或抑菌效果,病菌对其表现为极度敏感,但田间防治效果仅为60%上下,不甚理想;相反,62%嘧环·咯菌腈WG和25%吡唑醚菌酯EC的室内毒力测定结果为低度敏感,其田间防效较为理想,达到80%左右,这可能与设置的药剂剂量或浓度高低有关。因此,为进一步明确各药剂在田间施用的最佳剂量或浓度,尚需对同一种药剂设置不同剂量或浓度梯度进行田间药效试验。

室内毒力测定结果还显示,硝酸氨钙SG对黑点病菌(Diaporthephaseolorum)无抑菌效果,但田间药效试验结果表明,土施农用硝酸氨钙SG 1 500 kg/hm2对猕猴桃黑点病具有良好的防治效果,平均防效达到64.92%,与笔者从2018-2020年连续3 a使用钙肥的田间试验结果一致,推测Ca2+的使用能提高果实果皮的抗病性以及生理生化作用;袁嘉玮等[14]研究表明,钙作为生物体生长发育过程中的必需元素,参与果树体内组织结构的形成、营养与生殖器官的发育、光合作用等植物生理过程以及保护酶系统和免疫系统的调控等植物生理生化发育进程,也参与果树的生物与非生物胁迫。刘巍等[1]对翠香猕猴桃黑点病与果实矿质元素失调相关性研究结果显示,猕猴桃黑点病的发生与果实中Ca元素不足相关。植物侵染性病害发生是病原菌致病能力与寄主植物综合作用的结果,钙通过直接或间接抑制病原菌的生长发育及繁殖,从而提高植物的抗病性[15]。Babak等[16]及Buczkowska等[17]研究发现,叶面喷施钙可使病害如炭疽病的发病率降低,且对植物产量(如甜椒)和果品质量有影响,因此含钙药剂对猕猴桃黑点病的影响及作用机理还有待深入探讨。

氨基寡糖素w=5% SL对猕猴桃黑点病菌(Diaporthephaseolorum)的室内毒力和田间防治效果显示,其对该病原菌表现为中度敏感,且有一定防治效果。氨基寡糖素属于寡聚糖类抗病诱导剂,其在多类作物上的应用及作用机制在国内已有较多报道,寡聚糖类药剂对烟草蚀纹病、西瓜花叶病、黄瓜白粉病等的抗病机制表明寡聚糖具有体外抑菌活性,可以诱导植物的抗病性[18],所以氨基寡糖素与其他药剂综合应用可以作为未来病害绿色防治研究的途径之一。