云南省葡萄霜霉病菌群体遗传结构的SSR分析

王境杨 张昊 孔繁芳 周连柱 杨敏 杜飞 邓维萍 黄晓庆 朱书生

摘要 为明确云南特色葡萄产区葡萄霜霉病菌的群体遗传结构，本研究采用7对SSR分子标记对采自云南3个地区的155株葡萄霜霉病菌进行了群体遗传多样性研究，并分析了病原菌群体遗传结构与地域之间的关系。7对引物共检测出41个等位基因，114种基因型，病原菌群体的Shannons信息指数和Neis无偏基因多样性指数分别为0.942和0.600。分子方差分析和群体连锁不平衡分析显示，不同群体间存在相当大的遗传变异。遗传分化系数、基因流以及Structure分析表明，元谋群体与宾川、寻甸两群体之间均具有较高的基因交流，宾川和寻甸两群体间则存在一定的遗传分化。上述结果表明，云南葡萄霜霉病菌群体存在较高水平的遗传多样性，且群体遗传结构与地理距离之间存在一定相关性。

关键词 葡萄霜霉病菌; SSR分子标记; 遗传多样性; 遗传结构

中图分类号： S 436.631

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2021701

Abstract To clarify the population genetic structure of Plasmopara viticola in Yunnan province， the population genetic diversity of 155 strains of Plasmopara viticola collected from three regions was studied by seven pairs of SSR markers， and the relationship between population genetic structure and region was analyzed. A total of 41 alleles and 114 distinct genotypes were identified. Shannons information index and Neis unbiased gene diversity index were 0.942 and 0.600， respectively. The analysis of molecular variance and population linkage imbalance showed that there were considerable genetic variations among different populations. Based on genetic differentiation index， gene flow and Structure analysis， Yuanmou population had a high gene flow with Binchuan and Xundian populations， while Binchuan and Xundian populations showed genetic differentiation to some extent. In conclusion， there was a high level of genetic diversity in the populations of Plasmopara viticola in Yunnan， and there was a correlation between the population genetic structure and geographical distance to some degree.

Key words Plasmopara viticola; SSR markers; genetic diversity; genetic structure

云南位于我國西南地区，气候类型丰富，昼夜温差较大，光照充足，适合葡萄种植［1］。所产葡萄具有成熟早、产量高、品质优的特点，是国内鲜食葡萄上市最早的产区［2］，在我国葡萄产业中占有重要地位。葡萄霜霉病（grape downy mildew）是危害葡萄产业最为严重的病害之一，病菌主要为害叶部，并侵染嫩梢、幼果、花穗等一切绿色组织［3］。一般病害流行年份减产30%～50%，严重时可减产80%［4］。云南省葡萄霜霉病常于葡萄挂果期及成熟期暴发流行，严重影响果实品质及产量［5］。引起该病害的葡萄霜霉病菌Plasmopara viticola是活体专性寄生的二倍体卵菌［6］，有无性繁殖和有性生殖两种生殖方式，能够在单个葡萄生长季完成多次侵染［7］，这就导致在每个生殖周期都有可能发生遗传变异［8］。因此，不同地理环境，多样化耕种方式以及较长的栽种时间等，可能给云南葡萄霜霉病菌群体的遗传多样性带来影响。

进行葡萄霜霉病菌群体遗传多样性的研究，有助于了解云南霜霉病的发生流行情况，推测病原菌群体进化趋势，丰富病原菌遗传分化数据库以及有针对性地制订相应的防控策略。目前，尚没有针对云南地区葡萄霜霉病菌群体遗传多样性研究的报道。对病菌群体遗传多样性的研究，传统方法是对病原菌进行形态观测、发病规律研究等［9］。随着分子生物学的快速发展，分子标记被广泛应用于病原菌群体遗传多样性的研究。本研究利用SSR分子标记技术对云南宾川县、元谋县、寻甸回族彝族自治县3个地区的葡萄霜霉病菌群体进行了遗传多样性分析，以研究云南地区葡萄霜霉病菌群体遗传结构，并分析葡萄霜霉病菌群体遗传结构与地域的相关关系，从而为葡萄霜霉病菌的监测预警，及有效控制策略研发奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌株

2020年－2021年采集了云南省大理白族自治州宾川县（以下简称“宾川”）、楚雄彝族自治州元谋县（以下简称“元谋”）、昆明市寻甸回族彝族自治县（以下简称“寻甸”）3个地区的葡萄霜霉病病叶，挑取单孢囊梗，经分离、纯化后共得到155株病原菌。其中，采自宾川的菌株共75株，采自元谋的菌株共65株，采自寻甸的菌株共15株。

1.1.2 接种材料

病原菌的纯化扩繁选用中国农业科学院廊坊中试基地葡萄园内新鲜、健康的‘里扎马特嫩叶。

1.1.3 葡萄霜霉病菌的培养

采集新鲜、健康的‘里扎马特葡萄嫩叶，用1%的次氯酸钠水溶液消毒30 s后用去离子水冲洗2～3次，并用滤纸吸干水分。使用直径15 mm的打孔器打取叶片，叶背面向上放置于1%水琼脂培养基上，对葡萄霜霉病菌进行活体培养。

1.2 试验方法

1.2.1 病菌的采集与纯化扩繁

田间采集新鲜、无杂菌污染，并且近期未施用杀菌剂的葡萄霜霉病病叶，置于铺有湿润滤纸的培养皿中，表面喷上无菌水，于温度21℃，光周期L∥D=16 h∥8 h的人工气候箱内保湿培养。待长出新鲜霉层后，在体视显微镜下挑取单孢囊梗，接种在提前制备好的叶圆盘中央（事先滴加20 μL灭菌水，提供孢子萌发所需的水环境）。在21℃，黑暗处理24 h 后，用灭菌滤纸吸干水分，继续在21℃，L∥D=16 h∥8 h条件下保湿培养6 d，叶盘上长出浓密的菌层，即为葡萄霜霉病菌纯系菌株。刮取纯培养的菌株霉层，加入去离子水充分振荡，制成浓度为1×105个/mL的孢子囊悬浮液，接种于新的叶圆盘上并按上述培养条件进行菌株的扩繁，以此获得大量纯系菌株，用于提取DNA。

1.2.2 DNA的提取

从叶圆盘片上刮取一定量的霜霉病菌，利用OMEGA Fungal DNA Mini Kit （D3309-02）提取菌株DNA，提取方法参照试剂盒说明书。用NanoVue plus紫外可见分光光度计检测DNA浓度及质量，合格后放-20℃冻存备用。

1.2.3 简单重复序列的扩增

SSR引物的选取参照Gobbin等［10］，Rouxel等［11］的方法，筛选出7对适合研究葡萄霜霉病菌遗传多样性的SSR特异性引物。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成并用FAM或HEX荧光进行标记（表1）。以提取的DNA为模板，利用选取的7对SSR引物进行扩增。

PCR反应采用20 μL体系：2×Taq mix 10 μL，ddH2O 8 μL，DNA模板1 μL，上下游引物各0.5 μL。PCR扩增程序：95℃预变性5 min;95℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，循环35次;72℃再延伸10 min;最后4℃保存。PCR反应结束后取5 μL扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，检测合格产物由生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。

1.3 数据统计与分析

使用GenAIEx 6.51b2（Microsoft office Excel加载宏）计算遗传多样性参数［12］，包括等位基因数（observed number of alleles， Na），有效等位基因数（effective number of alleles， Ne），稀有等位基因数（number of private alleles， PA），Shannons信息指数（Shannons information index， I），期望杂合度（expected heterozygosity， He），遗传分化系数（genetic differentiation index， Fst），估算基因流（gene flow， Nm），并进行分子方差分析（analysis of molecular variance， AMOVA）。

使用R软件的poppr包对供试菌株个体进行克隆矫正，进而测定多位点基因型数目（number of multilocus genotypes observed， MLG），多位点基因型数目期望值（the number of expected MLG at the smallest sample size， eMLG），Nei无偏基因多样性（Neis unbiased gene diversity， Hexp），标准化连锁指数（the standardized index of association， rbarD），显著性水平（P-value， P）。

使用Structure 2.3.4进行群体结构划分，根据每个独立个体的遗传背景进行结构划分， 选用混合祖先模型［13］，将缺失数据标记为“-9”并尝试设定K值（亚群数）范围为2～6，设定“length of burnin period”为10 000，然后选择马尔科夫蒙特卡洛（MCMC）法进行10 000次迭代，设定每个K值重复运行5次［14］，其他参数按照默认设置，不做更改。

2 结果与分析

2.1 引物多态性

采用7对引物对采集的155株葡萄霜霉病菌DNA进行扩增，获取片段大小后，使用poppr克隆矫正得到116个独立菌株。7对引物在3个群体中共检测出41个等位基因（表2），每个引物位点的等位基因数目是4～8个，平均等位基因数为5.857个。对每个位点的等位基因数进行比较，多样性最多的位点是Pv138（Na=8），多样性最少的是Pv61（Na=4）。引物预期杂合度（He）范围在0.554～0.684之间，各引物之间杂合度差异不大，等位基因多样性较为丰富。

2.2 不同地区葡萄霜霉病菌群体的遗传多樣性

由表3所示，116株病原菌共存在114個多位点基因型（MLG），14个稀有等位基因（PA），其中宾川群体的稀有等位基因数量最多，有10个，元谋群体有4个稀有等位基因，寻甸群体则无稀有等位基因。利用Nei无偏基因多样性（Hexp）和Shannons信息指数（I）估算了3个群体的遗传多样性水平，Hexp值在0.535～0.559，I值为0.817～1.014。从以上两个指标可知，3个群体遗传多样性程度差别不大，其中元谋种群遗传多样性最高。总体而言，云南葡萄霜霉病菌群体的遗传多样性较高，Hexp=0.600，I=0.942。群体连锁不平衡分析如图1所示，宾川、寻甸群体rbarD值均较低，P宾川=0.164，P寻甸=0.149，表明其群体内的标准化连锁系数与理论值不存在显著差异，群体内的基因型分布符合连锁平衡，表现为随机交配群体，群体内个体间存在充分的有性生殖。元谋群体rbarD值为0.062（P元谋=0.01），显著偏离遗传平衡，说明群体内个体间基因交流非常有限。

2.3 葡萄霜霉病菌群体的遗传分化与基因流

分子方差分析（表4）显示，云南3个地区葡萄霜霉病菌的群体内、群体间均存在显著的遗传变异（P < 0.001）。群体内遗传变异占72%，群体间占28%，说明遗传变异主要产生于每个地区葡萄霜霉病菌群体内的菌株之间，且群体间也存在较大的遗传变异。按照Wright［15］对遗传分化系数（Fst）的界定标准，当0 < Fst ≤ 0.05时表示群体间分化程度低;0.05 < Fst ≤ 0.15时为中度分化;0.15 < Fst ≤ 0.25表示分化程度较高;Fst > 0.25 表明分化程度极高。由表5可见，各群体间的遗传分化系数分布在0.077～0.111，表明不同群体两两间均存在中度程度的遗传分化;其中，宾川和寻甸群体间遗传分化系数最大，为0.111，相应的群体间基因流最小，为2.007。宾川和元谋群体间遗传分化系数最低，为0.077，群体间基因流最大，为3.014。

2.4 不同地区葡萄霜霉病菌的群体遗传结构

Structure群体遗传结构表明群体的遗传结构与地区之间有一定关联，选取K=2，将葡萄霜霉病菌群体划分为两个理论群（图2）。其中，杂合菌株14株，占群体的12.1%;cluster 1（黑色）58株，占群体的50.0%;cluster 2（灰色）44株，占群体的37.9%。宾川群体中90.9%是cluster 1（黑色），9.1%是混合菌株;元谋群体中14.9%是cluster 1（黑色），14.9%是混合菌株，70.2%是cluster 2（灰色）;寻甸群体中78.6%是cluster 2（灰色），14.3%是混合菌株，7.1%是cluster 1（黑色）。3个群体间遗传结构存在一定差异，元谋群体在结构划分上类型最为丰富，并且与宾川、寻甸群体交流都比较频繁。

3 结论与讨论

葡萄霜霉病的严重发生给云南葡萄产业带来了巨大经济损失，葡萄霜霉病菌有很强的繁殖进化能力，能在一个生长季发生多次再侵染。SSR分子标记技术操作简单，成本低，目前被广泛用于葡萄霜霉病菌群体遗传多样性和遗传结构研究。本研究结果显示，采自云南宾川、元谋、寻甸3个地区的葡萄霜霉病菌，经SSR引物扩增后，共产生41个等位基因（其中包括14个稀有等位基因），共存在114种基因型。Nei无偏基因多样性（Hexp）和Shannons信息指数（I）分别为0.600、0.942。与周婷婷［16］、李卓［17］、于舒怡等［18］、Yin等［19］利用SSR分子标记技术对我国其他地区葡萄霜霉病菌遗传多样性分析所得的Nei无偏基因多样性和Shannons信息指数相比，云南地区的霜霉病菌群体比新疆、辽宁、北京、天津、河北、山东、江苏、广西、宁夏等地区群体具有更高水平的遗传多样性。

病原菌的遗传多样性由不同因素相互作用决定，包括生殖方式、防治方法和耕作方式等。根据群体连锁不平衡分析显示，宾川、寻甸两群体符合连锁平衡，表明群体内菌株间能进行充分的随机交配，两群体均以有性生殖为主，这就造成病原菌会形成新的基因型，群体遗传多样性丰富。在葡萄生产中常以化学防治为主，同时配合抗病品种的种植以及避雨栽培等技术防治葡萄霜霉病，各地区不同的防治措施对病菌群体产生了不同的选择压力，也可能造成葡萄霜霉病菌遗传多样性水平的不同。另外，云南具有独特的地理气候，复杂的生境条件，并且3个地区均处在我国少数民族聚居区，多民族集居导致的多样化耕种方式和相对较长时间的葡萄规模化栽种等因素，也可造就云南地区葡萄霜霉病菌群体具有较高的遗传多样性水平［20］。

另外，分子方差分析（AMOVA）显示，不同群体间遗传变异占比28%，说明不同地理群体间存在较高水平的遗传变异，揭示了云南葡萄霜霉病菌群体遗传结构可能与地理位置存在一定的关系，3个地区的群体结构产生了一定差异。两两群体间遗传分化系数为0.077～0.111，基因流为2.007～3.014，3个群体两两间均存在中等程度的遗传分化。相比而言，元谋群体与宾川、寻甸两群体有较高的基因流，较低的遗传分化系数;宾川、寻甸两群体则存在较低的基因流以及较高的遗传分化系数。Structure群体遗传结构分析也表明，当将云南葡萄霜霉病菌群体归于2个亚群时，元谋群体在结构划分上类型最为丰富，与宾川、寻甸群体均有一定程度的基因交流;相反，宾川、寻甸两群体之间交流较少，在遗传结构上存在一定分化。这与元谋在地理位置上介于宾川和寻甸之间有一定的关系，表明元谋群体在群体基因交流中充当“桥头堡”作用，葡萄霜霉病菌群体遗传结构与地理距离之间存在一定相关性，并且随着距离的增大，群体间基因交流程度会下降，遗传结构差异增加。就上述而言，3个地区菌株群体间虽存在一定程度的基因交流并可能在元谋地区进行交会，但也存在中度的遗传分化。

与本研究结果类似的是，周婷婷［16］对新疆不同地区的葡萄霜霉病菌进行遗传分析的结果表明群体内变异是霜霉病菌遗传变异的主要来源，病菌群体间的亲缘关系与地理分布之间具有一定相关性。之后李卓［17］对新疆地区葡萄霜霉病菌进行聚类分析的结果也表明群体间的亲缘关系与地理分布具有相关性。李荣［21］进行了湖南省霜霉病菌的系统发育分析显示，病原菌的亲缘关系与地理位置有一定程度的联系。

葡萄霜霉病菌群体内部既存在有性生殖又存在无性繁殖，根据病害风险模型假说［22-23］，有性生殖对病原菌的新基因型的产生具有重要作用，无性繁殖则有助于病原菌在盛发期大规模繁殖，更有助于病原菌对杀菌剂产生抗药性。因此，研究云南葡萄霜霉病菌群体遗传多样性和遗传结构，对于了解云南地区病害发生情况，做好地区病害流行监控，进行病害预测预报，制定省内病害防控措施，防止病害在省内各产区间大规模传播有一定的积极作用。

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（责任编辑：杨明丽）