掺硅羟基磷灰石微球的微流控制备及其体外生物活性研究

万健羽 崔金婕 董少杰 林开利

摘要：可注射生物活性陶瓷不仅具有良好的生物相容性，而且能够促进成骨分化和血管生成。羟基磷灰石（ CaIO（P04）6（OH）2，HA）是人骨的主要成分。采用微流控技术，成功制备出粒径480μm的均一硅酸钙（ CaSi03，CS）微球，并以其为前驱体，在磷酸三钠（Na3P04）水溶液中进行24 h水热转化处理，得到具有纳米线结构的含硅羟基磷灰石微球（ Si-nHA）。该纳米线直径约100～200 nm，长度约1～2μm。Si-nHA微球比表面积为7.78 m2/g，远高于纯HA微球的比表面积（0.08 m2/g），高比表面积使得Si-nHA微球具有更加优异的蛋白负载和缓释性能。同时，Si-nHA微球释放的硅（ Si）离子能显著促进大鼠骨髓间充质干细胞（rBMSCs）的增殖，以及相关成骨（ OPN，OCN）和成血管基因（ANG-I）的表达。研究结果表明，Si-nHA微球在微创骨修复领域有良好的应用前景。

关键词：微流控；水热转化；纳米结构；可注射微球；药物载体；骨修复

中图分类号：TQ 174

文献标志码：A

骨缺损是一种常见的临床表现，常由于各种外伤、肿瘤或先天性畸形等原因引起。目前，传统的骨缺损治疗方法包括自体骨移植和异体骨移植，前者供体有限且容易造成二次损伤，后者则容易引起宿主免疫排斥反应[1]。在过去的几十年中，研究人员开发了大量的骨生物材料，如钛金属及其复合材料、陶瓷材料、天然高分子材料和人工合成聚合物材料等。其中，陶瓷材料主要分为生物惰性材料[2]和生物活性材料，前者以氧化铝和氧化锆等金属氧化物为主，后者以钙一磷基生物陶瓷和生物玻璃为主[3-4]。

羟基磷灰石（ Ca10（P04）6（OH）2，HA）作为钙一磷基生物陶瓷中的一种，与天然骨的无机成分类似，具有良好的生物相容性能，是一种较理想的骨修复材料，但传统的人工合成HA骨诱导活性较弱[5-8]。近年来，具有高比表面积的纳米HA（ nHA）在药物负载和骨组织再生等方面展现出广阔的应用前景。研究表明，nHA具有与天然骨类似的多级结构和高比表面积，可以用于药物负载和控释，并且能够促进细胞黏附、增殖和成骨分化，进而加速骨愈合[9-12]。Lin等[13]在不添加任何表面活性剂和模板导向试剂的条件下，以CS粉末为前驱体，在磷酸盐溶液中进行水热处理，合成了具有可控纳米形貌的HA材料。

此外，在骨缺损修复过程中，新血管的生成有着重要的作用，它能为成骨细胞和组织提供血液和营养物质，进而加速骨愈合[14-16]。而传统的由人工合成HA粉末煅烧后获得的HA支架表面光滑，晶粒尺寸为微米尺寸，其成骨和成血管能力弱。为弥补这个缺陷，研究人员发展了多种方法，如负载生物活性因子或干细胞[17]、HA表面微纳结构改性[18]、功能元素掺杂[19]等。Elrayah等[20]将多孔HA支架浸入到含铜离子（Cu2+）的溶液中进行水热反应，成功制备出具有微纳结构表面的多孔Cu．HA支架。结果表明，与多孔HA支架相比，具有纳米花状表面的Cu-HA支架具有更强的促血管生成能力。另有研究表明，Si离子能够有效促进内皮细胞（ VECs）分泌促血管生成因子。Dashnyam等[21]利用溶胶凝胶法制备了介孔_氧化硅（SiO2）微球，其释放的Si离子可以通过阻断HIF-脯氨酰羟化酶-2（ PHD-2）的表达来上调缺氧诱导因子（HIF-Ia）的表达，进而激活促血管生成因子如碱性成纤维细胞生长因子（ bFGF）、血管内皮生长因子（VEGF）和内皮型一氧化氮合酶（eNOS）的表达。

微球是一类常见的骨缺损填充物和药物载体。与传统的支架材料相比，微球体积小，几何形状规则，有利于流动的曲面表面[22-24]。通过调控微球结构，如多孔、核壳及微纳结构[25-26]等，可以有效提高药物的载药量并控制药物释放行为，在可注射载药性骨缺损修复领域应用前景广阔[27-28]。传统的生物陶瓷微球制备方法有喷雾干燥法[29-30]、溶剂挥发法[31]和溶胶一凝胶法等。但这类方法得到的微球粒径分布范围广，在骨缺损位置填充时会出现小尺寸球与大尺寸球紧密堆积的现象，导致微球之间孔隙减少，进而导致细胞、血管和新生骨组织难以长人。微流控法能够制备出粒径均匀、单分散性好的微球。在微流控芯片通道上，控制溶液浓度、连续相和分散相流速比等参数能够有效调控微球直径大小[32-33]。

综上，本研究采用微流控法，以海藻酸钠水溶液为水相，二甲基硅油为油相，将CS超细粉末分散在水相中，通过调整水相和油相的流速，成功制备出CS微球。以其为前驱体，Na3P04水溶液为磷源，经过24 h水热成功制备出直径均一的Si-nHA微球。同时，进一步研究了Si-nHA微球在水热转化过程中表面形貌和成分结构的变化、在磷酸盐缓冲液中Si离子的释放行为，以及Si-nHA微球浸提液对大鼠骨髓间充质干细胞（ rBMSCs）的增殖和成骨分化的影响。最后，以BSA蛋白为药物模型，研究了Si-nHA微球蛋白负载和释放行为。

1 实验方法

1.1 材料

海藻酸钠[（C6H7Na06）n，SA]、二甲基硅油[（OSi（CH3）2）n]、冰乙酸（C2H402，>99.8%）、乙二胺四乙酸二钠钙盐（ Ca-EDTA，97%）购自中国国药化学试剂有限公司（中国上海）。硅酸钙（ CaSi03，CS）和羟基磷灰石[Ca10（P04）6（OH）2，HA]购自江苏省昆山华侨科技有限公司。牛血清白蛋白（BSA）购自德国BioFroxx公司。所有化学药品均未经进一步提纯。

1.2 制备方法

1.2.1 CS和HA微球的制備

CS微球的制备流程如图1所示。首先，将2 9的SA粉末加入到100 mL去离子水中配置成0.02 g/cm3的SA水溶液，再加入1.87 9的Ca-EDTA粉末搅拌溶解，最后将15 9的CS粉末加入到上述溶液中，过夜搅拌形成CS/SA溶液。以内径0.42 mm、外径1.49 mm的同轴针头作为微流控芯片，聚四氟乙烯管为管道，将CS/SA溶液作为水相，流动速率为0.06 mL/min，二甲基硅油为油相，流动速率为0.3 mL/min。在同轴针头出口管道上外接一个管道，接人乙酸和二甲基硅油混合溶液（二者溶液体积比为1：100）。当微球液滴所含的Ca-EDTA遇到乙酸后会释放钙（Ca）离子，Ca离子能使SA立刻交联固化形成微球。收集交联后的CS/SA微球，用石油醚和无水乙醇交替清洗去除该微球表面的二甲基硅油，60℃烘干得到微球素胚。为了去除微球素胚内的SA，对微球进行热处理，以2℃/min的升温速率加热至1 100℃，保温3h后随炉冷却，去离子水离心清洗微球3次，烘干保存。HA微球的制备与上述制备方法一致。

1 .2.2

Si-nHA微球的制备

以CS微球为前驱体，通过水热转热法制备掺Si的CS微球[10]。将1 9的CS微球浸入85 mL的Na3P04（ 0.2 mol/L）溶液中，在180℃下水热处理0.5，2，12，24 h，产物分别命名为Si-0.5，Si-2，Si-12和Si-24。之后，用去离子水反复清洗并离心分离。清洗完毕后，放入60℃烘箱中烘干24 h。用扫描电子显微镜（ SEM，Zeiss SIGMA300）观察HA微球和CS微球不同水热时间后产物的表面形貌。用X射线衍射仪（ XRD，D8 ADVANCE）和傅里叶红外光谱仪（ FT-IR．SPE CTRUM 100）对HA微球和CS微球不同水热时间后的产物进行物相分析和分子结构分析。

1.3 Si离子的释放

将HA和Si-nHA微球以6 mg/mL的比例浸泡在PBS溶液中，置于37℃恒温震荡仪振荡1，4，7，10，14 d。在每个时间点，将含有微球的溶液离心，然后吸取4 mL溶液并补充等量新鲜的PBS溶液，通过ICP-OES来测试溶液中硅离子的质量浓度。

1.4 BSA的负载与释放

为研究HA和Si-nHA微球蛋白负载和释放行为，以BSA为蛋白模型，将100 mg微球浸泡在1 mL的BSA水溶液（10 mg/mL）中，并在37℃恒温振荡仪中振荡24 h。24 h后离心取上清液，用BSA检测盒测定上清液中的BSA含量，每组3个平行样，通过绘制BSA标准曲线，计算上清液中的BSA蛋白负载量，进而得到HA和Si-nHA微球中负载的BSA蛋白量。

将100 mg载药微球浸泡在1 mL的PBS中，置于37℃恒温振荡仪中振荡1，4，7，24，48，72 h，在每个时间点取50 μL上清液测定微球BSA的释放量，并添加新鲜等量的PBS，每组3个平行样，绘制BSA释放曲线。

1.5 体外细胞实验

本实验所选用细胞为第2～4代的rBMSCs细胞。用含10%的胎牛血清（FBS，Gibco，USA）和l%青霉素一链霉素（ Gibco，USA）的a-MEM培养基，在37℃、5% CO2恒温培养箱中培养，培养基每两天一换。本实验采用离子浸提法进行体外实验。先将HA和Si-nHA微球浸泡在75%乙醇中进行灭菌，PBS清洗。之后将1g灭菌后的微球浸泡在5 mL无血清和双抗的a-MEM培养基中，置于37℃恒温振荡仪中振荡24 h，离心后用0.22 μm滤膜过滤并收集上清液（ 200 mg/mL），4℃保存。用含10%胎牛血清和1%青霉素—链霉素的a-MEM培养基稀释上清液，得到质量浓度为6.25，12.5，25，50 mg/mL的微球浸提液。不同浓度的浸提液保存在4℃冰箱内，用于后续实验。

1.5.1 Si-nHA微球对rBMSCs细胞增殖的影响

本实验采用CCK-8法来检测细胞增殖情况。将500个细胞重悬于100 μL含10%血清和1%双抗的a-MEM培养基中，并接种到96孔细胞培养板中，置于37℃、5 %CO2恒温培养箱中，培养24h。待细胞成功黏附在培养板上，吸去原有的培养基并用PBS清洗，更换为不同离子浓度的浸提液继续培养细胞，分别培养1，3，5d，每隔两天更换一次浸提液。在每个时间点，采用CCK-8试剂盒检测细胞活性。

1.5.2 Si-nHA微球对rBMSCs细胞成骨分化的影响

根据CCK-8细胞增殖的实验结果，本实验选取12.5，25，50 mg/mL的浸提液进行实时荧光定量PCR检测。将SX104个细胞接种到6孔细胞培养板中，加入3 mL含10%血清和1%双抗的a-MEM培养基。待细胞贴壁后，更换为不同浓度的浸提液培养。培养到4d时，用Trizol试剂（TAKARA．Japan）收集细胞并提取RNA，再利用TAKARA试剂盒通过反转录合成互补DNA（ cDNA）。采用Bio-Rad real-time PCR系统（Roche， Switzerland）进行实时PCR分析。

1.6 统计学分析

数据采用Image统计分析软件得到。通过单因素方差分析（ OneWay ANOVA）对数据进行统计学分析。p<0.05时，差异具有统计学意义。

2 结果与讨论

2.1 微球表征

制备HA和CS微球的原材料粉末如图2所示，HA粉末直径在0.1～2.0 μm，CS粉末直径在0.5～6.0 μm。微流控法制备的HA和CS微球煅烧后的表面形貌如图3所示。煅烧后的HA微球平均直径约为477 μm，CS微球平均直径约为480 μm；低倍镜下两组微球分散性和成球度良好，且微球间无粘连；高倍镜下HA微球结构相对致密，表面存在微孔结构，孔径约0.1～0.3 μm，CS微球表面孔径约0.2～0.6 μm。微孔是由于SA煅烧后留下的空隙而形成的。图4的直径分布图表明，采用微流控技术得到的微球均一性良好，直径分布狭窄。

CS微球在Na3P04水溶液经过不同水热时间处理后表面形貌如图5所示。水热处理0.5 h后，CS微球表面出现纳米线结构。随着水热时间的增加，纳米线数量逐渐增加。水热处理24 h后微球表面颗粒全部消失，并被纳米线取代。该纳米线长度约1～2 μm，直径约100～200 nm。BET测试结果显示：HA和Si-nHA微球的比表面积分别为0.08 m2/g和7.78 m2/g，可见采用水热转化法能够获得由纳米线构筑的高比表面积微球材料（见图6）。PBS浸泡实验表明Si-nHA微球能够持续性释放Si离子（见图7）。研究表明：数十微克每毫升的Si离子持续释放两周（对应是每天几微克每毫升）被认为是在Si离子的治疗范围之间，可以刺激血管生成，同时允许细胞存活和增殖[21]。不同水热时间后产物的XRD图谱如图8（a）所示。水热处理0.5 h后，在2θ= 32°和33°处出现了两个不属于CS的特征峰；水热处理2h后，在20=：3 1.9°，32.3°和33.1°出現了HA特有的三强峰，同时属于CS的特征峰强度变弱；水热处理12 h后，属于CS的特征峰基本消失不见；而水热处理24 h后的产物与纯HA（ JCPDS： 090432）基本吻合。另外发现随着水热时间的增加，产物的结晶度先上升后下降，可能是由于Si离子半径和P离子半径接近，因此Si元素可以部分取代HA晶格中的P元素。由于Si-0键长比P-O键长长，所以少量取代时会使晶粒尺寸增加，从而使结晶度上升。但当过量Si取代时，会导致羟基（OH-）空位的增加，进而使结晶度下降[5.34-35]。从图8（b）的FT-IR图谱中可以发现：随着水热时间的增加，在632 cm-1和3 571 cm-1处出现OH的伸缩振动吸收峰，在563，601，964，1034，1 092 cm-1处出现P03-的特征吸收峰。这进一步证实CS在Na3P04水溶液中水热后，CS物相会转化为HA物相。水热处理24 h后得到的Si-nHA微球吸收峰与HA吸收峰基本吻合，但在632，964，3 571 cm-l处峰的强度不如HA，这是由于Si04-基团取代P03-时会造成OH空位，降低了吸收峰的强度【3335]。

2.2 BSA蛋白负载和释放

本文选择BSA为蛋白模型进行蛋白负载和释放行为研究。图9结果表明，经过24 h浸泡后，Si-nHA微球的载药量为13.55 μg/mg，而HA微球的载药量只有7.20 μg/mg，这说明具有高比表面积的Si-nHA微球拥有更好的药物装载能力。从SEM图中可以看出，Si-nHA微球由HA纳米线构成，该纳米结构使得BSA不仅可以被吸附在具有较高比表面积的纳米线上，还可以通过纳米线间的孔隙进入到微球内部，进一步提高载药量。药物释放结果表明：两组微球在前期快速释放BSA，12 h后释放变得缓慢；72 h后，相较于Si-nHA微球而言，HA微球BSA释放已经趋近于稳定，可能是因为部分BSA能通过Si-nHA纳米线间的孑L隙进入到微球内部，延缓其释放。这表明具有纳米结构的Si-nHA微球释放蛋白行为更加持久。

2.3 Si-nHA微球对rBMSCs细胞增殖的影响

CCK8法检测细胞活性的结果如图10所示，与空白组（ blank）相比，高浓度的HA和Si-nHA组浸提液能促进细胞增殖。微球浸提液培养的第1天，各组细胞活性没有显著差异。细胞培养时间至第3天时，实验组的细胞活性明显高于空白组，具有显著差异，且细胞活性与实验组浸提液的浓度呈正相关，但50 mg/mL的Si-nHA组活性略有下降。25 mg/mL的Si-nHA组与同浓度HA组相比，更有利于促进rBMSCs的增殖。培养至第5天时，12.5， 25 mg/mL浓度的Si-nHA微球浸提液组与同浓度的HA微球浸提液组相比，细胞显示出更高的活性。上述结果表明，Si-nHA微球释放的 Si 离子能够促进 rBMSCs 的增殖。由于浸提液是用不含 Ca，Si 的培养基按一定倍数稀释的，所以可以从某一浓度的 Si 和 Ca 离子质量浓度推断出其他浓度浸提液的离子浓度。ICP-OES 离子检测结果显示，12.5mg/mL 的 Si-nHA 微球浸提液中Si 离子浓度为9.6μg/mL、Ca 离子浓度为67.2μg/mL，而 12.5mg/mL 的 HA 微球浸提液中 Ca 离子浓度为 72.1μg/mL，两者 Ca 离子浓度接近。所以先前的研究表明，Si 离子对成骨细胞的影响与浓度相关，有效浓度在 11.2～179.8μg/mL[35- 36]。而 6.25mg/mL浓度组 的 Si-nHA 浸提液组 中 Si离子浓度仅为4.8μg/mL，故对细胞增殖无明显促进作用。

2.4 Si-nHA 微 球 对 rBMSCs 细胞成骨分化的影响

根据 CCK8 检测结果，12.5，25，50mg/mL的 HA 组和 Si-nHA 组浸提液具有较好的促进细胞增殖的性能，因此，选择该浓度进行后续的相关成骨和成血管基因水平检测。众所周知：OPN 是参与骨基质形成相关的重要基因；OCN 是成骨细胞骨形成的晚期标志物，在骨基质中起着重要的矿化调节作用；ANG-1 在一定程度上通过降低由VEGF 诱导的血管通透性来刺激血管化。由图 11结果可知，50mg/mL 的 Si-nHA 浸提液培养的细胞，其 OCN，OPN 和 ANG-1 基因表达水平与其他组相比具有显著差异，说明降解释放的 Si 离子能够促进 rBMSCs 成骨和成血管基因的表达，且与Si 离子浓度呈正相关。ICP-OES 离子检测结果显示：本实验 50mg/mL 的 Si-nHA 浸提液中 Si 离子浓度约为 38.4μg/mL，在有效浓度 11.2～179.8μg/mL范围内，与先前的研究报道一致[37]。

研究表明，在传统的羟基磷灰石基础上掺入硅元素不仅能促进成骨分化，还能提高血管生成因子的表达水平，这对于设计具有良好血管再生和成骨功能的骨再生生物材料具有重要意义。

3 结论

活性離子掺杂是调控生物陶瓷材料成骨活性的重要方法之一。本研究采用微流控技术，以SA水溶液为分散相、二甲基硅油为连续相、Ca-EDTA为钙源、乙酸为引发剂，制备出直径均一的CS微球，平均直径为480 μm。同时，以其为前驱体，在Na3P04水溶液中进行水热转化处理，制备了具有纳米线结构的掺硅HA微球（Si-nHA）。与传统的纯HA微球相比，高比表面积的Si-nHA微球具有更加优异的BSA蛋白负载和缓释性能。体外细胞实验表明：Si-nHA微球降解释放的Si组分能促进rBMSCs的增殖和成骨分化，且与Si组分的浓度呈正相关。此外，Si-nHA微球降解释放的Si组分还能促进血管生成，这对于修复骨缺损具有重要意义。本研究为载药型可注射生物活性骨修复材料的制备与应用提供了新的思路。

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