中西药联用对柱状黄杆菌体外抑菌作用研究
2023-05-30赵良炜徐赟霞王禹冯守明尤宏争张振国
赵良炜 徐赟霞 王禹 冯守明 尤宏争 张振国
摘要：为研究中西药复方制剂对柱状黄杆菌（Flavobacterium cloumnare）的抑菌效果，采用水煎煮法提取五倍子、黄芩等12种中草药的活性成分，首先采用纸片法测定15种药物中西药单方制剂的抑菌效果，然后使用二倍稀释法测定具有抑菌效果药物的最小抑菌浓度，最后使用采用棋盘交叉法测定中西药复方制剂的协同作用。结果表明，氟苯尼考和黄芩联用形成的复方制剂对柱状黄杆菌具有协较好的抑菌作用。
关键词：中西药；最小抑菌浓度（MIC）；联合抑菌指数（FIC）
中图分类号：S942.1 文献标识码：：A
基金项目：甘肃省科技计划项目（21CX6NP223）；天津市科技计划项目（22ZYCGSN00050）。
作者简介：赵良炜（1983-），男，工程师，研究方向：水产动物病害防治。E-mail： 75985330@qq.com。
*通讯作者：张振国（1981—），E-mail：zhangzg8249@163.com。
柱状病的病原是柱状黄杆菌，柱状黄杆菌可以感染草鱼［1］、鲤鱼［2］、斑点叉尾鮰［3］、银龙鱼［4］、虫纹鳕鲈［5］等鱼类，几乎所有的淡水鱼类都易感。感染初期鳍条顶端、吻端，皮肤鳃丝末端生长繁殖，形成黄白色点状病灶，随着病情发展，鳍条蛀烂，向基部溃烂，鳃丝溃烂。以柱状黄杆菌为研究对象，进行了中西药单方及复方制剂的体外抑制试验。
1 材料方法
1.1 菌株
柱状黄杆菌分离于发病虫纹鳕鲈Murraycod （Maccullochella peelii peelii）；恩诺沙星、复方磺胺二甲氧嘧啶、氟苯尼考购于北京渔经公司；黄柏、黄芩、金银花、板蓝根、苦参、大黄、鱼腥草、五倍子、穿心莲、黄芪、大青叶、连翘购自甘肃省卓尼县九峰生态药业有限责任公司。
1.2 方法
1.2.1 药物制备
西药母液的制备：称取市场上购买的西药50mg，溶于50mL灭菌水，完全溶解后0.22μm滤膜过滤除菌，制备成1000mg/L的药液，4℃保存备用。中草药的制备： 称取10 g药物， 加入灭菌水100 mL浸泡1 h， 煎煮0.5 h， 不时进行搅拌， 药液用尼龙纱布过滤， 滤渣再次煎煮、过滤， 合并药液后，水浴浓缩至50mL，药液浓度即为200mg/mL， 5000rpm离心，取上清，0.22μm滤膜过滤除菌。配制好的药物分装于1.5 mL灭菌离心管中， -20℃保存备用。
1.2.1 药物的初筛
采用纸片扩散法， 参照杭州天和微生物有限公司操作手册进行， 黄杆菌采用Shieh培养基。均匀涂布试验菌液（1.0×108 CFU/mL）于平板上， 将空白药敏纸片平贴于平板上（4片/平板），每个空白纸滴加5μL药液， 28℃培养48h，用精度1mm尺子测量抑菌环的直径， 并记录结果。
1.2.2 药物的最小抑菌浓度测定
根据初筛结果，选取抑菌效果较好的药物进行最小抑菌浓度测定。在1.5mL离心管进行，第1管中加入900μL液体培养基，第2管至第12管分别加入500μL培养基，第1管加入100μL药液，混匀后吸出500μL加入第2管，依次2倍稀释，只至最后1管。每个管加入10μL菌液，28℃振荡培养24 h，观察有无细菌生长。另外，做1个阳性对照（加菌不加药）和1个阴性对照（不加药不加菌）。
1.2.3 中西药联合抑菌指数（ FIC） 的测定
采用棋盘交叉法［6-8］， 以药物对细菌的最小抑菌浓度（MIC）的2倍浓度开始进行2倍梯度稀释。2种药物的稀释分别在微量细胞培养板的列和行进行， 一种药物是沿行稀释， 在同一列上各孔的药物浓度相同； 另一种药物沿列稀释， 同一行中各孔的药物浓度相同。这样在每孔中可得到不同浓度组合的2种药物混合液。每块细胞培养板均设有不加菌液的阴性对照和不加药物的阳性对照。除不加菌液的对照孔外， 每孔中加入10μL活化的细菌培养物（1×108 CFU/mL）， 振荡混合均匀， 28℃培养 24 h。每个样品进行4次重复。
西药与中药联用试验以FIC（Fractional Inhibitory Concentration）指数作为联合药敏试验的判定依据。FIC指数= （联用后A药MIC值/联用前A药MIC值） + （联用后B药MIC值/联用前B药MIC值）。判断标准：FIC指数≤0.75时，两药为协同作用；FIC指数=1时， 两藥为相加作用；1
2 实验结果
2.1 初筛药敏结果
对柱状黄杆菌药物敏感性进行检测，参照常用抗生素药物敏感性试验判断标准分析，柱状黄杆菌对氟苯尼考、黄芩和五倍子3种药物敏感性（见图1、图2及表1）。
2.2 最小抑菌浓度测定
根据上述实验结果，选取氟苯尼考、黄芩和五倍子3种药物测定对柱状黄杆菌最小抑菌浓度，氟苯尼考最小抑菌浓度为1.25 mg/L，黄芩最小抑菌浓度为1.25 mg/mL，五倍子最小抑菌浓度为0.156 mg/mL。
2.3 中西药联用结果
按照1.2.3中的测定方法，测定氟苯尼考+黄芩和氟苯尼考+五倍子联用效果，结果显示，氟苯尼考+黄芩联用后，具有协同抑菌作用；氟苯尼考+ 五倍子联用后，不具有协同抑菌作用。（见表2）
3 结论与讨论
柱状黄杆菌引起的鱼类疾病目前主要采用投喂抗生素或中草药以及消毒剂消毒等方法来治疗［9-11］，例如张元生等人报道单方中草药诃子、乌梅、连翘、五倍子对鳜源柱状黄杆菌有较好的抑菌效果，张玉蕾［12］等人黄颡鱼源柱状黄杆菌对四环素、新霉素、诺氟沙星、环丙沙星、氟苯尼考5种药物敏感，对中西药复方联合治疗还未见报道。
本试验选取了水产养殖中常用的氟苯尼考、恩诺沙星和复方磺胺二甲氧嘧啶3种抗生素类药物，同时选取黄柏、黄芩、金银花、板蓝根、苦参、大黄、鱼腥草、穿心莲、黄芪、大青叶、连翘、五倍子12种常见中草药，对柱状黄杆菌进行了体外抑制试验，结果显示氟苯尼考、黄芩和五倍子抑菌效果较好；利用西药与中药联用试验，显示氟苯尼考和黄芩联用后，具有协同作用，而氟苯尼考和五倍子联用不具有协同作用，为防治鱼类柱状病提供理论基础。氟苯尼考和黄芩价格相对便宜，可以在水产养殖中应用。
参考文献
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