猴樟CbMYB308转录因子基因克隆及生物信息学分析

胡甜 叶苏梅 郝瑷滢 王艺润 韩浩章 张颖 王晓李 张丽华

摘要 为研究猴樟CbMYB308蛋白的序列结构和功能，该文克隆猴樟CbMYB308基因CDS序列，进行生物信息学分析。结果表明，克隆得到的序列具有1个942 bp完整的ORF框，编码313个氨基酸，与沉水樟中收录的RWR91885.1基因序列一致性达97.29%，系统进化树的结果表明，猴樟CbMYB308蛋白具有较高的保守性；猴樟CbMYB308蛋白生物信息学分析结果表明，CbMYB308蛋白具有PLN03091家族结构域，为R2R3-MYB型转录因子，CbMYB308蛋白化学分子式为C1496H2356N432O489S11，相对分子量34.57 kDa，理论等电点6.12，结构不稳定，无序化特征明显，为脂溶性和亲水性蛋白，磷酸化氨基酸位点有53个，亚细胞定位预测为细胞核。

关键词 猴樟；转录因子；基因克隆；生物信息学分析

中图分类号 S792.23 文献标识码 A

文章编号 1007-7731（2023）03-0014-04

猴樟（Cinnamomun bodinieri Levl.）为樟科樟属常绿乔木，主要分布于我国南方地区，是我国重要的精油加工树种、绿化树种和林用树种。我国关于猴樟的研究主要集中于精油资源、林用特性、组培技术和引种栽培等方面，近年来的研究表明，猴樟的生长速度和抗寒性优于香樟[1]，可以替代香樟在我国北方地区推广应用。很早就进行了香樟新品种选育工作，相继选育出涌金、霞光、御黄等彩叶品种[2-4]，然而，关于猴樟彩叶新品种选育较少。研究表明，花青素种类、组成及其代谢调控是植物叶片呈色的关键因素，而花青素代谢主要受转录因子MYB、bHLH、WD40及其复合物的调控[5]，其中MYB类转录因子调控功能研究最受关注，本研究基于转录组数据筛选出调控植物花青素合成的转录因子，并分析其特性，以期为猴樟新品种选育提供基因资源。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料为猴樟变种（春季叶色为红色）2年生种苗，于2019年3月上旬播种，2021年3月上旬进行移栽。于2021年8月20日，取猴樟枝条顶部幼嫩叶片进行液氮速冻后，用RNAperp Pure Plant Kit（天根，北京）试剂盒提取材料的总RNA，按照PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser（TaKaRa，大连）方法去除基因组DNA后，用TR Prime Mix（random primer）进行反转录反应，获得的cDNA产物作为模板。

1.2 基因克隆

根据猴樟转录组数据，获得在红叶猴樟变种叶片中上调表达的MYB转录因子基因序列，使用Primer Premier 5.0软件设计CDS扩增引物[F（5′—3′）：AGAATGGGAAGAGCGCC；R（5′—3′）：TCAA TCTACAAGCTTCTTATGC]，PCR反应采用25 μL体系[6]，反应产物直接转化大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α感受态细胞（TSINGKE，北京），挑单菌落进行PCR鉴定，将PCR阳性菌落培养后，提取质粒送擎科生物技术有限公司测序。

1.3 生物信息学分析

通过ORF Finder（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）将猴樟CbMYB308基因翻译成蛋白序列；利用NCBI的CCD工具（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）进行蛋白结构域预测；利用Protparam（http：//web.expasy.org/protparam/）对氨基酸序列的理化性质和等电点进行分析；采用Prot Scale（https：//web.expasy.org/protscale/）进行蛋白质的亲/疏水性预测；采用PRABI（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl）在线软件进行蛋白二级结构分析；利用Fold Index软件（https：//fold.weizmann.ac.il/fldbin/findex）分析氨基酸折叠无序化特性分析；采用SoftBerry ProtComp 9.0（http：//linux1.softberry.com/）和Cell-PLoc 2.0在线分析软件（http：// www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/）进行蛋白亚细胞定位；采用Swiss-Model（http：//www.Swissmodel.expasy.org）预测蛋白质三级结构，并利用PyMOL软件生成三级结构模型；利用MEGA7.0生成与CbMYB308的CDS序列同源性较近的物种序列进化树。

2 结果与分析

2.1 猴樟CbMYB308基因的克隆与重组载体构建

根据克隆后的凝胶电泳图（图1），以猴樟的cDNA为模板，通过PCR扩增得到1条约1 000 bp的条带，片段大小与预期一致，通过测序得到长942 bp的CDS序列。PCR产物送公司测序，测序结果与沉水樟中收录的RWR91885.1基因进行比对，序列一致性高达97.29%，具备MYB转录因子的功能。将克隆获得的基因编码蛋白通过NCBI BLAST Protein與数据库进行比对，根据比对结果显示，所克隆得到的序列具有1个942 bp完整的ORF框，推导编码313个氨基酸，将获得的目的基因命名为CbMYB308。

2.2 猴樟CbMYB308蛋白的生物信息学分析

2.2.1 猴樟CbMYB308蛋白的理化性质分析。利用Protparam软件对猴樟CbMYB308蛋白的理化性质进行分析，猴樟CbMYB308蛋白相对分子量34.57 kDa，理论等电点6.12，表明CbMYB308基因编码蛋白为弱酸性，化学分子式为C1496H2356N432O489S11，原子总数为4 784，不稳定指数值为48.55，不稳定系数大于40时为不稳定蛋白，因而该蛋白质是不稳定的。脂溶指数为66.77，CbMYB308基因编码蛋白为脂溶性蛋白，带负电荷的残基（asp+glu）总数为39，带正电荷的残基（arg+lys）总数为36。利用NCBI的CCD工具（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）进行蛋白结构域预测，结果表明（图2），CbMYB308蛋白具有PLN03091家族结构域，具备R2R3-MYB型转录因子。利用Prot Scale（https：//web.expasy.org/protscale/）对猴樟CbMYB308基因编码蛋白的亲水性进行分析（图3），总平均亲水性值（GRAVY）为-0.568，预测该蛋白为亲水性蛋白。蛋白质亲水性分析对于研究其跨膜特征和二级结构有着重要的指导意义，通常认为，氨基酸分值越低亲水性越强，分值越高疏水性越强。猴樟CbMYB308基因编码蛋白各氨基酸序列中第267位氨基酸分值最低为-2.556，亲水性值最强；第303位氨基酸分值最高，为2.089，疏水性最强，就整体分析而言，亲水性氨基酸均匀分布在整个多肤链中，没有明显的疏水性区域，因此，推测猴樟CbMYB308基因编码蛋白为亲水性蛋白。

2.2.2 猴樟CbMYB308蛋白二、三级结构预测。蛋白亚细胞定位结果表明该蛋白定位于细胞核。根据蛋白二级结构在线预测结果（图4），该蛋白的组成为122个氨基酸（38.98%）为α-螺旋、39个氨基酸（12.46%）为延伸主链，23个氨基酸（7.35%）为β转角及129个氨基酸（41.21%）为随机卷曲，因而猴樟CbMYB308主要由α-螺旋和随机卷曲组成；蛋白质中二硫键桥的可能数量为76种不同组合。利用Fold Index对猴樟CbMYB308蛋白进行氨基酸序列折叠无序化分析（图5），结果表明，该蛋白存在7个氨基酸无序化区域，共包含178个氨基酸，折叠无序化比例为56.87%，折叠无序化指数为0.056，无序化特征明显。蛋白磷酸化位点进行预测结果（图6），该多肽链0.500以上分值的氨基酸位点为53个，其中包含36个丝氨酸（S）、15个苏氨酸（T）和2个酪氨酸（Y）磷酸化位点。根据蛋白三级结构预测结果和同源建模分析（图7），CbMYB308编码蛋白三级结构与PDB：1a5j.1.A的氨基酸序列一致性达46.23%，1a5j.1.A序列的编码蛋白R2R3-MYB转录因子。

2.2.3 猴樟CbMYB308蛋白序列同源比对及系统进化树。在NCBI数据库中对猴樟CbMYB308蛋白序列进行blastp比对，根据结果下载比对得分较高的氨基酸序列，再通过MEGA7.0软件构建CbMYB308蛋白系统进化树（图8）。结果表明，猴樟CbMYB308蛋白在进化树上与同为樟科樟属的沉水樟聚为一类，说明其亲缘关系最近，樟科樟属植物中该类蛋白具有较高的保守性。猴樟CbMYB308蛋白进化树中大概分3类，其中猴樟与沉水樟、博落回归为一类，其次是麻雀花、流苏马兜铃、蓝星睡莲和卢旺达睡莲归为一类，与猴樟亲缘关系更远的深圳拟莲、椰子、铁皮石斛和鼓槌石斛归为一类。

3 结论与讨论

MYB转录因子对花青素生物合成包括正调控和负调控2个方面，其中起正调控作用的主要是R2R3-MYB蛋白S6亚组，该亚组具有保守的“KPRPR[S/T]F”基序，光照、温度、糖、激素等均能诱导R2R3-MYB转录因子表达，从而促进花青素合成[7]。MYB转录因子对花青素生物合成调控具有组织特异性，是人们研究的重点，本研究结果表明，克隆得到的序列具有1个942 bp完整的ORF框，编码313个氨基酸，与沉水樟中收录的RWR91885.1基因序列一致性达97.29%，系统进化树的结果表明，猴樟CbMYB308蛋白具有较高的保守性，与前期研究结果一致[7]；猴樟CbMYB308蛋白生物信息学分析结果表明，CbMYB308蛋白具有PLN03091家族结构域，为R2R3-MYB型转录因子，亚细胞定位预测为细胞核，结合表型来看，只在叶片显示红色，而在茎、花、根中不显示红色，说明CbMYB308具有明显的组织特异性，研究结果为进一步进行猴樟叶片花青素合成途径及其调控网络研究提供了基础。

4 参考文献

[1] 韩浩章，张丽华，王晓立，等. 猴樟与香樟幼苗的耐盐碱性比较[J]. 西部林业科学，2019，48（05）：7-14.

[2] 王建军. 香樟新品种‘涌金[J]. 林业科学，2010，46（08）：181.

[3] 王建军. 香樟新品种‘霞光[J]. 林业科学，2015，51（06）：163.

[4] 王豪，张波，陆云峰，等. 香樟新品种‘御黄[J]. 园艺学报，2019，46（S2）：2924-2925.

[5] 王欣，张天柱. 园艺作物花青素合成调控研究进展[J]. 生物技术进展，2022，12（01）：10-16.

[6] 韩浩章，张丽华，李素华，等. 猴樟CbP5CS1基因克隆及表达载体构建[J/OL]. 分子植物育种：1-9.http：//kns.cnki.net/kcms/detail/46.1068.S.20210720.1751.012.html.

[7] Stracke R，Werber M，Weisshaar B. The R2R3-MYB gene family in Arabidopsis thaliana.[J]. Current Opinion in Plant Biology，2001，4（5）：447-456.

（責编：王 菁）

基金项目 宿迁学院2020年优秀论文培育团队项目；江苏省自然科学基金（BK20201481）；宿迁市科技计划（M202001）；宿迁市科技计划（L202004）；宿迁学院创新团队项目（2021td05）。

作者简介 胡甜（1998—），女，江苏南通人。研究方向：樟属植物研究与应用。

韩浩章*通信作者

收稿日期 2022-03-23