干旱胁迫下外源ABA对甘蔗幼苗生理特性和基因表达的影响

农倩　谢金兰　林丽　莫璋红　王泽平　宋修鹏　李长宁

关键词：甘蔗；脱落酸；干旱胁迫；生理特征；基因表达

中图分类号：S566.1 文献标识码：A

甘蔗是世界上重要的糖料作物，生长周期长、需水量大。但我国80%以上的甘蔗种植在丘陵旱坡地上，季节性干旱频繁，已成为影响甘蔗糖业可持续发展的重要因素之一。植物能通过感受刺激和信号传导，启动各种生理生化反应响应水分胁迫。干旱胁迫下，植物叶片气孔导度、叶绿素合成及电子传递会受到抑制，导致光合作用效率降低[1] 。干旱胁迫还导致植物细胞内活性氧（reactive oxygen species， ROS）大量积累，致使细胞发生膜脂过氧化作用和膜系统变性[2]。为此，植物抗氧化系统相关酶类如超氧化物歧化酶（ superoxide dismutase， SOD ）、过氧化物酶（peroxidase， POD）、过氧化氢酶（catalase， CAT）等的活性显著增强，非酶类抗氧剂如谷胱甘肽、类黄酮、酚类、类胡萝卜素等的含量显著提高，以清除过量ROS 积累带来的损害[3]。脯氨酸（proline，Pro）作为一种渗透调节物质，对干旱胁迫下植物细胞膜和蛋白质结构维持具有重要作用[4]。研究表明， 植物激素尤其是脱落酸（abscisic acid，ABA）在响应水分胁迫中扮演重要角色[5-7]。干旱胁迫下，植物合成大量ABA，促使叶片气孔关闭以减少水分散失，促进根系吸收水分，调节ABA响应基因并改变基因表达模式，增强植株抵抗逆境的能力[8-9]。研究显示，植物对干旱胁迫响应的信号转导基因中，约10%的基因受ABA 调控[10-11]。

干旱胁迫会干扰内源激素平衡从而阻碍植物的正常生长发育，通常情况下植物能通过自身的调节机制减轻外界胁迫带来的影响。但这种机制具有滞后性，往往不能满足植物对外界环境变化的要求而使植物受损害，特别在一些抗胁迫能力弱的作物品种上表现得尤为突出。外源植物生长调节剂能在一定程度上弥补上述调节机制的缺陷，从而提高植物耐受胁迫的能力[12-14]。研究证实，干旱胁迫下外施ABA 后，植物可溶性糖和Pro 等渗透调节物质含量上升，细胞渗透势下降，保水能力增强，有利于根系吸收水分和降低膜脂过氧化程度，保护细胞膜结构完整性[5， 7]。ABA预处理可以增强植物在应对干旱[13]、低温[14]、盐害[15]、重金属[16]胁迫条件下的抗氧化防护能力。甘蔗生长期长达12～18 个月，受季节性干旱威胁严重，若甘蔗苗期发生旱情，则会直接影响后续分蘖和伸长，导致减产。本研究拟在干旱胁迫下，分析外源ABA 对苗期甘蔗生理特性和抗氧化酶編码基因表达的影响，探讨外源ABA 提高甘蔗幼苗抗旱性的生理生化机理。

1 材料与方法

1.1 材料

甘蔗品种为‘桂糖42 号（GT42），采用桶栽土培方式，塑料桶规格为直径32 cm×高35 cm，每桶装土18.5 kg（ 粘壤土， 土壤最大持水量41.6%，有机质含量18.7 g/kg，全氮含量85.6 g/kg，有效氮含量89.4 mg/kg，有效磷含量63.2 mg/kg，有效钾含量98.4 mg/kg，pH 5.8），桶底钻孔以增强透气性。单芽蔗种用甲基托布津浸种，于泥沙混合培养基质上先育苗，30 d 后，选取生长一致的甘蔗苗移栽至桶中，每桶2 株，将桶置于智能温室，按照日常管理。待植株生长至5～7 片完全叶时，设CK（正常淋水）、CK+ABA、干旱、干旱+ABA 共4 组处理。在进行干旱胁迫前连续2 d叶面喷施浓度为15 μmol/L 的ABA 溶液，程度为叶面湿透无滴水，其余2 组喷清水作对照，每个处理10 桶，3 次重复。正常淋水和干旱处理土壤含水量分别为最大持水量的60%～70% 、30%～40%，采用称重法进行控水。干旱处理开始后每隔3 d 和6 d 分别测定+1 叶的相对含水量和叶绿素荧光参数。在干旱处理后18 d，测定叶绿素荧光参数后，采集相应+1 叶样品，液氮速冻后，放入–80 ℃冰箱保存待用。

1.2 方法

1.2.1 生理生化指标测定 采用饱和含水量法测定叶片相对含水量[17]；叶绿素、脯氨酸（Pro）、丙二醛（MDA）和过氧化氢（H2O2）含量分别按照孙哲等[18]、BATES 等[19]、HEALTH 等[20]和JALEEL 等[21]的方法进行测定；使用羟胺氧化法测定超氧阴离子自由基（O2–）产生速率[22]；按照IRITI 等[23]的方法测定脱落酸（ABA）和生长素（IAA）含量；使用苏州科铭生物技术有限公司商品化试剂盒测定过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、抗坏血酸过氧化物酶（ascorbateperoxidase， APX）、过氧化物酶（POD）的活性，操作步骤按说明书。

1.2.2 叶绿素荧光参数测定 选取长势一致植株的+1 叶， 使用FMS-2 脉冲调制式荧光仪（hansatech， UK）测定叶绿素荧光参数。将叶片充分暗适应后，先打开测量光测定最小荧光Fo，后打开饱和脉冲光测定最大荧光Fm，再启动1000 μmol/（m2·s）的作用光，每隔20 s 测定一次光下的荧光参数，以时间为横坐标，描绘光系统II的实际光化学效率ΦPSII 启动变化曲线。

1.2.3 基因表达量测定 以甘蔗GAPDH 为内参基因，设计特异引物（表1），测定抗氧化酶CAT、SOD、APX、POD 编码基因、ABA 合成限速酶9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶（NCED）编码基因、脯氨酸合成关键酶△1-吡咯啉-5-羧酸合成酶（P5CS）编码基因相比对照的表达量变化。采用TRIzol （Invitrogen）试剂提取叶片总RNA，逆转录为cDNA，进行基因表达量测定。反应体系为：10 μL 2×All-in-One qPCR Mix （Gene Copoeia）、2 μL cDNA、4 μmol/L 的正反向引物各1、6 μL双蒸水。反应程序为：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，40 个循环。经熔解曲线检验后采用2–ΔΔCT 法进行表达量计算[24]。

1.3 数据处理

用DPS 软件以Duncans 新复极差法（P≤0.05）进行各处理平均数差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 叶片相对含水量（RWC）变化

干旱胁迫显著降低了甘蔗叶片相对含水量（图1）。在处理的第3、6、9、12、15、18 天，分别比对照减少2.7%、9.0%、15.1%、22.5%、26.4和31.6%，降幅随干旱时间延长而增大。干旱+ABA 处理能够提高叶片相对含水量，分别比同期干旱处理增加了1.3%、4.0%、7.1%、11.1%、11.6%和14.6%，增幅逐渐变大。正常淋水条件下喷施ABA 处理（CK+ABA）的叶片相对含水量与对照间差异不显著。

2.2 ABA和IAA含量变化

干旱、干旱+ABA 处理的ABA 含量均显著高于对照，但增量不同（图2A）。处理18 d 时，干旱处理的ABA 含量比对照增加75.2%，而干旱+ABA 处理比对照增加125.1%，干旱+ABA 处理比干旱处理增加了28.5%，差异显著。相比对照，干旱、干旱+ABA 处理均提高了甘蔗叶片的IAA含量（图2B），处理18 d 时，分别比对照提高了19.9%和18.2%，差异显著，但干旱、干旱+ABA处理间的IAA 含量差异不显著。

2.3 Pro和MDA含量变化

干旱胁迫使甘蔗叶片Pro 含量显著高于对照，而干旱+ABA 处理可进一步提高叶片Pro 含量，胁迫18 d 时干旱+ABA 处理的Pro 含量比干旱处理增加了23.2%，差异显著，而CK+ABA 处理和对照间的Pro 含量差异不显著（图2C）。干旱处理提高了甘蔗叶片MDA 含量，在处理后18 d 比对照提高了68.7%，差异显著。干旱+ABA 处理的MDA 含量比对照提高了34.1%，但比干旱处理降低20.5%，差异显著（图2D）。正常淋水条件下喷施ABA 处理（CK+ABA）的叶片MDA 含量与对照差异不显著。

2.4 叶绿素含量变化

干旱胁迫显著降低了叶绿素a 和叶绿素b 的含量，而干旱+ABA 处理能够显著缓解叶绿素的降解，胁迫18 d 时干旱+ABA 处理的叶绿素a 和叶绿素b 含量分别比干旱处理增加19.7%和25.5%。CK+ABA 处理的叶绿素含量与对照间差异不显著（图2E、图2F）。

2.5 光系统Ⅱ实际量子效率（ΦPSⅡ）变化过程

由图3 可知，干旱处理降低了叶片光系统Ⅱ实际量子效率ΦPSⅡ，破坏程度随着干旱胁迫时间延长而加重，干旱+ABA 处理能减轻这种破坏作用，使光系统Ⅱ实际量子效率ΦPSII 始终高于干旱处理。CK+ABA 处理和CK 間的光系统Ⅱ实际量子效率差异不显著。

2.6 活性氧（ROS）含量变化

干旱、干旱+ABA 处理的ROS 含量均显著高于对照（图4）。处理18 d 时，干旱处理的O₂^–产生速率比对照增加73.4%，而干旱+ABA 处理比对照增加44.8%，后者比前者降低16.5%，差异显著（图4A）。干旱、干旱+ABA 处理均显著提高甘蔗叶片H₂O₂含量，处理18 d 时，分别比对照提高82.3%和38.7%，但后者H₂O₂含量比前者降低了23.9%（图4B），差异显著。

2.7 抗氧化酶活性变化

干旱胁迫处理18 d 时，甘蔗叶片CAT、SOD、APX、POD 的活性分别比对照提高52.1%、23.9%、40.1%和12.2%，而干旱+ABA 处理分别比对照提高113.6%、41.4%、43.7%和38.8%，差异显著（图5）。同时期干旱+ABA 的相关抗氧化酶活性比干旱处理分别增加40.5%、14.1%、2.5%和23.7%，除APX 外，活性均比干旱处理显著增加（图5）。

2.8 基因表达量的变化

由图6 可知，处理18 d 时，正常淋水条件下喷施ABA 处理（CK+ABA）对甘蔗叶片抗氧化酶CAT、SOD、APX、POD 编码基因、NCED1 基因、P5CS 基因的表达量影响不显著。除CAT3 和APX1外，干旱胁迫提高了相关编码基因的表达量，其中NCED1、P5CS1、P5CS2、CAT1、CAT2、SOD1、SOD2、APX2、APX3、POD1 和POD2 的表达量分别是对照的3.38 倍、2.21 倍、2.32 倍、1.67 倍、1.42 倍、2.33 倍、2.17 倍、1.55 倍、1.37倍、1.56 倍和1.49 倍，差异显著。相比干旱处理，干旱+ABA 处理的NCED1、CAT2、CAT3、SOD2、APX1、APX2 和POD1 的表达量分别提高了58.3%、54.2%、57.7%、70.1%、16.9、26.5%和37.2%，差异显著。

3 讨论

干旱胁迫条件下，植物内源ABA 的积累会促进叶片气孔关闭，减少水分蒸发，提高叶片相对含水量[8-9， 25]。本研究中，随着胁迫加剧，干旱+ABA 处理甘蔗的叶片相对含水量比干旱处理显著增加，表明ABA 处理能提高干旱条件下甘蔗叶片的保水能力。研究表明，干旱胁迫会显著提高植物内源ABA 含量，而胁迫下外源ABA 处理能够进一步促进ABA 的合成和积累，使其含量处于更高水平[25-26]。本研究结果显示，干旱处理18 d时甘蔗叶片ABA 含量比对照显著增加，而干旱+ABA 处理的增幅又显著高于干旱处理，与前人研究结果一致。研究显示，9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶（9-cis-epoxy carotenoid dioxygenase，NCED）催化类胡萝卜素氧化裂解生成黄质醛，是植物内源ABA 生物合成途径最重要的限速步骤，NCED 基因表达可被非生物胁迫强烈诱导，表达量与ABA 含量有着协同效应[22]。本研究结果表明，干旱处理18 d 时NCED1 表达量为对照的3.38 倍，而干旱+ABA 又比干旱处理提高了58.3%，与ABA 含量变化一致。研究表明，ABA对植物众多生理生化途径的调控作用与其他内源激素代谢密切相关[25-27]。本研究显示，干旱胁迫下甘蔗叶片IAA 含量随着ABA 含量显著上升，但干旱+ABA 处理的IAA 含量与干旱处理间无显著差异，显示了ABA 和IAA 在响应逆境胁迫时的重要联系，但还需进一步研究才能明确这2 种激素的相互调控作用。

植物生长代谢过程中ROS 的产生不可避免，自稳态水平的ROS 在植物正常生长发育及应对环境胁迫中起着重要作用，干旱胁迫常导致植物细胞ROS 含量急剧上升[28]。本研究结果显示，干旱处理18 d 时甘蔗叶片的O₂^–产生速率和H₂O₂含量分别比对照显著增加73.4%和82.3%，表明此时植物抗氧化防护系统已无法及时清除过量的ROS 而导致其积累。过量的ROS 积累打破了植物体内的氧化还原平衡，引起膜质过氧化作用，膜脂中不饱和脂肪酸过氧化产生MDA，导致膜系统被破坏，MDA 含量高低反映了膜脂过氧化程度[25， 29]。前人研究表明，逆境脅迫下外源ABA 处理可以诱导植物抗氧化酶基因的表达，提高相关抗氧化酶的活性[30-32]。本研究结果表明，同时期干旱+ABA处理的CAT、SOD、POD 活性均比干旱处理显著提高，同时CAT2、CAT3、SOD2、APX1、APX2和POD1 基因的表达量也比干旱处理显著增加。相关抗氧化酶活性的提高，增强了植物清除过量ROS 的能力，降低膜脂过氧化程度，保护膜结构的完整性。本研究结果表明，干旱+ABA 处理的ROS 和MDA 含量虽比对照显著增加，但仍然显著低于干旱处理，证实外施ABA 处理能有效缓解干旱胁迫对膜系统的损害。研究表明，Pro 作为重要的渗透调节物质，干旱胁迫下Pro 含量增加有利于维持渗透调节，增强细胞膜系统稳定性及过量ROS 的清除[4， 33]。本研究中，干旱、干旱+ABA 处理的Pro 含量均比对照显著性增加，但干旱+ABA 处理的增量水平高于单纯干旱处理，说明ABA 处理能进一步加强干旱胁迫下Pro 的生物合成，将有助于增强叶片保水能力，提高叶片相对含水量。干旱、干旱+ABA 处理Pro 合成关键调控酶基因P5CS1 和P5CS2 的表达量比对照显著提高，与Pro 含量变化一致。但这2 个基因的表达变化在上述两处理间差异不显著，与Pro 含量变化不一致，这可能与基因的转录后修饰有关，还需进一步研究证实。

光合作用是作物生长和产量形成的重要代谢过程，干旱胁迫会导致植物叶绿体膨胀，顺序排列紊乱，基质片层模糊，基粒间连接松弛，类囊体层肿胀或解体，致使叶绿素含量下降，过量的ROS 积累还会破坏光合器官的超微结构，影响光合作用过程[34]。本研究发现，干旱处理使甘蔗叶绿素含量显著降低，而喷施外源ABA 处理能够减缓干旱条件下叶绿素的降解程度，与前人的研究结果一致[18， 35]。干旱胁迫下外源ABA 处理提高了相关抗氧化酶的活性，增强了过量ROS 的清除能力，减轻了ROS 的积累对光合作用系统造成的伤害，此外，干旱+ABA 处理Pro 含量显著提高，叶片保水能力显著增强，可能是该处理甘蔗叶绿素含量、光系统Ⅱ实际量子效率（ΦPSⅡ）始终高于干旱处理的重要原因。