乌头汤对膝骨关节炎大鼠软骨细胞焦亡相关基因表达的影响

金灵璐 付长龙 涂海水 李莹莹 郑志煌 仲卫红 李宇涛

【摘 要】目的：探讨乌头汤通过调控软骨细胞炎性焦亡途径延缓膝骨关节炎软骨退变的作用与机制。方法：将36只SD大鼠（雄性，8周龄）随机分为空白对照组、模型对照组和乌头汤组，每组12只。空白对照组不造模，模型对照组和乌头汤组采用改良Hulth法造模。空白对照组与模型对照组采用生理盐水（3 mg·kg-1·d-1）灌胃，乌头汤组采用乌头汤（生药浓度4.2 g·mL-1）灌胃。干预8周后，麻醉状态下摘取大鼠膝关节软骨。采用Western blot检测不同组别关节软骨中核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（NLRP3）、半胱氨酸蛋白酶-1（Caspase-1）、白细胞介素（IL）-1β、IL-18的蛋白含量表达；采用Real-time PCR检测不同组别关节软骨中NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18的基因相对表达变化。结果：模型对照组和乌头汤组NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白含量与基因相对表达量均上调，与空白对照组比较，差异有统计学意义（P < 0.01）；乌头汤组能够下调NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白含量与基因相对表达量，与模型对照组比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。结论：乌头汤可改善膝骨关节炎大鼠软骨NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18的表达，抑制软骨细胞焦亡，延缓软骨退变。

【关键词】 膝骨关节炎；乌头汤；核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3；半胱氨酸蛋白酶-1；炎症因子；关节软骨；细胞焦亡；大鼠

【ABSTRACT】Objective：To explore the effect and mechanism of Wutou Tang（乌头汤）on delaying the cartilage degeneration of knee osteoarthritis by regulating the inflammatory pyrosis of chondrocytes.Methods：Thirty-six SD rats（male，eight weeks old）were randomly divided into a blank control group，a model control group and a Wutou Tang group，12 rats in each group.Except the blank control group，the other groups were established models by modified Hulth method.The blank control group and the model control group were gavaged with normal saline（3 mg·kg-1·d-1），while the Wutou Tang was gavaged with Wutou Tang（crude drug concentration 4.2 g·mL-1）.After 8 weeks of intervention，the rat knee joint cartilage was removed under anesthesia.Detection of protein content expressions of NLRP3，Caspase-1，IL-1β and IL-18 of articular cartilage was made in different groups by Western blot.Real-time PCR was used to detect the relative expressions of NLRP3，Caspase-1，IL-1β and IL-18 of articular cartilage in different groups.Results：The protein content and the relative expression of NLRP3，Caspase-1，IL-1β and IL-18 in the model control group and the Wutou Tang group were up-regulated，and the difference was statistically significant compared with the blank control group（P < 0.01）.In the Wutou Tang group，the protein content and the relative expression of NLRP3，Caspase-1，IL-1β and IL-18 can be down-regulated，and the difference was statistically significant compared with the model control group（P < 0.05）.Conclusion：Wutou Tang can improve the expressions of NLRP3，Caspase-1，IL-1β and IL-18 in cartilage of knee osteoarthritis rats，inhibit chondrocyte pyrosis and delay cartilage degeneration.

【Keywords】 knee osteoarthritis;Wutou Tang（烏头汤）;NLRP3;Caspase-1;inflammatory factors;articular cartilage;cell pyrosis;rats

膝骨关节炎（knee osteoarthritis，KOA）是常见的慢性退行性骨关节疾病，以关节内部炎症与软骨磨损导致的疼痛、僵硬、活动受限为主要特征。关节软骨细胞正常生理状态改变是导致软骨退变或损伤、发生炎性反应的重要原因［1］。目前，KOA的发病率呈现逐年上升趋势，且致残率较高，给患者家庭和社会造成极大的负担，亟需寻找有效的治疗方法。乌头汤源于《金匮要略》，是治疗痹证的经方，由制川乌、麻黄、白芍、黄芪、炙甘草组成，功擅温阳通络、宣痹止痛，可用于治疗寒湿痹阻所致的肢体关节疼痛、屈伸功能障碍等，临床治疗KOA效果显著，但作用机制尚不明确［2］。近年研究证实，细胞焦亡作为一种新型细胞程序性死亡方式，与KOA的转归密切相关。细胞焦亡发生后，可导致软骨周围炎症因子的释放增加，并加剧软骨的降解与退变［3］。半胱氨酸蛋白酶-1（Caspase-1）介导细胞炎性焦亡经典通路， 核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（NLRP3）在KOA疾病发生过程中被激活，参与软骨病理代谢过程［4］。白细胞介素-1β（IL-1β）与IL-18是NLRP3经典下游炎症因子。因此，本研究从炎性焦亡途径，探究乌头汤对KOA大鼠软骨中NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18表达的影响，探讨其参与软骨细胞炎性焦亡的作用机制，以期为临床乌头汤治疗KOA提供实验依据。

1 实验材料

1.1 实验动物 SPF级雄性SD大鼠36只，2月龄，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司，实验动物生产许可证号SCXK（沪）2012-0002。饲养于福建中医药大学实验动物中心，实验动物使用许可证号SYXK（闽）2019-0001。自由进食，适宜温度，标准环境喂养。

1.2 实验药物 乌头汤药材由福建中医药大学附属第三人民医院药剂科提供，药物组成：制川乌6 g，麻黄、芍药、炙甘草、黄芪各9 g。注射用青霉素钠160万单位（江西科达动物药业有限公司）。

1.3 实验试剂及器材 SDS-PAGE凝胶制备试剂盒（批号16J27C38，博士德生物工程有限公司）；超敏ECL化学发光试剂盒（批号082020201116，碧云天生物技术有限公司）；GAPDH 兔源多克隆抗体（批号00098110，武汉三鹰生物技术有限公司）；山羊抗兔IgG（H + L）（武汉三鹰生物技术有限公司）；HRP conjugate（批号20000258，武汉三鹰生物技术有限公司）；RNA isolater? Total RNA Extraction Reagent试剂盒（批号7E490L0，诺唯赞生物技术有限公司）；ChamQ? SYBR? qPCR Master Mix试剂盒（批号7E412L0，诺唯赞生物技术有限公司）；HiScript? Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR（+ g DNA wiper）试剂盒（批号7E572G1，Vazyme）；NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18引物（尚亚生物技术有限公司）；凝胶成像系统（型号GELDOC2000，美国Bio-Rad公司）；PCR仪（型号C1000 Touch，美国Bio-Rad公司）；荧光定量PCR仪（型号CFX96，美国Bio-Rad公司）。

2 实验方法

2.1 乌头汤制备 纯水浸泡制川乌30 min，先煎1 h，降低毒性；后加入其余药材共同煎煮1 h，所得煎剂过滤制备浓缩剂（含生药量为4.2 g·mL-1），室温冷却后，4 ℃保存。

2.2 分组及造模方法 8周龄雄性SD大鼠36只，按照随机数字表法分为空白对照组12只和造模组24只。适应性喂养1周后，采用改良Hulth法造模，术前禁食12 h，自由饮水。采用质量分数为2%的戊巴比妥钠（默克医疗）腹腔注射麻醉，离断内侧副韧带与前交叉韧带，小心摘除内侧半月板，注意避免损伤软骨面。术后160万单位青霉素肌内注射给药预防感染，注意观察大鼠失血及伤口愈合状况。驱赶活动0.5 h·d-1，加重软骨磨损。观察大鼠活动步态异常及关节肿胀严重程度，关节直径增长，模型鼠状态符合实验要求，将造模组大鼠随机分为乌头汤组和模型对照组，每组12只。

2.3 给药及取材 动物在统一饲养条件中进行干预。空白对照组与模型对照组给予生理盐水（3 mg·kg-1·d-1）灌胃，乌头汤组予乌头汤（生药浓度4.2 g·mL-1）灌胃，剂量变化参照大鼠平均体质量10 mg·kg-1·d-1计算。每周6次，共计8周。干预后摘取各组SD大鼠关节软骨，于液氮中保存。

2.4 Western Blot检测 分组干预后的软骨研磨后从匀浆中提取蛋白。定量后用SDS-PAGE凝胶制备试剂盒电泳分离，转膜，封闭，4 ℃环境中摇床震荡过夜。PVDF膜使用TBS-T清洗并稀释二抗孵育，室温下孵育1 h；化学发光液1∶1避光配制，PVDF膜置于成像仪中，均匀滴加显影液反应1 min，避光操作显影并分析。

2.5 Real-time PCR检测 RNA提取操作严格按照RNA isolater? Total RNA Extraction Reagent试剂盒说明书进行，于通风柜中冰上操作。所用试剂对人体有害，注意安全防护。4 ℃环境下离心机以12000 r·min-1离心20 min，离心半径15 cm，离心后于管底部可见白色透明羽毛样片状RNA，乙醇洗涤后10 μL DEPC水溶解，分光光度计下检测RNA浓度，并将其调整到适宜浓度。逆转录操作严格按照HiScript? Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR（+ g DNA wiper）试剂盒说明书进行。各项引物合成序列见表1。反应体系：ChamQ? SYBR? qPCR Master Mix 8.2 μL，上游引物0.4 μL，下游引物0.4 μL，cDNA 1 μL。使用實时定量PCR检测各组软骨组织NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18 mRNA表达水平。

2.6 统计学方法 采用SPSS 25.0软件进行统计分析。计量资料以表示，采用正态性及方差齐性检验；组间比较采用t检验与非参数检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 Real-time PCR检测结果 与空白对照组比较，模型对照组软骨中NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18的mRNA水平显著升高（P < 0.01）；与模型对照组比较，乌头汤组软骨组织中NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18的mRNA水平显著降低（P < 0.01）。见表2。

3.2 Western blot检测结果 与空白对照组比较，模型对照组软骨中NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白表达水平升高（P < 0.01）；与模型对照组比较，乌头汤组NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白表达水平下降（P < 0.01或P < 0.05）。见表3、图1。

4 讨 论

KOA是常见慢性退行性疾病，目前临床中缺少有效的治疗方法。软骨细胞死亡、软骨与软骨下骨磨损是KOA发生的病理基础［5］。KOA属中医学“痹证”范畴［6］。乌头汤方以制川乌为君药，温经散寒；白芍配伍甘草，缓急止痛；制川乌配伍黄芪、甘草，调和乌头之毒；麻黄散寒宣痹。全方温阳通络除痹，标本共治［7］。乌头汤具有良好的抗炎作用，可减轻KOA疼痛［8］。

细胞焦亡是一种非溶解性、通常免疫沉默的程序性细胞死亡，主要通过Caspase-1介导的典型途径和Caspase-4、Caspase-5、Caspase-11介导的非典型途径发挥作用。Caspase-1被多种炎症小体（多蛋白信号复合物）激活后，炎症小体聚集形成细胞内大分子蛋白复合物，并将pro-Caspase-1转化为活性形式，打破钠和钾的浓度梯度破坏质膜的常规渗透屏障，导致渗透压变化，超过细胞的代偿能力，细胞膨胀、破裂，最终死亡［9］。研究表明，KOA中的软骨降解、炎症反应等一系列病理改变均与细胞焦亡相关［10］。NLRP3炎症小体的激活触发促炎细胞因子释放，引发焦亡，参与各种疾病的发生、发展，通过促发宿主细胞的炎性反应达到消灭入侵细菌的目的［11］。在其他外源性入侵或环境胁迫等免疫激活因子存在时，NLRP3开放并与NLRP3和凋亡相关斑点样蛋白（ASC）的pyrin结构域相互作用，随着ASC的Caspase招募域（CARD）与pro-Caspase-1上的CARD域结合，最终导致局部或全身炎症反应［12］。研究表明，高水平的IL-1β诱导软骨细胞的原矿化活性和骨骼的分解代谢作用，进而促进软骨钙化（骨化）和退化，参与软骨下骨重塑的进展［13］；而IL-18由关节软骨细胞产生，诱导炎症反应，提高软骨细胞中基质金属蛋白酶含量，并生产多种促炎症因子［14］。IL-1β和IL-18的释放促进了多种炎性介质和分解代谢因子的产生和释放，这些炎性介质和分解代谢因子可导致软骨细胞功能障碍和细胞外基质降解。研究表明，Caspase-1蛋白酶是IL-1β分泌、焦亡和介导免疫所必需的关键酶［15］。

为了阐明乌头汤抑制软骨细胞焦亡的作用机制，本研究通过乌头汤干预治疗后，检测软骨中炎症指标变化，结果显示，与正常大鼠相比，KOA大鼠软骨组织中NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白和基因表达升高，经过乌头汤干预后，KOA大鼠软骨中的NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白与mRNA表达水平显著下降，提示乌头汤可能是通过调节NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18的表达，参与调节软骨细胞焦亡，抑制软骨细胞炎性反应，从而降低对软骨细胞的损伤，保护关节软骨，发挥对KOA的治疗作用。本实验将为进一步研究乌头汤对KOA的治疗机制及推广应用提供新的理论依据和实验基础。

参考文献

［1］ 陈浩雄，霍少川，马笃军，等.牛膝总皂苷体外干预人膝骨关节炎软骨细胞Ⅱ型胶原表达及最佳浓度的实验研究［J］.湖南中医杂志，2021，37（7）：141-144.

［2］ 陈长兴，仲卫红，金灵璐，等.乌头汤抑制膝骨关节炎软骨细胞氧化应激反应的作用研究［J］.风湿病与关节炎，2022，11（11）：1-4，15.

［3］ AN S，HU H，LI Y，et al.Pyroptosis plays a role in osteoarthritis［J］.Aging Dis，2020，11（5）：1146-1157.

［4］ CLAVIJO-CORNEJO D，MARTINEZ-FLORES K，SILVA-LUNA K，et al.The overexpression of NALP3 inflammasome in knee osteoarthritis is associated with synovial membrane prolidase and NADPH oxidase 2［J］.Oxid Med Cell Longev，2016（29）：1-14.

［5］ CHEN D，ZHANG Y，LIN Q，et al.The effect of cartilage decellularized extracellular matrix-chitosan compound on treating knee osteoarthritis in rats［J］.PeerJ，2021，12（9）：e12188-e12205.

［6］ 李滿意，刘红艳，陈传榜，等.膝痹的证治［J］.风湿病与关节炎，2022，11（9）：40-42，58.

［7］ 付长龙，梅阳阳，叶锦霞，等.乌头汤治疗寒湿痹阻型膝骨关节炎：与双氯芬酸钠的比较［J］.风湿病与关节炎，2017，6（4）：12-16.

［8］ ZHOU X，XIANG K，YUAN X，et al.Chinese herbal medicine Wutou decoction for knee osteoarthritis：a protocol for systematic review and Meta-analysis［J］.Medicine（Baltimore），2020，99（43）：e22767-e22775.

［9］ TAO Z，WANG J，WEN K，et al.Pyroptosis in osteoblasts：a novel hypothesis underlying the pathogenesis of osteoporosis［J］.Front Endocrinol（Lausanne），2020，8（11）：548812-548836.

［10］ 智佳佳，杜朝政，王宇泽.骨关节炎形成过程中细胞焦亡的作用与机制［J］.中国组织工程研究，2021，25（32）：5204-5209.

［11］ MEYERS AK，ZHU X.The NLRP3 inflammasome：metabolic regulation and contribution to inflammaging［J］.Cells，2020，9（8）：1808-1847.

［12］ SHAO BZ，XU ZQ，HAN BZ，et al.NLRP3 inflammasome and its inhibitors：a review［J］.Front Pharmacol，2015，5（6）：262-284.

［13］ CHIEN SY，TSAI CH，LIU SC，et al.Noggin Inhibits IL-1beta and BMP-2 expression，and attenuates cartilage degeneration and subchondral bone destruction in experimental osteoarthritis［J］.Cells，2020，9（4）：927-955.

［14］ BAO J，CHEN Z，XU L，et al.Rapamycin protects chondrocytes against IL-18-induced apoptosis and ameliorates rat osteoarthritis［J］.Aging（Albany NY），2020，12（6）：5152-5167.

［15］ QIAN J，FU P，LI S，et al.miR-107 affects cartilage matrix degradation in the pathogenesis of knee osteoarthritis by regulating Caspase-1［J］.J Orthop Surg Res，2021，16（1）：40-52.

收稿日期：2022-12-10；修回日期：2023-01-28

基金項目：福建省自然科学基金项目（2020J01736，2022J01374）；福建省卫生健康中青年骨干人才培养项目（2021GGA062）

作者单位：1.福建中医药大学中西医结合研究院，福建 福州 350122；2.福建省中西医结合老年性疾病重点实验室，福建 福州 350122；3.福建省康复技术重点实验室，福建 福州 350003；4.福建中医药大学附属康复医院，福建 福州 350003；5.福建中医药大学中医学院，福建 福州 350122

通信作者：李宇涛