鱼I 型胶原免疫调控巨噬细胞机制初探

2023-05-29戴美璐游元和

口腔材料器械杂志 2023年2期

戴美璐游元和肖孟陆华

（上海交通大学医学院附属第九人民医院口腔材料科，口腔颌面-头颈肿瘤科*，上海交通大学口腔医学院，国家口腔医学中心，国家口腔疾病临床医学研究中心，上海市口腔医学重点实验室，上海市口腔医学研究所，上海 200011）

胶原是重要的细胞外基质，广泛存在于动物的结缔组织中，具有良好的生物学结构和功能。目前，胶原是天然医用高分子材料转化研究的热点之一，其在组织再生、功能恢复领域展示出了良好的应用前景[1]。然而，国内、外现有的胶原类产品大多数为陆生动物来源的胶原。虽然陆生医用胶原材料应用需求广泛，但其昂贵的成本和潜在的病毒传播风险，在一些领域中的应用仍然受限，寻找陆生动物胶原的替代品是胶原类医用材料发展的趋势[2-3]。

基于以往研究，海洋源性胶原来源丰富，价格较低廉，生物安全性更高，还可以规避潜在的宗教壁垒问题；因此，海洋生物来源胶原无疑是最具潜力的替代性胶原[2,4]。当然，需要寻找合适的手段和途径，探讨并证实海洋源性胶原的医用价值及转化前景。海洋源性胶原最为常见的为鱼I 型胶原，I 型胶原是目前研究最为广泛的胶原类生物医用材料，尤其在组织诱导、修复再生领域。巨噬细胞是组织免疫微环境中的主要组成部位，是参与生物类医用材料发挥生物学功能的关键细胞[3]。基于此，本研究拟从来源相对较广泛的鱼I型胶原（marine type I collagen,MCI）入手，诱导人源巨噬细胞，体外给予不同浓度MCI 刺激，观察其生物安全性，并采用转录组测序的方法挖掘、探讨MCI 的临床应用潜力。

1 材料和方法

1.1 MCI 的准备

鱼I 型胶原购于上海生工（鱼鳞I 型胶原蛋白，A602898），2～8℃保存。MCI 在无菌条件下溶于1640 细胞培养液中，配置成10 mg/ml 储存液，用于后续实验。

1.2 细胞培养

单核细胞采用人急性单核细胞白血病细胞系THP-1，美国标准生物品收藏中心。THP-1 用含10%胎牛血清（Gibco，美国）、10%青-链霉素的RPMI-1640 培养基（上海源培，中国）在37℃，5%CO2细胞培养箱中悬浮培养。巨噬细胞诱导：THP-1 细胞在50ng/ml 的佛波酯（PMA，Sigma，美国）过夜培养诱导成M0 巨噬细胞，稳定培养24 h 后，用于后续实验。

1.3 细胞活性实验

细胞活性检测采用Cell Counting Kit-8（CCK8）法。将3,000 个THP-1 细胞接种于96 孔板中，诱导成M0 巨噬细胞稳定后，分为对照组和实验组（MCI 1 mg/ml;3 mg/ml;5 mg/ml），每组6 个复孔。继续培养24 h 后，向每孔加入10μl CCK8 试剂（碧云天，中国），孵育2 h 后检测并比较各孔450 nm处的吸光度。

1.4 单核/巨噬细胞细胞趋化实验

单核细胞/巨噬细胞趋化能力检测采用Transwell 实验（5 μm 孔径，Millipore,美国）。将20,000 个THP-1 细胞接种于上室，下室给予不同干预，检测单核细胞的趋化能力，分为阴性对照组、阳性对照组（MCP-1，PeproTech，美国）和实验组（MCI 1 mg/ml;3 mg/ml），每组重复6 次。将20,000 个THP-1 细胞接种于上室，诱导成M0巨噬细胞稳定后，下室给予不同干预，检测巨噬细胞的趋化能力，分为阴性对照组、阳性对照组（MCP-1，50 ng/ml）和实验组（MCI 1 mg/ml;3 mg/ml），每组重复6 次。

1.5 免疫荧光染色

M0 巨噬细胞诱导稳定后，给予不同干预，分为阴性对照组，阳性对照组（LPS+IFNγ）和实验组（MCI 1 mg/ml;3 mg/ml）。作用24 h后，细胞固定，透膜，细胞骨架染色（Cytoskeleton,美国），细胞核DAPI（碧云天，中国）复染。荧光显微镜（Leica,德国）下观察并拍照。

1.6 RT-qPCR 实验

M0 巨噬细胞刺激24 h 后，加入1 ml TRIzol，按试剂盒步骤要求（TaKaRa，日本）提取mRNA，并逆转cDNA，-20℃保存。目的基因TNFα，IL-1β，IL-6，CXCL13 和MMP9 表达量检测按说明书（TaKaRa，日本）要求采用SYBR Green 染料法，内参选用GAPDH，采用2-△△Ct法分析数据并比较。

1.7 转录组测序及分析

M0 巨噬细胞经MCI 刺激后提取总RNA，采用DNBSEQ 平台进行转录组测序（华大基因，武汉），每个样本重复3 次。原始数据经过滤后，使用HISAT and Bowtie2 软件，参考人类基因组hg38（版本号:GCF_000001405.38_GRCh38.p13）进行数据分析。使用R 语言包定义Q 值≤0.001，差异倍数＞1.5，KEGG 分析并比较差异基因（differentially expressed genes，DEGs）。

1.8 统计学分析

本研究统计学分析采用SPSS 20.0 软件（SPSS,美国），数据用均值±标准差表示。两组间的差异比较采用Student-t检验，P＜0.05 表示两组间差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 MCI 对巨噬细胞活性的影响

24 h 时发现，与正常对照组相比，各实验组均不会显著影响M0 巨噬细胞的活性（图1a）。48 h时发现，1 mg/ml 和3 mg/ml 不会显著影响M0 巨噬细胞的活性；5 mg/ml 组，与正常对照组相比M0 巨噬细胞活性显著降低（图1b）。

图1 MCI 对巨噬细胞活性的影响

2.2 MCI 对单核/巨噬细胞趋化功能的影响

对照观察发现，1 mg/ml 和3 mg/ml 浓度下，MCI 不会明显提高单核细胞或巨噬细胞的趋化能力（图2）。

图2 MCI 对单核/巨噬细胞趋化功能的影响

2.3 MCI 对巨噬细胞炎症表型的影响

形态学观察发现，1 mg/ml 和3 mg/ml MCI 不会引起M0 巨噬细胞向M1 型巨噬细胞变化（图3a）。通过检测M1 型巨噬细胞标志分子的表达，进一步明确该浓度下MCI 不会引起M0 巨噬细胞TNFα，IL-1β 和IL-6 表达水平的显著提高（图3b）。

图3 MCI 对巨噬细胞炎症表型的影响

2.4 MCI 对巨噬细胞生物学功能的影响

转录组测序结果提示，与对照组相比，MCI 作用下M0 巨噬细胞表达显著上调的DEGs 有3375 个，下调的DEGs 有3167 个（图4a-b）。KEGG 分析结果提示，上调的DEGs 与细胞因子-细胞因子受体互作，类风湿性关节炎和趋化因子信号通路最为密切相关（图4c）。结合文献检索，在上调的DEGs中筛选出表达差异最为显著的候选基因CXCL13（图4d）。进一步体外验证证实，MCI 可以促进M0 巨噬细胞CXCL13 表达水平的显著提高（图4e）。

图4 MCI 对巨噬细胞生物学功能的影响

3 讨论

海洋生物种类繁多，海洋类原料资源丰富；随着对海洋类生物材料的探索和研究，海洋类材料在医疗领域的应用价值也得到不断地认可[5]。本研究以鱼鳞I 型胶原和巨噬细胞为研究对象，采用一系列实验评估、探讨MCI 的临床应用潜力。本研究发现，MCI 在1 mg/ml 和3 mg/ml 工作浓度下，在体外不会对巨噬细胞的细胞活性，单核/巨噬细胞的趋化功能及巨噬细胞炎性表型产生显著影响。进一步转录组测序及验证发现，MCI 可以显著提高巨噬细胞CXCL13 的表达。

巨噬细胞是固有免疫系统的重要组成部分，也是体内最先响应生物材料刺激的直接细胞[4]。本研究首先证实，MCI 在1 mg/ml 和3 mg/ml 工作浓度下不会影响巨噬细胞正常的活性状态，一定程度上可以反映MCI 临床应用的生物安全性。本研究通过观察发现MCI 不会显著影响单核/巨噬细胞趋化功能及对巨噬细胞炎性表型，亦是评估生物材料免疫原性的重要实验。基于以上结果，可以推测MCI 用于临床具有一定生物安全性。既往研究报道，小牛来源的I 型胶原可以诱导巨噬细胞表达COX-2，诱导局部炎症反应[6]。亦有研究表明，陆生I 型胶原可促进肿瘤相关巨噬细胞向M1 型极化[7]。本研究证实，MCI 不参与调控巨噬细胞趋化功能和炎性表型，提示其临床转化应用方向需要进一步探讨。

海洋胶原蛋白的结构和功能与陆生动物来源的胶原蛋白存在一定程度的差异，这些差异极有可能导致两者临床应用及转化的范围不同[3]。本研究遂采用转录组测序的方法进一步探讨MCI 对巨噬细胞生物学功能的影响，发现MCI 可以显著促进巨噬细胞表达趋化因子CXCL13。大量研究证实，CXCL13 参与成骨微环境调控，尤其在调控间充质干细胞归巢和分化过程中发挥重要作用[8,9]。此外，CXCL13 可调控骨关节炎患者局部成骨细胞分泌I型胶原蛋白，促进骨组织缺损修复[10]。基于以上发现，本研究推测MCI 可能会在需要调控成骨的临床实践中具有应用价值。