白蜡花粉最佳离体萌发培养基筛选

刘 蓉,吴德军,王因花,任 飞,李 丽,燕丽萍,周晓锋

(1.山东省林业科学研究院,山东省林木遗传改良重点实验室,山东 济南 250014;2.中国农业大学烟台研究院,山东 烟台 264670)

白蜡属(Fraxinus)植物具有耐寒、耐旱、耐涝、耐盐碱,对土壤要求不严,生长速度快、树龄长、生长繁殖比较容易、适应性较强、树木材质好等优点,被广泛应用于防护林和城市绿化中[1],是重要的园林绿化树种。白蜡属植物雌雄异株,风媒传粉,混栽时极易天然授粉杂交[2],种子变异性大,影响景观效果。杂交育种可以对白蜡(Fraxinuschinensis)的优良性状进行有目的的杂交组合,并且不需要繁杂的去雄等工作,因此可作为培育白蜡优良树种的重要手段之一。花粉活力的研究对植物后续的授粉受精具有重要的意义。白蜡单花花粉产量不高,适用于花枝采集法采集花粉,将花枝剪下后水培,花朵自然散粉后再进行收集[3]。收集后的花粉需要进行活力检测,通常分为萌发测定和非萌发测定[4];与后者相比,前者简单快速、应用范围广、结果更可靠[5],分固体培养基法和液体培养基法两种。体外花粉萌发和花粉管生长的研究是鉴定环境因素和基因型差异对花粉活力的影响的有效方式[6]。不同的植物适用的方法不同,如百合 (Lilium)花粉表面有一层油状物质,使用固体培养基法难以操作且培养时间长,因此刘向东等[7]选择了采用固体培养基法测定花粉活力,而屈海泳等[8]在检测桃(Prunuspersica)花粉活性试验中发现,桃花花粉活力不适宜采用液体培养基法测定。采用花粉离体测定法最重要的是培养基的成分以及培养的适宜条件,研究表明蔗糖可以为花粉的萌发提供碳源,硼酸可以促进蔗糖的吸收和代谢,在一定浓度范围内可以促进花粉萌发和花粉管生长;钙离子调控花粉管的生长[9],外部施加钙离子含量的高低取决于花粉自身钙离子的含量,过多会抑制花粉管的生长[10],在适宜的培养基上,能够准确地分析花粉萌发及花粉管生长情况[11]。2007年,宛文鹏[12]通过研究初步得到了比较适宜水曲柳(Fraxinusmandshurica)花粉萌发的培养基,李淑娟[13]在此基础上,采用基于BBD的响应面法优化了水曲柳花粉离体萌发的培养基,但并没有深入探讨不同培养基中花粉萌发率及花粉管伸长的情况。Kremer等[14]研究了不同培养温度下美国红梣(Fraxinuspennsylvanica)的变种‘Marshall’的花粉萌发率和花粉管生长状况,得出适宜的温度应该是高于20 ℃,但萌发率不高,均低于20%。然而,目前对于白蜡属其他种的花粉离体萌发培养条件以及不同物理状态的培养基下白蜡花粉的萌发情况鲜有研究。

美国红梣‘鲁蜡5号’(Fraxinuspennsylvanica‘Lula 5’)为白蜡雄株,是山东省林业科学研究院(山东林科院)从山东省栽培的红梣中选育出的优良无性系,具有普通白蜡的一切优点,同时在生长速度、出苗周期及观赏价值方面是普通白蜡的2～3倍[15];绒毛白蜡‘金箭’(F.velutina‘Jinjian’)为白蜡雄株,是由山东林科院从收集的绒毛白蜡种质资源中选育的白蜡新品种,具有速生、树形优美、耐盐碱性强等观赏价值和经济价值高的优良特性,二者均具备特异性、一致性和稳定性,树干通直挺拔,分枝角度小,生长量大,是速生白蜡的优化树种,可用作城市园林绿化和荒山造林。为此,本研究采用绒毛白蜡‘金箭’和美国红梣‘鲁蜡5号’的花粉进行离体萌发测定,研究其适宜的培养条件,旨在为白蜡的杂交育种提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验地位于山东省济南市山东林科院苗圃中试基地(117.094 27°E,36.726 22°N),海拔26 m,年均气温在 14.3 ℃左右,无霜期 178 d;年均降水量 665.7 mm,降雨多集中在 6—8 月,占全年降雨量的 65%以上。

1.2 试验材料

2020年 3 月选取生长健壮、发育良好的绒毛白蜡‘金箭’和美国红梣‘鲁蜡5号’做采粉树,于开花前 1～2 d,选取花质均一、花期一致的花蕾套袋并挂牌标记,防止花粉污染。在雄树盛花期前,将花枝剪下,室内20～25 ℃下水培,散粉后收集花粉,从8:00—16:00每2 h随机采集2～5个花枝的花粉,连续3 d对同一花枝采集花粉,直至花朵萎蔫,分别收集花粉放入离心管中,贴上标签备用。

1.3 试验方法

1.3.1 固体和液体培养基法测定花粉活力

将花粉均匀撒布在固体培养基(琼脂质量浓度为5 g/L)和液体培养基上,将培养皿置于25 ℃的恒温培养箱中,培养2.5 h后观察花粉萌发情况,统计萌发率,培养基配方见表1。

表1 培养基配方表

观察时突出的花粉管长度大于宽度即视为萌发,取3个视野的平均值作为该培养皿的花粉萌发率及花粉管长度,每个视野花粉数不少于100粒,每个样品设置3次重复。花粉萌发率为已萌发的花粉数占花粉总数之百分比。

1.3.2 花粉离体培养时间和花粉管长度测量

采用固体培养基法进行离体培养,培养基成分为蔗糖 150 g/L+ 硼酸 20 mg/L+ 氯化钙 30 mg/L,在 25 ℃ 条件下,在恒温培养箱中分别培养 0.5、1.5、2.5、3.5、4.5、5.5 h 后检测花粉萌发及花粉管生长情况,每个视野花粉数不少于100粒,重复 3 次。随机选择20个花粉管,用显微镜观测(操作软件中自带标尺)测量花粉管长度。

1.3.3 3因素3水平L9(34)正交试验设计

分别将3种浓度的蔗糖、硼酸、氯化钙按照正交试验设计法添加于琼脂粉浓度为5 g/L的固体培养基中,测定白蜡花粉活力,因素及水平见表2。

表2 正交试验设计因素和水平

1.4 数据统计及处理

试验数据均用Excel 2010进行处理,绘制图表,用IBM SPSS Statistics 21进行差异显著性分析及Duncan多重比较,数据用平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 固体与液体培养基法测定花粉活力对比

试验采用固体培养基和液体培养基分别测定‘金箭’‘鲁蜡5号’花粉的萌发情况见图1。由图1可知,从培养基类型来说,‘金箭’和‘鲁蜡5号’的花粉均在02号固体培养基上萌发率最高,固体培养基上‘金箭’的花粉萌发率均显著高于液体培养基,02和03号固体培养基上的‘鲁蜡5号’的花粉萌发率显著高于液体培养基,01和04号固液培养基无显著差异。从品种来说,01号固体培养基上的 ‘鲁蜡5号’的花粉萌发率比‘金箭’高16.03百分点,02、03、04号固体培养基上的‘金箭’和‘鲁蜡5号’的花粉萌发率均比较小,01、02、03、04号液体培养基上的 ‘鲁蜡5号’的花粉萌发率分别比‘金箭’高25.63、11.42、15.66、19.53百分点。

不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下同。Different lowercase letters indicate significant differences (P<0.05). The same below.

‘金箭’和‘鲁蜡5号’花粉的萌发情况见图2、图3。

A.固体培养基solid medium;B.液体培养基liquid medium。数字为培养基编号Number is medium No.。下同。The same below.

图3 固体培养基法与液体培养基法测定‘鲁蜡5号’花粉活力Fig.3 Pollen vitality of ‘Lula 5’ was on solid and liquid medium

由图2、图3可知,固体培养基上较难均匀散播花粉,花粉易堆积,影响后续观察,但花粉萌发率比液体培养基高;液体培养基上的花粉分布均匀,易于统计观察,但花粉萌发率较低。综上,‘金箭’‘鲁蜡5号’的花粉萌发率均为固体培养基优于液体培养基,花粉萌发率以02号培养基最高,其中‘金箭’在02号固体培养基上的花粉萌发率比液体培养基的高21.86%,‘鲁蜡5号’在02号固体培养基上的花粉萌发率比液体培养基的高12.15%,测定白蜡花粉活力仍是固体培养基更佳。

2.2 花粉离体培养时间和花粉管长度测量

通过对白蜡花粉的萌发以及花粉管的生长情况(图4、图5)观察可以看出,‘金箭’和‘鲁蜡5号’花粉的萌发率随培养时间的变化趋势相同,均为快速上升后趋于稳定,其中‘金箭’的花粉萌发率在0.5～1.5 h和1.5～2.5 h内均显著上升,随后保持稳定;‘鲁蜡5号’的花粉萌发率在0.5～1.5 h内显著上升后保持稳定,可知‘鲁蜡5号’花粉萌发的速度比‘金箭’快。‘金箭’和‘鲁蜡5号’的花粉管长度在0.5～5.5 h内持续增加,‘金箭’在0.5～1.5 h和1.5～2.5 h内增加幅度较大,‘鲁蜡5号’在0.5～1.5 h内增加幅度较大,‘鲁蜡5号’初期增长的速度高于‘金箭’,但随着培养时间的延长,‘金箭’的花粉管长度逐渐大于‘鲁蜡5号’。综上,培养2.5 h左右的花粉适宜进行花粉生活力的观察和计数;1.5 h后的花粉管长且弯曲,不利于测量统计,因此试验选择在0.5 h时观察并测量花粉管长度。

图4 离体培养时间对‘金箭’和‘鲁蜡5号’花粉萌发及花粉管伸长的影响Fig.4 Effects of germination time in vitro on pollen germination and pollen tube length of Jinjian’ and ‘Lula 5’

图5 ‘金箭’和‘鲁蜡5号’花粉的萌发及花粉管生长随培养时间的变化情况Fig.5 Changes of pollen germination and pollen tube growth with germination time of ‘Jinjian’ and ‘Lula 5’

2.3 花粉活力测定3因素正交试验

将培养基成分蔗糖、硼酸及氯化钙3个影响白蜡花粉萌发特性的因素,按照L9(34)正交设计进行试验,结果见表3—表6。

表3 正交L9(34)试验对 ‘金箭’花粉萌发率及花粉管长度的影响

表4 3个因素的不同水平对‘金箭’花粉生长情况的影响

表5 正交L9(34)试验对‘鲁蜡5号’花粉萌发率及花粉管长度的影响

表6 3个因素的不同水平对‘鲁蜡5号’花粉生长情况的影响

由表3可知,对于‘金箭’来说,4号培养基的萌发率最高,为60.86%,显著高于除6号和9号以外的其余培养基;2号的萌发率最低,仅有11.29%,显著低于除1号、3号外的其余培养基。从花粉管长度来看,4号培养基的长度为197.49 μm,显著高于其余培养基, 8号的长度最短,为95.66 μm。由表4可知,不同浓度的蔗糖对‘金箭’花粉萌发率的影响显著,最佳的浓度为150 g/L,其次是200 g/L,二者之间差异不显著;而不同浓度的硼酸和氯化钙对花粉离体萌发率影响较小,硼酸的最优浓度为20 mg/L,氯化钙的最优浓度为30 mg/L;不同水平的蔗糖、硼酸、氯化钙对花粉管生长的影响均不显著。对表中数据进行方差分析(表4),由Ⅲ型平方和比较可知,对‘金箭’花粉萌发率的影响从大到小依次为:蔗糖>硼酸>氯化钙,最优水平组合为A2B1C2,即150 g/L蔗糖+ 20 mg/L硼酸+30 mg/L氯化钙;其次是A3B3C2。对‘金箭’花粉管伸长的影响氯化钙>蔗糖>硼酸,最优水平组合为A2B1C2,即150 g/L蔗糖+20 mg/L硼酸+30 mg/L氯化钙,由此推论3个因子最佳组合为4号培养基150 g/L蔗糖+20 mg/L硼酸+30 mg/L氯化钙。

对于‘鲁蜡5号’来说,4号培养基的萌发率最高,为69.12%,显著高于除9号外的其余培养基;8号的萌发率最低,为21.6%,显著低于除2号外的其余培养基。从花粉管长度来看,4号培养基的长度最长为221.25 μm,显著高于2号、5号、7号、8号,与其余培养基无显著差异;8号的长度最短为118.88 μm,显著低于4号培养基。综合来看,4号培养基的花粉生长情况最佳,其次为9号,8号的花粉生长情况最差。由表6可知,不同浓度的硼酸对‘鲁蜡5号’花粉萌发率的影响显著,最佳的浓度为40 mg/L,其次是20 mg/L,二者之间差异不显著。而不同浓度的蔗糖和氯化钙对花粉离体萌发率影响较小,蔗糖的最优浓度为150 g/L,氯化钙的最优浓度为30 mg/L。不同水平的蔗糖、硼酸、氯化钙对花粉管生长的影响均不显著。由Ⅲ型平方和比较可得,对‘鲁蜡5号’花粉萌发率的影响从大到小依次为:硼酸>蔗糖>氯化钙,最优水平组合为A2B3C2,即蔗糖150 g/L、硼酸40 mg/L、氯化钙30 mg/L。对花粉管伸长的影响蔗糖>氯化钙>硼酸,最优水平组合为A2B1C2,与组合A2B3C2之间差异不显著。因此,就‘鲁蜡5号’花粉萌发而言,3个因素的最优组合是A2B3C2,即150 g/L蔗糖+40 mg/L硼酸+30 mg/L氯化钙,其次是4号培养基150 g/L蔗糖+20 mg/L硼酸+30 mg/L氯化钙。

3 讨 论

1)培养基不同的物理状态对花粉的生长与萌发有影响,试验结果得出白蜡花粉在固体培养基上的萌发和生长均优于液体培养基,与屈海泳等[8]对桃(Prunuspersica)花粉萌发得出的结论一致,出现这种现象的原因可能有两方面,一是由于花粉萌发需要一定的空气,液体培养基完全使花粉与外界隔离,花粉得不到充足的空气影响其发育,导致花粉萌发率降低;二是花粉的密度不合适,屈海泳等[8]表示培养基中花粉密度越大萌发率越低,而武冲等[16]的研究发现液体培养基培养花粉时密度至少要达到10 000粒/mL,两种截然不同的结论还有待后续进行研究分析。前人研究表明,采用适宜配方的液体培养基测定茅苍术(Atractylodeslancea)花粉活力,萌发率能够达到62.1%[17];林开勤等[10]使用液体培养基法测定浙江红山茶(Camelliachekiangoleosa)花粉的活力高达88.36%,说明对于部分植物,使用液体培养基法测定花粉活力是可行的,并且本试验中使用02号液体培养基测定‘鲁蜡5号’的花粉萌发率也达到了39.6%,显著高于液体培养基的其他处理。因此综合来看,液体培养法具有方便、快捷、易操作,花粉分布比较均匀,便于统计计算[18]等优点,但很多试验表明,液体培养基中花粉的萌发率较低,且培养时间过长可能会出现花粉管破裂的现象[19],仅适合部分植物,而固体培养基法更适宜大部分植物的花粉进行萌发,花粉散布不均匀、易堆积等问题可以通过改进实验操作方法来解决,比解决液体培养基法存在的问题更容易。

2)花粉能否正常萌发和花粉管能否正常伸长直接影响植物的受精作用。‘金箭’和‘鲁蜡5号’的花粉在0.5 h后均出现萌发迹象且花粉管长度相近,在培养时间内,花粉管长度随着培养时间的延长在不断增加,2.5 h后萌发率均能达到最高,且花粉管生长速度也趋于平缓,萌发速度比辽宁杨(Populus×liaoningensis)、日本海棠(Malus×floribunda)和大叶相思(Acaciaauriculiformis)等花粉快[20-22],比钟花樱(Prunuscampanulata)稍慢[23],萌发速度相较于其他树种偏快。相关性分析表明‘金箭’的花粉萌发率与花粉管长度存在显著正相关,而‘鲁蜡5号’的花粉萌发率和花粉管长度无相关关系,研究时应区别对待。

3)目前许多研究表明,在离体培养条件下,适宜浓度的蔗糖、硼和钙能有效提高花粉的萌发率,对花粉管的伸长具有明显的促进作用[24]。本试验表明3个影响因素中蔗糖对‘金箭’花粉萌发有显著影响,与李淑娟[13]得出的蔗糖对绒毛白蜡花粉萌发至关重要的结论一致,对‘鲁蜡5号’花粉萌发有显著影响的是硼酸,氯化钙均无显著影响,与Luo等[25]的研究一致。适合白蜡最优的花粉离体培养最优蔗糖浓度为150 g/L,高于或低于此浓度萌发率均会有所降低,与茶树[10]、浙江红山茶[10]、桂樱(Prunuslaurocerasus)[26]等所需的蔗糖浓度一致,说明150 g/L的蔗糖浓度对于大多数种类植物的花粉离体萌发较为合适。适宜‘金箭’和‘鲁蜡5号’花粉萌发的硼酸浓度略有差异,但浓度为20和40 mg/L时二者均有较高的萌发率,适宜白蜡花粉萌发的氯化钙浓度为30 mg/L,高于或低于此浓度均会抑制花粉的萌发。李淑娟[13]等研究发现适宜绒毛白蜡花粉离体萌发的培养基为150 g/L蔗糖+40 mg/L硼酸+30 mg/L氯化钙,本研究表明适宜白蜡花粉萌发的蔗糖浓度为150 g/L,硼酸浓度为20 mg/L或40 mg/L,氯化钙浓度为30 mg/L,试验结果相近。

4 结 论

相比于液体培养基法,白蜡属植物更适合采用固体培养基法测定其花粉活力,但如果能解决花粉在液体培养基中的透气性问题,以及探索出适宜的花粉密度,那么液体培养基法一定是更加简单快速测定白蜡花粉活力的方法。观察白蜡花粉生长情况时发现,白蜡花粉的最适离体培养基为4号150 g/L蔗糖+20 mg/L硼酸+30 mg/L氯化钙,花粉的萌发速度较快,0.5～1.5 h的培养时间为快速萌发阶段,培养2.5 h后即可以统计花粉的萌发情况,但白蜡属不同种的花粉萌发率与花粉管长度的相关性有差异。