广西百香果茎基腐病病菌生物学特性及抑菌药剂筛选

2023-05-29黄艳花覃连红崔忠吉黄远光欧善生蒙成

安徽农业科学 2023年9期

黄艳花覃连红崔忠吉黄远光欧善生蒙成

摘要对引起百香果茎基腐病的病原菌腐皮镰刀菌进行生物学特性研究，并开展室内高效低毒化学药剂筛选。选取经鉴定的主要代表菌株，采用实验室常规法研究该病原菌的生物学特性，并用菌丝生长速率法对14种杀菌剂进行抑制作用测定。结果表明，病菌生长适宜温度24～30 ℃，产孢适宜温度28～32 ℃，孢子萌发适宜温度 20～30 ℃，菌丝生长适宜pH为5～11，产孢适宜pH为3～10，孢子萌发适宜pH为5～9。连续光照对菌丝生长有明显的抑制作用，全黑暗及半光半暗有利于菌丝生长，光照条件对产孢量无显著影响。菌丝生长及产孢的最适碳源为葡萄糖，其次为麦芽糖，最适氮源为牛肉膏，其次为酵母粉和蛋白胨；最适培养基是Czapek，其次为PDA。通过室内试验筛选出抑制效果较好的杀菌剂6种，经毒力测定表明，咪鲜胺450 g/L水乳剂和多菌灵50%可湿性粉剂对病菌抑制作用最强，EC50 分别为 0.078、1.189 μg/mL；其次是75%肟菌戊唑醇水分散粒剂和40%腈菌唑悬浮剂，EC50分别为6.887和13.092。该研究结果可为百香果茎基腐病防控提供理论依据。

关键词百香果；茎基腐病；腐皮镰刀菌；生物学特性；杀菌剂；毒力测定

中图分类号 S432.1 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2023）09-0127-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.09.032

Abstract The biological characteristics of fusarium purefaciens， which caused the stalk rot of passion fruit， were studied， and the high efficiency and low toxicity chemicals were screened in laboratory.The biological characteristics of the pathogen were studied by conventional laboratory method， and the inhibition of 14 fungicides was measured by mycelial growth rate method.The results showed that the optimum temperature for pathogen growth， sporulation and conidial germination were 24-30 ℃， 28-32 ℃， 20-30 ℃， 5-11 for growth， 3-10 for sporulation and 5-9 for conidial germination. Continuous light had a significant inhibitory effect on mycelium growth， while total darkness and semidarkness were beneficial to mycelium growth， while light had no significant effect on sporulation. The optimal carbon source for mycelia growth and sporulation was glucose， followed by maltose， and the optimal nitrogen source was beef extract， yeast powder and peptone. Czapek was the most suitable medium， followed by PDA. Six fungicides with good inhibitory effect were screened out through laboratory experiments. The virulence test showed that the water emulsion of promethean 450 g/L and carbendazim 50% wettable powder had the strongest inhibitory effect on bacteria， with EC50 values of 0.078 and 1.189 μg/mL， respectively. The EC50 values of 75% oximebacterium tebuzolol and 40% nitrilazole suspension were 6.887 and 13.092， respectively.The study can provide theoretical basis for the control of passion fruit stem rot.

Key words Passion fruit;Stem rot;Fusarium rot;Biological characteristics;Fungicide;Toxicity measurement

基金项目广西农业科技自筹经费项目（Z202006）；国家现代农业产业技术体系广西特色水果创新团队建设项目（nycytxgxcxtd-17-03）。

作者简介黄艳花（1974—），女，广西都安人，高级实验师，从事植物保护研究。

百香果学名西番莲，是西番莲科（Passifloraceae）西番莲属（Passiflora Linn）的热带多年生常绿藤本植物，原产南美洲巴西至阿根廷一带和澳大利亚，现广泛分布于热带和亚热带地区［1］。百香果果实营养丰富，富含多种维生素、矿物质和游离氨基酸，其中100 g鲜果中Vc 含量高达34.6 mg［2］。我国于1913年由菲律宾引进种植百香果，主要栽培地区包括海南、福建、广东、广西、云南、贵州、台湾；由于百香果种植周期短、产生效益快，部分地区选择其作为扶贫产业进行开发；近年来，广西百香果各主要产区发展迅猛，截至2019年全国百香果种植面积约3万hm2，广西种植面积超过2万hm2［3-4］。随着百香果种植规模的不断扩大，茎基腐病逐年蔓延，该病是目前危害百香果种植的主要病害之一，造成大面积植株快速死亡，严重制约了百香果产业的发展［5］。李德福等［6］、宋曉兵等［7］研究表明，引起西番莲茎基腐病的病原菌腐皮镰孢菌（Fusarium solani），幼苗期和成株期均可受害，主要危害部位为离地面 5～10 cm 的植株茎基部。染病初期在百香果茎基部出现深褐色病斑，皮层稍凹陷腐烂，腐烂初期是硬质，后软化为海绵状皮层组织，最后，皮层脱落裸露出茎和主根的木质部。当茎基部病斑横向扩展环绕茎秆时，上部的枝蔓和叶片先出现黄化、凋萎，当病斑向下扩展至根部时，整株枯死。潮湿气候条件下，腐烂部位常先产生白色的菌丝体，然后产生红色子囊壳［6，8-9］。目前，在中国知网查询未见对百香果茎基腐病病原腐皮镰刀菌生物学特性及药效筛选研究。笔者在对广西百香果茎基腐病病原腐皮镰刀菌分离鉴定的基础上，进一步开展该病原菌生物学特性及防治药剂筛选研究，以期为该病发生规律研究及防控措施制定提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

百香果茎基腐病病原腐皮镰刀菌（Fusarium solan），采集于广西上林县毛塘百香果种植基地感染茎基腐病的植株，按常规组织分离获得纯培养，经单孢纯化，依据柯赫氏法则测定其致病性，参考宋晓兵等［7］的方法采用形态特征和分子系统学鉴定后，保存至 PCA 斜面培养基，选择性状优良的75XIN5A菌株作为供试菌株，移入PDA培养基［10］平板上培养（28 ℃）7 d 后供测试用。

1.2 供试杀菌剂

68%精甲霜·锰锌水分散粒剂（一帆生物科技集团有限公司）、3%甲霜·恶霉灵水剂（广西田园生物股份有限公司）、46％氢氧化铜水分散粒剂（澳大利亚纽发姆有限公司）、70%甲基硫菌灵可湿性粉剂（江苏龙灯化学有限公司）、80%代森锰锌可湿性粉剂（广西田园生物股份有限公司）、75%肟菌·戊唑醇水分散粒剂（山东荣邦化工有限公司）、25%丙环唑乳油（招远三联化工厂有限公司）、50%嘧菌酯水分散粒剂（先正达）、43％氟菌·肟菌酯悬浮剂（拜耳）、75%百菌清可湿性粉剂（山东大成生物化工有限公司）、50%多菌灵可湿性粉剂（四川润尔科技有限公司）、40%腈菌唑悬浮剂（一凡生物科技集团有限公司）、10%苯醚甲环唑水分散粒剂（先正达南通作物保护有限公）、450 g/L咪鲜胺水乳剂（上海沪联生物药业（夏邑）股份有限公司）。

1.3 病原菌生物学特性

1.3.1 温度对病原菌菌丝生长、产孢及孢子萌发的影响。

用打孔器在PDA平板上培养7 d的菌落边缘打取直径5 mm菌饼，将菌饼接种于PDA培养基中央，分别置于4、8、12、16、20、24、28、30、32、36、40 ℃下的恒温培养箱中培养。7 d后用十字交叉法测量菌落直径，10 d后用血球计数板计算产孢量，用灭菌水制成孢子悬浮液（浓度为5.00×106个/mL），采用琼胶平板表面萌发法［10］镜检分生孢子在上述不同温度下的萌发率（方法下同）。

1.3.2 pH对病原菌菌丝生长、产孢及孢子萌发的影响。

用盐酸及氢氧化钠将PDA培养基pH调配成3、4、5、6、 7、8、9、10、11共9个梯度，置于28 ℃培养，7 d后采用十字交叉法测量菌落直径，10 d后用血球计数板计算产孢量，用无菌水配制孢子悬浮液，pH调成上述梯度，置28 ℃ 恒温培养8 h按“1.3.1”方法分别统计萌发率。

1.3.3 光照对病原菌菌丝生长及产孢量的影响。

光照试验设24 h黑暗、12 h黑暗+12 h光照（设1 500、2 000、3 000 lx共3种不同光照强度梯度）、24 h光照（光照强度为3 000 lx）［11］，在3种不同光照方式下于28 ℃恒温培养，7 d后采用十字交叉法测量菌落直径，10 d后用血球计数板计算产孢量。

1.3.4 碳源对病原菌菌丝生长及产孢量的影响。

用等质量葡萄糖、D-果糖、乳糖、山梨醇、甘油、麦芽糖、甘露醇、木糖醇、D-木糖、淀粉10种氮源分别置换Czapek培养基［10］中的蔗糖，配制成不同碳源培养基，设无氮碳源的培养基作为对照。将病原菌分别接种于上述培养基上，每处理4个重复，28 ℃恒温培养，7 d后采用十字交叉法测量菌落直径，10 d后观察记录菌落形态特征，用血球计数板计算产孢量。

1.3.5 氮源对病原菌菌丝生长及产孢量的影响。

用等质量酵母粉、精氨酸、牛肉膏、甘氨酸、赖氨酸、蛋白胨、丙氨酸、尿素8种碳源分别代替Czapek培养基［10］中的硝酸钠，配制不同氮源培养基，设无氮源的培养基作为对照，其余同“1.3.4”。

1.3.6 培养基对病原菌菌丝生长及产孢量的影响。

制备6种培养基。WA（水琼脂培养基）：琼脂15 g，补足水至1 000 mL；Czapek（查氏培养基）：硝酸钠3 g，磷酸氢二钾1 g，硫酸镁0.5 g，氯化钾0.5 g，硫酸铁0.01 g，蔗糖30 g，琼脂20 g，水1 000 mL；汁液培养基：健康新鲜百香果枝叶200 g，水熬煮30 min，琼脂20 g，水1 000 mL；PDA（马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g、水1 000 mL）；CMA（玉米粉琼脂培养基）：玉米粉30 g，琼脂20 g，水1 000 mL；OA（燕麦培养基）：燕麦片30 g，琼脂20 g，水1 000 mL。6种培养基pH自然，其余同“1.3.4”。

1.4 防治药剂室内筛选

1.4.1 有效防治药剂的初步筛选。

采用菌丝生长速率测定法。将各供试药剂用无菌蒸馏水配成所需浓度的10倍液，分别取10 mL加入已装有90 mL灭菌并降温至 50 ℃左右PDA培养基的三角瓶中，混匀，倒入直径9 cm培养皿中，每皿15 mL，冷却凝固备用。在平板中央接种直径5 mm的菌饼，以不加药剂的PDA培养基为对照，每个处理4个重复，28 ℃下培养7 d后测量菌落直径，计算各药剂对菌丝体生长的相对抑制率［12］。

菌落直径＝测定菌落直径-菌饼直径（0.5 cm）

相对抑制率＝（对照菌落直徑-处理菌落直径）/对照菌落直径×100％

1.4.2 有效杀菌剂毒力测定。

选用由“1.4.1”筛选出的对百香果茎基腐病病原腐皮镰刀菌相对抑制率达85％以上的杀菌剂为供试药剂，按5个梯度配制成不同浓度，按“1.4.1”的方法进行试验及计算相对抑制率。以浓度的对应数值为自变量x，以菌丝体抑制百分率的概率值为因变量y，计算出毒力回归方程和相关系数R，根据回归方程计算出EC50和EC90［12］。

2 结果与分析

2.1 病原菌生物学特性

2.1.1 温度对病原菌菌丝生长、产孢及孢子萌发的影响。

从表1可以看出，病菌在12～32 ℃都能生长，24～30 ℃适合菌丝生长，28 ℃为最适温度，菌落直径极显著高于其他温度处理，8和36 ℃几乎不生长，4和40 ℃不可生长；4与40 ℃不产孢，28～32 ℃ 较适合产孢，30 ℃最适产孢，产孢量极显著高于其他温度处理；低于8 ℃孢子不能萌发，20～30 ℃适合孢子萌发，24～28 ℃萌发率基本上显著高于其他温度处理，36 ℃孢子萌发率降低。表明百香果茎基腐病病原腐皮镰刀菌菌丝生长、产孢、孢子萌发适宜温度为28～30 ℃。

2.1.2 pH对病原菌菌丝生长、产孢及孢子萌发的影响。

由表2可知，百香果茎基腐病病原腐皮镰刀菌菌丝在 pH 3～11 时均能生长，pH 5～11适宜生长，其中pH 9生长最好；pH 3～11时均能产孢，pH 3～10产孢量高，各处理间无显著差异；孢子在pH 3～11时均能萌发，萌发率较高的pH 为5～9，处理间无显著差异。表明百香果茎基腐病病原腐皮镰刀菌菌丝生长、产孢、孢子萌发适宜pH为5～9。

2.1.3 光照对病原菌菌丝生长及产孢量的影响。

菌丝生长对光照要求不严格，5种光照处理均能生长。完全黑暗及半光半暗对菌丝生长有利，光照对菌丝生长有一定抑制作用，连续光照与其他处理差异显著，半光半暗不同光照强度对菌丝生长有一定的影响，但处理间无显著差异。连续光照对产孢有一定的抑制作用，但与其他处理无显著差异（表3）。综上所述，连续光照对百香果茎基腐病病原腐皮镰刀菌菌丝生长有明显的抑制作用，全黑暗及半光半暗有利菌丝生长，光照条件对产孢量无显著影响。

2.1.4 碳源对病原菌菌丝生长及产孢量的影响。

由表4可知，百香果茎基腐病病原腐皮镰刀菌在供试的10种碳源上均能生长，菌落生长大小存在一定的差异，该菌在含麦芽糖、葡萄糖的培养基上生长最好，培养7 d 的菌落直径均达7.5 cm以上，菌丝生长茂密；在山梨醇、甘露醇、木糖培养基上生长较好，菌落直径均达 7.0 cm 以上，菌丝生长茂密；在含果糖、甘油、淀粉培养基上菌落直径均低于6.9 cm，但菌丝生长茂密；在含木糖醇（Φ=7.50 cm）、乳糖（Φ=6.74 cm）和无糖（Φ=6.80 cm）培养基上菌落直径虽然不小，但菌丝生长稀疏。百香果茎基腐病病原腐皮镰刀菌在葡萄糖碳源培养基上产孢量最多，为 83.69×106个/皿；其次为甘油、麦芽糖、木糖醇、木糖碳源培养基，产孢量为48.06×106～51.22×106个/皿；在无碳源培养基上的产孢量最少，为 1.64×106个/皿；在其余碳源培养基上的产孢量为9.21×106～24.96×106个/皿。综上所述，最适合百香果茎基腐病病原腐皮镰刀菌菌丝生长的碳源培养基是麦芽糖、葡萄糖，最适合产孢的碳源培养基为葡萄糖。

2.1.5 氮源对病原菌菌丝生长及产孢量的影响。

由表5可知，百香果茎基腐病病原腐皮镰刀菌在供试的8种氮源上均能生长，菌落生长大小存在一定差异，该病菌在含牛肉膏的培养基上生长最好，培养7 d 的菌落直径均达7.13 cm，菌丝生长茂密；在精氨酸、蛋白胨、尿素、酵母粉培养基上生长较好，菌落直径均大于6.0 cm，菌丝生长茂密；在含甘氨酸、赖氨酸、丙氨酸培养基上菌落直径均低于4.8 cm，但菌丝生长茂密；在无糖培养基上菌落直径（Φ=5.81 cm）雖然不小，但菌丝生长稀疏。百香果茎基腐病病原腐皮镰刀菌在甘氨酸氮源培养基上的产孢量最多，为 138.13×106 个/皿，其次为酵母粉、牛肉膏、蛋白胨氮源培养基，产孢量为36.35×106～52.51×106 个/皿，在无氮源培养基上的产孢量最少，为 1.27×106个/皿，在其余碳源培养基上的产孢量为12.84×106～28.03×106个/皿。综上所述，最适合百香果茎基腐病病原腐皮镰刀菌菌丝生长及产孢的氮源培养基是牛肉膏，其次为酵母粉和蛋白胨，甘氨酸利于产孢但不利于菌丝生长。

2.1.6 培养基对病原菌菌丝生长及产孢量的影响。

由表6可知，百香果茎基腐病病原腐皮镰刀菌在6种培养基上均能较好生长，培养7 d后菌落直径均在5.9 cm以上；其中在 PDA和Czapek上生长较好，菌落直径均在7.50 cm 以上，气生菌丝茂盛、菌落致密；其次为百香果汁液和WA培养基，菌落直径均达6.58 cm，菌落圆形稀疏、薄；该菌菌丝在OA 和CMA培养基上生长较差，分别为6.08和5.93 cm。百香果茎基腐病病原腐皮镰刀菌在Czapek培养基上产孢量最多，为 83.69×106个/皿，其次为PDA培养基，产孢量为30.54×106个/皿，在其余4种培养基上产孢量为2.17×106～8.77×106个/皿。综上所述，最适合百香果茎基腐病病原腐皮镰刀菌菌丝生长及产孢的培养基是Czapek，其次为PDA。

2.2 防治药剂室内筛选

2.2.1 有效防治药剂的初步筛选。

按“1.4.1”所述方法，测定了14种参试药剂对百香果茎基腐病病原腐皮镰刀菌菌丝体生长的抑制作用，结果见表7。由表7可知，参试的14种杀菌剂中450 g/L咪鲜胺、75%肟菌戊唑醇、50%多菌灵、40%腈菌唑、25%丙环唑、70%甲基硫菌灵6种对百香果茎基腐病病原腐皮镰刀菌菌丝体表现出较强的抑制作用，相对抑制率达85％以上。而46%氢氧化铜在所设置的浓度下，对茎基腐病菌菌丝的抑制作用最差，相对抑制率在10％以下。其他杀菌剂对百香果茎基腐病病原腐皮镰刀菌的生长虽表现出一定的抑制作用，但效果均低于450 g/L咪鲜胺等6种药剂。

2.2.2 有效杀菌剂毒力测定。

将上述试验筛选出的6种药剂，按梯度配制成5个不同浓度，测定其对百香果茎基腐病病原腐皮镰刀菌的毒力，结果见表8。由表8可知，6种杀菌剂中450 g/L咪鲜胺水乳剂和50%多菌灵可湿性粉剂抑制效果最好，EC50和EC90分别为 0.078、1.189和1.778、24.378 μg/mL；其次是75%肟菌戊唑醇水分散粒剂和40%腈菌唑悬浮剂，EC50分别为6.887和13.092 μg/mL、EC90分别为132.130和264.850 μg/mL；25%丙环唑乳油和70%甲基硫菌灵可湿性粉剂抑制效果最差，EC50和EC90分别为41.399、65.917和 7 516.228、1 071.519 μg/mL。

3 结论与讨论

腐皮镰刀菌（Fusarium solani）又名茄病镰刀菌。对采集于广西上林县百香果茎基腐病病原腐皮镰刀菌生物学特性研究表明，该病菌生长适宜温度24～30 ℃，产孢适宜温度28～ 32 ℃，孢子萌发适宜温度 20～ 30 ℃，菌丝生长适宜pH 5～11，产孢适宜pH 3～10，孢子萌发适宜pH 5～9，这与李万苍等［13］研究的苜蓿根腐病菌（Fusarium solani）和刘丽云等［14］研究的辣椒根腐病菌生物学特性的合适温度及pH基本一致。连续光照对菌丝生长有明显的抑制作用，全黑暗及半光半暗有利于菌丝生长，光照条件对产孢量无显著影响；田凤鸣等［15］认为光照对Fusarium solani菌落生长无明显影响，朱孟烽等［16］认为完全光照有利于腐皮镰孢（Fusarium solani）病原菌生长。最适病原菌丝生长及产孢的碳源为葡萄糖，其次为麦芽糖，最适氮源为牛肉膏，其次为酵母粉和蛋白胨，最适的培养基是Czapek，其次为PDA；罗敦文等［17］研究认为腐皮镰刀菌（Fusarium solani）最佳碳源为葡萄糖，最佳氮源为硝酸铵，最佳培养基为菠萝蜜幼果煎汁培养基；韩凤英等［18］研究认为Fusarium solani适宜碳源依次为淀粉、麦芽糖，适宜氮源依次为蛋白胨、牛肉膏、硝酸钾。光照条件、碳氮源、培养基研究结果与部分前人研究结果稍有差异，可能是病原菌分离环境、寄主及供试材料等原因引起。

该研究测定了14种参试药剂对百香果茎基腐病病原腐皮镰刀菌菌丝体生长的抑制作用，筛选出了抑制率达85%以上的杀菌剂6种，并将筛选出的6种药剂进行毒力测定，结果表明，咪鲜胺450 g/L水乳剂和多菌灵50%可湿性粉剂对病菌抑制作用最强，EC50和EC90分别为 0.078、1.189和1.778、24.378 μg/mL；其次是75%肟菌戊唑醇水分散粒剂和40%腈菌唑悬浮剂，EC50分别为6.887和13.092 μg/mL，EC90分别为132.130和264.850 μg/mL；25%丙环唑乳油和70%甲基硫菌灵可湿性粉剂抑制效果最差，EC50和EC90分别为41.399、65.917和 7 516.228、1 071.519 μg/mL。该研究结果对百香果茎基腐病病原腐皮镰刀菌（Fusarium solani）抑制效果最好的药剂为咪鲜胺、多菌灵，其次是肟菌戊唑醇和腈菌唑。该研究结果为今后百香果茎基腐病防控提供一定的理论依据。

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