耐盐碱促生菌S4的鉴定及其提高水稻耐盐碱作用研究

齐玉玺 张琇 杨国平 季鸿飞 沈婷婷 吴凯华

关键词：人参地微杆菌；菌株鉴定；耐盐碱；促生作用；水稻

土壤盐渍化是一个全球性问题，由于受到人类活动与自然环境破坏的影响，盐碱地面积仍有增大趋势。土壤盐渍化抑制植物的光合作用、影响相关酶活性及代谢途径使作物减产。虽然现有盐碱地改良措施如水利、物理、化学等方法发挥了较好的作用，但因改良成本高、易反复等问题使得盐碱地利用率不高。许多研究表明，植物根际促生菌（plant growth promoting thizobacte-ria， PGPR）可依靠解磷、解钾、产铁载体、产IAA等促生功能，提高植物在逆境胁迫下的生存能力；PGPR还可通过提高清除活性氧（ROS）相关酶活性，减少有害物质积累，促进植物在逆境条件下的生长。PGPR已成为用于改良盐碱地方法的研究热点之一，因此探索微生物提高作物抗盐碱能力，对于促进盐碱地的开发利用具有重要意义。

水稻（Oryza sativa L．）作为世界一半人口的主食，同时也是重要的工业原料，稻壳、稻秆等部分还可作为饲料。随着土壤盐渍化愈加严重，土地资源紧缺，越来越多的水稻开始种植于盐碱地，但是产量和品质明显降低。王华笑等研究发现接种解淀粉芽孢杆菌YM6菌株（Bacillus arnyloliquefaciens YM6）可以提高盐胁迫下玉米抗氧化酶活性及脯氨酸（Pro）含量，降低氧化物质量分数：李丽艳等研究发现弯曲芽孢杆菌（BacilLus flexus）可以提高盐胁迫下燕麦抗氧化酶活性及Pro含量，降低氧化物质量分数。目前关于促生菌促进盐碱条件下水稻生长的报道相对较少。

本研究以课题组前期筛选得到的能促进盐碱胁迫下水稻生长的S4菌为研究对象，对菌株进行鉴定，探究S4菌对盐碱胁迫下水稻生理指标及根和叶的超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）、丙二醛（MDA）、脯氨酸（Pro）、可溶性糖（SS）和可溶性蛋白（SP）等抗逆相关酶活性及渗透调节物质的影响，以期为促生菌促进盐碱地水稻生长的机理提供理论参考。

1材料与方法

1.1试验材料

1.1.1生物材料

试验于2022年2-6月于北方民族大学生物科学与工程学院宁夏特殊生境微生物资源开发与利用重点实验室进行。S4菌保藏在宁夏特殊生境微生物资源开发与利用重点实验室。水稻品种为宁粳51号。

1.1.2培养基及植物营养液TSA培养基、无机磷培养基、有机磷培养基、CAS培养基、R2A培养基、硅酸盐培养基、Ashby培养基，购自青岛海博生物技术有限公司。

淀粉水解培养基：可溶性淀粉2g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠5g/L和琼脂16g/L。

甲基红培养基：蛋白胨5g/L、葡萄糖5g/L和氯化钠5g/L。

水琼脂培养基：8g/L琼脂。

1.1.3植物营养液配置

母液A：六水合氯化钴0.004g、硼酸2.86g、四水合氯化锰1.81g、七水合硫酸锌0.22g、五水合硫酸铜0.102g、二水合钼酸纳0.122g溶于1L蒸馏水；母液B：七水合硫酸镁49.296g溶于IL蒸馏水；母液C：磷酸氢二钾174.18g、磷酸二氢钾136.886g溶于1L蒸馏水；母液D：二水合氯化钙110.99g溶于1L蒸馏水；母液E：三水合柠檬酸铁5g溶于1L蒸馏水。1L蒸馏水中加入上述5种母液各1mL、硫酸铵0.66g，可得常规植物营养液。盐碱胁迫植物营养液在常规植物营养液基础上加入氯化钠11.7g，并用16g/L碳酸钠溶液调至pH=8.5。

1.1.4试验仪器LHS-130L-3三温区恒温恒湿箱；TGL-20M高速冷冻离心机；UV-1000天美紫外可见分光光度计；JLRX-800B-FB植物培养箱。

1.2试验方法

1.2.1S4菌分离纯化与形态特征观察将用25%甘油保存在超低温冰箱的S4菌接种于TSA培养基，28℃恒温恒湿箱中培养2d，观察菌落形状、颜色、大小、质地、边缘结构、隆起程度等特性。对S4菌进行革兰氏染色，显微镜油镜下（放大倍数10x100）对S4菌颜色及形状、大小进行观察。

1.2.2S4菌生理生化与促生性能测定共9项：

（1）生理生化指标测定：用青岛海博生物技术有限公司的细菌微量鉴定管进行相关鉴定。

（2）解钾能力测定：将S4菌接种于硅酸盐培养基中，28℃恒温恒湿箱中培养12～36h，观察菌落形状，呈现油滴状则具有解钾能力，否则不具备解钾能力。

（3）解有机磷能力测定：将S4菌接种到有机磷培养基中．37℃恒温恒湿箱中培养2d，观察有机磷培养基变化。如菌落周围变为透明，则说明有解有机磷能力，否则无此能力。

（4）解无机磷能力测定：将S4菌接种到无机磷培养基中，37℃恒温恒湿箱中培养2d，观察培养基变化。菌落周围变透明，说明有溶无机磷能力，否则无溶无机磷能力。

（5）解淀粉能力测定：将S4菌接种到淀粉水解培养基上，38℃恒温恒湿箱中培养1d。在S4菌附近加入碘液，观察菌落附近是否变透明，透明则说明S4菌有解淀粉能力，否则无此能力。

（6）甲基红试验：将S4菌接种到甲基红培养基中，36℃、200r/min振荡培养24h，培养结束后，添加甲基红试剂。培养基变红为阳性，变黄为阴性。

（7）分泌IAA能力测定：将S4菌接种到R，A培养基（添加L-色氨酸）中，280C、150 r/min振蕩培养48h。吸取100L菌液到白瓷板，以100LIAA标准液（50mg/L）作空白对照，加入等量Salkowski比色液，随后将白瓷板放人25℃无光培养箱30min，取出后对颜色进行判别，如果为红色说明S4菌可以产IAA，否则无此能力。

（8）分泌铁载体能力测定：将S4菌接种于CAS培养基中，37℃恒温恒湿箱中培养72h后观察培养基变化。如果S4菌附近为黄色，说明可以分泌铁载体，否则无此能力。

（9）固氮能力测定：将S4菌接种于Ashby培养基中，37℃恒温恒湿箱中培养72h后观察是否出现菌落，有菌落出现则具有固氮能力，否则无此能力。

1.2.3S4菌16S rRNA测序S4菌16SrRNA序列测定由北京睿博兴科生物技术有限公司完成，将测序序列通过NCBI网站完成BLAST分析，并利用MEGA6构建系统发育进化树。

1.2.4S4菌抗盐碱能力测定将S4菌分别接种于不同NaCl浓度梯度（0、1%、2%、3%、4%．5%、6%、7%、8%）的TSA培养基中与用HCI、NaOH调节为不同pH梯度（4、5、6、7、8、9、10、11）的TSA培养基中．37℃恒温恒湿箱中培养48h后观察S4菌生长状况，测定其耐盐与耐碱能力。

1.2.5水稻水培试验及其抗逆指标测定试验共设置4个处理。空白对照组（CKO）：无S4菌浸种，常规植物营养液；盐碱对照组（CK1）：无S4菌浸种，盐碱胁迫植物营养液；CKO+S4菌组：S4菌浸种，常规植物营养液；CKl+S4菌组：S4菌浸种，盐碱胁迫植物营养液（S4菌浸种方法为lx108cfu/mL菌悬液浸种）。将水稻种子在55℃水浴锅中浸种15min，用酒精去除表面张力10s，0.1%升汞表面消毒30s，无菌水清洗6次，消毒完成后对种子进行不同处理。将不同处理种子摆放于水琼脂培养基进行暗处理，待其发芽后移到灭菌的480mL塑料瓶（塑料瓶中有300g石子、60mL不同处理的植物营养液）中，放人植物光照培养箱（湿度35%，设置6个时段，即时段1：时间4h、温度25℃、光照10000lx;时段2：时间3h、温度20℃、光照5000lx;时段3：时间8h、温度18℃．光照01x;时段4：时间2h、温度20℃、光照50001x;时段5：时间3h、温度25℃、光照9000lx;时段6：时间4h、温度28℃、光照13000lx）培养14d后用尺子测量不同处理下水稻根长、株高。将样品液氮保存后存放于-80℃超低温冰箱，根和叶的抗逆指标使用苏州科铭生物技术有限公司的试剂盒进行测定。

1.3数据处理与分析

使用Microsoft Excel 2019和SPSS 2017进行数据处理和显著性差异分析，使用GraphPadPrism 8做图。

2结果与分析

2.1S4菌菌落形态特征

S4菌在TSA培养基上的菌落呈乳白色，切面隆起，表面光滑，边缘完整或波纹状，不透明，粘稠度较高，易挑起（图1A）。显微镜油镜下（放大倍数10x100）观测到染色结果为紫色，形状为杆状，判定为杆状的革兰氏阳性菌（图IB）。

2.2S4菌生理生化特性与促生能力

S4菌生理生化试验结果见表1。葡萄糖、乳糖、阿拉伯糖、棉子糖、半乳糖、山梨醇、卫矛醇半固体、水杨苷在糖醇类发酵试验中测定结果为阳性（颜色变为黄色）；蔗糖、麦芽糖、鼠李糖、D-纤维二糖测定结果为阴性（颜色未变为黄色）。硫化氢生化管无黑色生成，ONPG为无色，VP试验为黄色，鸟氨酸、赖氨酸脱羧酶测定结果为阴性（黄色），色氨酸也为阴性（无色）。

促生能力测定结果表明，淀粉水解能力的测定结果呈阴性，培养基未变透明：解钾能力测定结果呈阳性：S4菌产IAA，加入比色液避光处理后呈现红色；有机磷、无机磷培养基上S4菌周围出现透明，呈阳性：CAS培养基上，S4菌周围有黄褐色产生，呈阳性，有产铁载体能力；Ashby培养基上无菌落出现，不具有固氮能力：甲基红试验结果为亮黄色，呈阴性。综上，S4菌具备解磷、解钾、产IAA、产铁载体能力，属于典型的PGPR，有助于植物生長，改变周围土壤环境。

2.3S4菌的分子生物学鉴定

将序列信息输入NCBI数据库进行BLAST分析，选取6株与S4菌相似程度超过98%的模式菌株，用MEGA 6完成S4菌的系统发育树构建。由图2可知，S4菌与人参地微杆菌（Microbacteri-um gznsengiterrae）聚为一支，结合形态特征，确定S4菌为M. ginsengiterrae。

2.4S4菌抗盐碱能力

S4菌在0～7% NaCl浓度的TSA平板上可以生长，NaCl浓度超过50%时长势减弱，浓度为7%时菌落生长状况较差，需借助光源观察菌落，浓度超过7%时不能生长（图3）；S4菌在pH为4—10的平板上可以生长，但在pH=10的平板上长势较弱，pH=11时S4菌不能生长（图4）。

2.5S4茵对水稻耐盐碱的促生作用

14 d时水稻生长情况见图5。与CKO相比，CKO+S4组根长提高1.1%，无显著性差异（P>0.05）；CKI+S4组根长较CKI显著提高163.0%（P<0.05），说明在盐碱胁迫下S4菌浸种对根长有显著促进作用。与CKO相比，CKO+S4组株高提高10.8%，无显著性差异（P>0.05）；CK1+S4组株高较CK1显著提高66.1%（ P<0.05），说明在盐碱胁迫下S4菌浸种对水稻株高有显著促进作用。

SOD、POD、CAT都是重要的抗氧化酶，可以使H202分解，降低ROS对植物的毒害作用。由图6可知，与CKO相比，CK1、CK1+S4水稻地上部分与地下部分的抗氧化酶活性均显著升高（P<0.05）；CKO+S4相较于CKO的水稻抗氧化酶活性除SOD在地下部分有显著提升外（P<0.05），其余抗氧化酶活性无论是地上部分还是地下部分均无显著变化（P>0.05）；与CK1相比，CK1+S4地下部分的SOD、CAT、POD分别显著提高23.1%、16.9%、15.6%，地上部分分别显著提高36.7%、8.1%、13.6%。

通过脯氨酸（Pro）含量可以判断盐碱胁迫对水稻的伤害程度以及对盐碱胁迫的抵抗能力，可溶性糖（SS）和可溶性蛋白（SP）均起着稳定植物细胞渗透压的作用，反映植物受到盐碱胁迫的程度。本试验SP含量以Cpr（样本蛋白浓度）表现，S4菌对水稻Pro、SS、SP的影响结果如图7所示。与CKO相比，CK1地下、地上部分Pro、SS、SP含量均显著提高（P<0.05）；CKO+S4相较于CKO，水稻地上部分Pro含量显著升高（P<0.05），地下部分SS含量显著下降（P<0.05），其余含量均无明显变化（P>0.05）；CK1+S4相较于CK1，水稻地下、地上部分Pro含量显著升高33.3%、36.5%，地下部分SS、SP含量显著降低55.9%、19.2%，地上部分SS、SP含量显著降低22.9%、18.5%。

MDA作为最终过氧化产物之一，它的积累会导致细胞膜损伤、植物衰老，是反映植物抗逆能力的重要指标。CK1相较于CKO，地下、地上部分的MDA含量显著增加（P<0.05）；CKO与CKO+S4的MDA含量无显著差异（P>0.05）；CK1+S4相较于CK1，水稻地下、地上部分MDA含量显著降低55.5%、46.2%（P<0.05）.

3讨论与结论

本试验将水稻耐盐碱促生菌S4鉴定为人参地微杆菌，并对S4菌生理生化特性、促生能力及在盐碱下的水稻生长状况进行测定。结果表明，S4菌拥有解有机磷、解无机磷、解钾、分泌铁载体和IAA的促生性能，并可在重度盐碱环境下生长，是拥有多种促生功能的耐盐碱PGPR菌株。大部分促生菌促生功能较为单一并且在盐碱条件下停止生长，目前對人参地微杆菌可以同时提高植物耐盐与耐碱能力菌株的研究鲜有报道，大部分菌株只具有提高植物耐盐能力。

盐碱胁迫造成植物体内活性氧过量与MDA积累，为了减少这些伤害，植物会产生SOD、CAT、POD等抗氧化酶来清除过量的活性氧，积累SS、SP和Pro等有关调节渗透压的物质维持细胞水势正常。大量研究发现，接种PGPR可以减少盐胁迫对植物的危害，促进植物生长发育。本试验结果表明，盐碱胁迫下接种S4菌的水稻相较于未接菌的水稻，地上、地下部分的SOD、POD、CAT活性及Pro含量显著提高，MDA含量显著降低，可溶性糖和可溶性蛋白含量与无盐碱胁迫时的水平相近，说明S4菌浸种后提高了植株的抗盐碱能力，降低了盐碱胁迫对水稻产生的危害。这与刘鹏等的研究结果（NaCl胁迫下添加耐盐菌株可提高水稻幼苗根长、株高以及SOD、POD、CAT活性，降低MDA含量）和袁东关于植物促生菌对盐胁迫下水稻生长影响的研究结果一致。

本试验结果表明，人参地微杆菌S4是可以在重度盐碱环境下（NaCl质量分数7%、pH=10）生长繁殖，是具有解有机磷、解无机磷、解钾、分泌铁载体、产IAA的PGPR。S4菌可以促进盐碱胁迫下水稻的生长，提高水稻根长、株高以及地上部分和地下部分的抗氧化酶活性以及Pro含量，降低MDA含量，减少盐碱胁迫下对水稻带来的危害，使SS、SP含量向无盐碱胁迫时的水平趋近，提高水稻耐盐碱能力。本研究初步揭示了S4菌株促生机理，可为采用微生物方法提高盐碱地作物产量提供理论依据。