重金属铅胁迫下EDTA对狗牙根抗氧化酶及土壤磷、铅形态的影响

姜冉冉 江润海 朱城强 侯秀丽

关键词：狗牙根；乙二胺四乙酸（EDTA）；抗氧化酶系统；植物铅富集；土壤磷、铅形态

随着社会经济的发展，土壤重金属污染已成为全球关注的生态环境问题之一，在工业密集区域、重金属矿开采区域重金属污染加重。因重金属在土壤中具有不易降解和持久性的特点，会对生物圈构成前所未有的威胁。其中铅（Pb）是一种有毒重金属，对动物、植物和微生物的危害较大。目前重金属污染土壤的植物修复技术主要分为植物提取、植物固定、植物挥发和根际过滤。植物修复技术具有成本低、绿色安全、对原生环境破坏小且兼具环境美学等特点。近年来，草坪草在土壤重金属修复工作中发挥了重要的成效，从国内外研究现状来看，草坪植物的修复作用越发引人关注。如国内外广泛栽培的多花黑麦草对锌、镉和铅都有明显的富集效果，马蹄金和白三叶在草坪绿化中运用较多，不仅抗病、抗污染能力较强，同时对土壤重金属铅具有一定的富集能力。陈明君等认为狗牙根能够明显降低江水中的铜、铅和锌含量。但植物修复技术因受到多重环境污染和植物特性不同的影响，在具体实践中具有一定的局限性。因此可利用螯合剂一植物联合修复技术，螯合剂能促进土壤中重金属的溶解，改变重金属在土壤中的存在形态，形成水溶性螯合物，提高重金属的生物有效性，增加重金属在植物地上部的积累，螯合剂一植物修复作为一种经济环保的修复技术，具有良好的应用前景。

乙二胺四乙酸（EDTA）螯合剂因去除重金属效率较高而被广泛应用于土壤重金属污染修复。有研究表明EDTA能增强植物对铅的吸收，可诱导重金属从矿物质中解吸，并促进土壤中重金属铅从根向地上部的转移。在印度芥菜中发现螯合物辅助茎的铅积累量增加100～200倍，而在豌豆和玉米中重金属积累有多倍的增加。Kirkham指出当向日葵生长在受污水污泥污染的土壤中时，地上部铅含量显著增加。螯合剂不仅促进铅的吸收和转运，而且保护植物免受重金属暴露产生的氧化应激。而施加EDTA是否能提高狗牙根对重金属耐性的机制研究目前尚未见报道。因此本试验探究了重金属铅胁迫下施加不同浓度EDTA对狗牙根生理特性、铅的吸收转运及根际土壤磷、铅形态的变化机制，以期为重金属铅污染土壤的修复以及植被恢复或绿地规划提供理论依据。

1材料与方法

1.1试验材料及设计

试验于2021年8月在昆明学院温室大棚进行。采用盆栽试验，设置0（CK）、2.5、5、7.5、10mmol/L共5个EDTA浓度处理，每处理重复3次。

根据云南省兰坪县铅锌矿区土地利用类型中的开采矿区铅含量范围106.4～738.74mg/kg，设置土壤铅污染浓度。供试土壤为云南省昆明市红土与腐殖土，1：1混合备用称为原土：原土添加重金属铅（PbC03）500mg/kg充分混匀，螯合2个月，模拟铅污染土壤称为铅螯合土壤。原土与铅螯合土壤基本理化性质如表1所示。塑料盆规格为25cm（直径）×17cm（高），装土2.5kg（干重），盆下带托盘。供试植物为多年生狗牙根（Cynodon dactylon L），每盆100粒（以保证发芽后每盆大于70株）。温室昼／夜温度为25/15℃，每两天浇一次水，以保持土壤含水率为最大持水量的70%，水不渗出托盘。播种后第30天和第45天直接以溶液形式分别向土壤中施加不同浓度的EDTA，每次施加量为50mL，第60天收获狗牙根。

1.2测定指标及方法

1.2.1植物样品采集及测定于收获期采集狗牙根样品，去除根部大块土壤，置于冰上运输至实验室，用去离子水冲洗，吸水纸吸干表面水分。一部分狗牙根样品用于生理指标的测定，狗牙根叶片、根系的超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）活性及丙二醛（MDA）含量测定均参照南京建成生物工程研究所提供试剂盒进行。另一部分狗牙根样品于70℃条件下杀青，置于烘箱内烘至恒重，取出后将狗牙根地上部和根系样品粉碎，采用混合酸（硝酸：过氧化氢=4：1）消解，过滤定容，用于测定地上部及根系铅含量。

狗牙根对重金属铅的转移能力用转移系数（TF）表示，计算方法为狗牙根地上部铅含量与根部铅含量比值。

1.2.2土壤样品采集及测定取出狗牙根后晃动根部，去除松散的土壤后，使用无菌刷从根部收集残留在其上的土壤。土壤样品经自然风干，去除石砾、有机残体、植物根系等，过0.149mm筛后分别用于测定不同形态磷、铅含量。不同形态磷测定采用张守敬提出的连续提取法，分为Al-P（铝结合态磷酸盐）、Fe-P（铁结合态磷酸盐）、0-P（闭蓄态磷酸盐）、Ca-P（钙结合态磷酸盐），利用不同化学浸提剂的特性，将土壤中各种形态的无机磷酸盐逐级分离，再利用钼锑抗比色法测定。土壤各形态铅含量测定采用中国地质局提出的七步提取法，采用ICP-MS，根据在土壤各相中的分布及其结合特点，一般可将土壤中的铅分为水溶态、离子交换态、碳酸盐结合态、腐殖酸结合态、铁锰氧化态、强有机结合态以及残渣态。前3种铅形态稳定性差，但仅占土壤中铅总量的少部分，后4种铅形态稳定性强占大部分。土壤重金属铅污染主要来源于前3种不稳定形态铅，该形态铅易被植物吸收，归为有效态。

1.3数据处理与分析

试验数据采用Microsoft Excel 2010进行统计整理，SPSS 22.0进行单因素分析（ANOVA-Test）及差异显著性检验，Origin 2018制图。

2结果与分析

2.1不同浓度EDTA对重金属铅胁迫下狗牙根抗氧化酶系统指标的影响

不同浓度EDTA对重金属铅胁迫下狗牙根叶片、根系SOD活性的影响如图1A所示。随着EDTA浓度的增加狗牙根叶片、根系SOD活性呈现先上升后下降的趋势，且叶片>根系，说明叶片受到胁迫后产生的氧化应激反应高于根系。ED-TA施用浓度为5mmol/L时，狗牙根叶片、根系SOD活性最高，分别为173.77、158.65U/mg prot；EDTA浓度为10mmol/L時，狗牙根叶片、根系SOD活性最低，显著低于对照组，分别为116.80、99.94U/mg prot，这可能是由于高浓度EDTA与重金属铅形成的螯合物具有低毒性，降低了狗牙根的氧化应激反应。

由图IB看出，不同浓度EDTA处理的狗牙根叶片POD活性均明显高于根系。与对照相比，各浓度处理叶片POD活性无显著差异：而2.5mmol/L低浓度EDTA处理显著高于10mmol/L高浓度处理。不同浓度EDTA处理的狗牙根根系POD活性均显著高于对照，且以10mmol/L处理最高，为194.33U/g，是对照的1.63倍，表明狗牙根根部受到胁迫时，启动POD清除H207，降低铅诱导的氧化应激，保护膜系统，增强狗牙根对铅的耐受力。

由图1C看出，随EDTA浓度的增加狗牙根CAT活性整体呈现先下降后上升的趋势，EDTA浓度为7.5mmol/L时，狗牙根叶片、根系CAT活性最低，分别为65.25、36.79U/mg prot．分别比对照显著降低49.53%、49.99%，10mmol/L处理下CAT活性又显著升高。不同浓度EDTA处理的狗牙根叶片CAT活性均明显高于根系，可能是由于叶片是光合作用的主要器官，酶活性变化比较敏感。

由图1D看出，重金属铅胁迫下狗牙根叶片与根MDA含量随EDTA浓度的增加先升高后降低，且不同浓度处理均高于对照。2.5mmol/L EDTA处理的叶片MDA含量最高，为68.68 nmol/mg prot，显著高出对照1.28倍，且明显高于根部：EDTA浓度>2.5mmol/L时，各处理狗牙根叶片MDA含量均低于根部。5mmol/L EDTA处理下根部MDA含量最高，为56.07 nmol/mg prot，较对照显著提高1.61倍；其次为10mmol/L处理，是对照的1.95倍。

2.2不同浓度EDTA对重金属铅胁迫下狗牙根根际与非根际土壤磷形态的影响

施加不同浓度EDTA后狗牙根根际及非根际土壤中4种形态无机磷含量的变化如图2所示。可以看出，根际与非根际土壤闭蓄态磷酸盐（0-P）含量最高，磷酸铝（A1-P）含量最低，且根际土壤各形态无机磷含量均高于非根际土壤。施加不同浓度EDTA后，狗牙根根际土壤0-P含量显著低于对照，其中2.5mmol/L处理最低，为441.67mg/kg，较对照降低81.07%：在非根际土壤中，添加EDTA后（除5mmol/L）土壤O-P含量较对照有不同程度的增加，其中2.5mmol/L处理的最高，为600mg/kg，显著高于对照。10mmol/L EDTA处理的狗牙根根际、非根际土壤磷酸钙（Ca-P）含量较对照分别显著降低39.42%、51.24%，但根际土壤中磷酸铁（Fe-P）含量较高，为158.36mg/kg，显著高于对照，是对照的1.92倍，说明添加EDTA有利于重金属铅胁迫下狗牙根根际土壤Fe-P含量的增加。

2.3不同浓度EDTA对狗牙根铅含量、转移系数及根际土壤铅形态的影响

由表2看出，与对照相比，施加EDTA后狗牙根地上部、根部对铅的富集明显增加，并且随ED-TA浓度的增加铅富集量明显升高。施加10mmol/L EDTA后狗牙根地上部和根部铅含量分别达到19.36mg/kg和17.75mg/kg，分别为对照的8.84倍和1.91倍。EDTA的添加提高了狗牙根对铅的转移系数，且随浓度的增加而升高，其中以10mmol/L处理的转移系数最大，为1.19，是对照的4.96倍，这说明高浓度EDTA促进了重金属铅由根部向地上部的转运。

不同浓度EDTA处理后狗牙根根际土壤中不同形态铅含量的变化如图3所示。可以看出，狗牙根根际土壤中铁锰氧化态铅含量最高，其次为残渣态铅、腐殖酸结合态铅和强有机结合态铅，有效态铅含量最低。随EDTA浓度的增加，狗牙根根际土壤有效态铅含量也增加，并以10mmol/L处理的有效态铅含量最高，为92.83mg/kg，与对照差异显著，为对照的1.84倍；根际土壤中铁锰氧化态铅含量随EDTA浓度的增加显著下降，且以7.5mmol/L处理最低，为183.88mg/kg；10mmol/L处理的残渣态铅、腐殖酸结合态铅、强有机结合态铅含量分别为45.26、65.27、13.67mg/kg，均显著低于对照。说明施用EDTA能够有效促进土壤铁锰氧化态铅、残渣态铅、腐殖酸结合态铅和强有机结合态铅向有效态铅转化，增加了土壤中有效态铅含量，进而提高土壤中可供植物吸收的重金属铅含量。

3讨论

3.1重金属Pb胁迫下施加EDTA对狗牙根抗氧化酶系统的影响

抗氧化酶系统及MDA在植物适应逆境过程中发挥重要作用。重金属铅胁迫下，狗牙根叶片SOD、POD、CAT活性及MDA含量总体上高于根系，可能是叶片是光合作用的主要器官，酶活性变化比较敏感。SOD在消除超氧化物自由基、减轻脂质过氧化作用和膜伤害方面发挥重要作用。在铅污染土壤中施加不同浓度EDTA，狗牙根SOD活性先升高后下降，说明适宜浓度的EDTA对铅胁迫下的狗牙根伤害起到缓解作用，使狗牙根适应胁迫环境的能力得到提高。一般认为，逆境胁迫下SOD活性会有所增加。也有研究表明SOD作为一种诱导酶，在重金属铅胁迫下植物体内02含量的增加能诱导其活性上升，SOD活性提高是02含量增加的应急解毒措施，是植物细胞免受毒害的调节反应。但高浓度EDTA处理下SOD活性下降，可能是由于EDTA与重金属铅螯合后，降低了细胞内的重金属浓度或使其处于非活性状态。POD广泛存在于植物体各組织器官中，对过氧化物起清除作用，抑制其对膜脂的过氧化作用，避免膜损伤和破坏。本研究中，施加EDTA对狗牙根叶片POD活性影响不明显，而显著提高根部POD活性，且以10mmol/L处理最高，为194.33U/g。表明根部受到铅与EDTA胁迫后优先启动POD清除H，02，这与Habiba等的研究结论类似。过氧化氢酶（CAT）是一种包含血红素的四聚体酶，可与SOD协同消除H202，保护细胞膜结构。EDTA浓度为7.5mmol/L时，狗牙根叶片、根系CAT活性最低，分别为65.25、36.79U/mg prot。植物细胞壁是重金属离子进入细胞的第一道屏障，狗牙根作为耐性植物，其耐重金属的原因可能是细胞壁对重金属有沉淀作用，因而降低了重金属进入细胞的浓度，进而减轻对根细胞结构、叶片及其生理功能的伤害。10mmol/L EDTA处理的CAT活性升高，表明施加高浓度EDTA提高了狗牙根的氧化应激。MDA是植物细胞膜脂过氧化作用的最终产物，对细胞膜具有毒害作用。本研究中，随ED-TA浓度的增加MDA含量呈现先上升后下降趋势，高浓度EDTA处理下MDA含量降低，这是因为EDTA与重金属铅螯合形成螯合物，膜脂过氧化程度减轻。一般认为，MDA在植物体内增加的原因有两点：一是与自由基有关，02伤害植物的机理之一在于参与启动膜脂过氧化或膜脂脱脂作用．在H202作用下，通过Habe-weiss生化反应产生攻击力更强的羟基，并启动膜脂过氧化，造成MDA含量增加：二是与活性氧有关，活性氧对许多生物功能分子有破坏作用，如氨基酸、蛋白质、糖类等，最终引起膜脂过氧化作用，导致MDA含量增加。

3.2重金属Pb胁迫下施加EDTA对土壤无机磷的影响

EDTA具有较强螯合作用，施人土壤后对磷素有解吸作用，可降低土壤胶体对磷的固定，同时与磷争夺钙、镁、铁、铝等阳离子和土壤吸附位点，促进难溶性磷的释放与转化从而增加其有效态含量。王晓纯研究指出未起到增加效果的处理可能是土壤中易转化态的养分含量过低，导致EDTA对养分的螯合作用较弱。EDTA施入后促使根际微生物分泌更多的有机酸、磷酸酶及质子等，促进难溶性磷的活化，提高作物的磷素吸收。许多研究表明，向土壤中施入腐殖酸和EDTA可提升土壤磷素的有效性。本试验中，施加EDTA后狗牙根根际、非根际土壤中O-P含量均高于其它形态磷，且根际土壤各形态无机磷含量总体高于非根际土壤。10mmol/L EDTA处理后狗牙根根际、非根际土壤Ca-P含量均最低，而根际土壤中Fe-P较高。这可能是由于EDTA通过螯合作用与磷酸根竞争土壤中的吸附位点以降低磷的吸附，促进磷素释放，同时促进根际土壤Fe-P、O-P等无机磷的活化，进而利于狗牙根对磷的吸收。有研究发现，添加EDTA和低分子量有机酸会增加土壤中的无机磷，这主要来自Ca-P、Al-P、Fe-P等的累积，而对O-P含量影响不大。本研究结果与前人的结论相似，添加螯合剂EDTA总体上增加了根际土壤的无机磷总量，并改变土壤各形态无机磷占无机磷总量的比例。

3.3重金属Pb胁迫下施加EDTA对狗牙根铅含量、转移系数及根际土壤铅形态的影响

施加EDTA后土壤重金属主要以螯合物的形式存在，而在金属螯合物作用下植物根部内皮层的凯氏带易被破坏，原因可能是EDTA具有破坏细胞膜通透性的能力，导致金属螯合物进入根部组织。因此，EDTA的施加可以增加重金属从根到地上部的转移。本试验中EDTA的施加促进了狗牙根根部对重金属铅的吸收及地上部对铅的积累，且随EDTA浓度的增加而升高。螯合剂通过与土壤重金属螯合，提高重金属在土壤溶液中的溶解度，但螯合后的重金属能否被植物吸收一直是个有争议的问题。有研究认为植物的根不能吸收螯合剂及其金属螯合物。而Vassil等通过水培试验发现，铅和EDTA处理的印度芥菜，其地上部能同时积累EDTA和铅，且以Pb-EDTA的形式向上运输，植物体内EDTA与铅的比例为1：0.67，该研究认为Pb-EDTA能够被植物所吸收。本研究中，随EDTA浓度升高，狗牙根地上部和根系对重金属铅的吸收增加。当EDTA施加濃度为10mmol/L时，狗牙根铅含量最高，转移系数最大，为1.19，说明高浓度EDTA促进重金属铅由地下部向地上部转运。

土壤重金属铅以铁猛氧化态为主，而这种形态铅较难被植物吸收利用。螯合剂EDTA能活化土壤中的铅，使其更易被植物吸收或吸附去除，从而降低土壤铅含量。本试验中，有效态铅含量随EDTA浓度的增加总体呈升高趋势，而铁锰氧化态铅呈现下降趋势。强有机结合态铅在有机质分解时被逐渐释放，因此狗牙根对土壤重金属铅的吸收与其形态分布密切相关。当EDTA浓度为10mmol/L时，根际土壤有效态铅含量高于其它形态铅含量（除铁锰氧化态外），说明施用EDTA能够有效促进铅形态的转化，增加植物对铅的吸收利用，这可能是由于施人EDTA后导致土壤溶液中的自由离子减少，打破沉淀溶解平衡，促进其它形态铅向有效态转变，从而形成新的沉淀溶解平衡：也有研究认为EDTA与Pb形成的螯合物亦属于有效态，其原因在于EDTA本身带有6个电子基团，分布在氮原子及羧基上，可以与土壤中重金属离子反应，通过释放土壤颗粒上吸附的重金属离子进而增加土壤中有效态重金属含量。综上所述，狗牙根修复铅污染土壤过程中，EDTA的施用浓度以10mmol/L为宜，促进狗牙根根际土壤铅形态转化的效果较好。

4结论

重金属铅胁迫下施加EDTA可提高狗牙根的氧化应激反应，增强狗牙根在高浓度铅胁迫下的耐受能力。10mmol/L EDTA处理显著降低重金属铅胁迫下狗牙根根际与非根际土壤难溶Ca-P含量，提高根际土壤Fe-P含量：促进根际土壤中铁锰氧化态铅、腐殖酸结合态铅、残渣态铅、强有机结合态铅向有效态铅的转化，提高狗牙根地上部、根部对铅的富集吸收。因此EDTA作为修复重金属铅污染土壤的有效螯合剂．可明显提高狗牙根对铅污染土壤的修复作用。