啟良重楼内生细菌的分离鉴定及其次级代谢产物研究

刘玉 方昕悦 孙慧茹 李伟 李宇 闫加力 罗凯 何美军

关键词：啟良重楼；内生细菌；抑菌作用；抗氧化；次级代谢产物

近年来，对抗生素产生耐受性的致病菌种类不断增加且自由基的异常积累会产生氧化应激反应，导致多种疾病产生，对人类健康造成极大威协。植物内生细菌是生活在健康植物组织内、促进植物体内次生代谢产物合成和积累的微生物。现代药理学研究表明，药用植物内生菌可能产生与宿主相同或相似的次生代谢产物，具有抗菌、抗肿瘤、抗氧化等多种生物活性，是各类抗菌与抗氧化剂的重要来源和具有商业价值的新型生物活性物质。

放良重楼（Paris qiliangianaH．Li，J．Yang&Y．H．Wang）为百合科（Liliaceae）重楼属（Paris）多年生草本植物，是2017年在湖北省竹溪县境内发现并鉴定的重楼新种。研究表明，重楼属植物中含有抗菌、抗氧化、抗肿瘤和预防心血管疾病等活性成分。我国药用植物内生细菌资源丰富，但对于放良重楼内生细菌及其代谢产物的研究尚未见报道。本试验分离和鉴定了药用植物放良重楼内生细菌，评估了其次生代谢产物的抗菌和抗氧化性能，并通过GC-MS分析鉴定了乙酸乙酯提取物的活性成分，以期为今后放良重楼内生菌资源的进一步开发和应用奠定理论基础。

1材料与方法

1.1试验材料与试剂

放良重楼（Paris qiliangiana）健康植株于2020年10月在恩施市新塘县的华中药用植物园采集，由湖北省农业科学院中药材研究所鉴定。

胰蛋白胨、卡那霉素、酵母提取物、琼脂，均购自生工生物工程（上海）股份有限公司。无水乙醇、乙酸乙酯、二甲基亚砜、氯化钠、次氯酸钠溶液，均为国产分析纯。

1.2仪器与设备

HP-5MS石英毛细管柱（30mm×0.25mm×0.25mm），安捷伦科技有限公司；酶标仪（HF4500），北京华安麦科生物技术有限公司；培养箱（CR-80C02），广州市康恒仪器有限公司；冷冻离心机（3K15），德国西格玛公司；旋转蒸发仪（BC-R208），上海贝凯生物化工设备有限公司；电子天平（FA20048），上海佑科仪器仪表有限公司；数控超声波清洗器（Q5200DE），昆山市超声仪器有限公司；气浴恒温振荡器（THZ-B），常州杰博森仪器有限公司；超净工作台（SW-CJ-2FD），上海达平仪器有限公司；真空干燥箱（DZF-6020），上海一恒科学仪器有限公司。

1.3啟良重楼内生细菌的分离纯化

在Li等的方法基础上进行优化。无菌条件下将样品表面消毒，而后在灭菌研钵中加入2mL无菌水輕柔研磨，悬浮液用无菌水稀释成不同浓度，分别涂布在Luria-Bertani（LB）固体培养基上，倒置于37cC培养箱中培养24—48h，挑取单菌落进行分离纯化培养。

1.4啟良重楼内生细菌鉴定

将纯化后的单菌落培养48h，参考《常见细菌系统鉴定手册》进行特征描述。挑取少量菌体制作临时装片，用革兰氏染色法进行初步鉴定。

基于细菌16SrDNA基因序列分析进行分子鉴定。采用CTAB法提取放良重楼内生细菌基因组DNA。以27F（5一GAGTTTGATCACTGGCTCAG -3'）和1492R（5-TACGGCTACCTTGTTACGA-3 7）为引物进行细菌16S rDNA序列扩增，PCR反应体系（25uL）：上、下游引物各1uL，模板DNA1uL，2×Mix （fastpfu）12.5uL，ddH209.5uL。反应程序：94℃预变性4min; 94℃变性1min，55℃退火40s，72℃延伸30s，共35个循环：72℃延伸10min。PCR扩增产物送生工生物工程（上海）股份有限公司测序，使用NCBI（https：//blast. nc-bi.nlm. nih. gov/Blast. cgi）进行BLAST比对，确定菌株种类，运用MEGA-X10.2.2软件（https：／／www. megasoftware. net/）通过邻接法（Neighbour-Joining）构建系统发育树。

1.5放良重楼内生细菌代谢产物获取

将纯化后的各菌株接种到1mLLB液体培养基内，28℃、180r/min振荡培养24h，得到种子液，而后取0.5mL接种到100mLLB液体培养基中，28℃、180r/min振荡培养7d得到菌株发酵液。各菌株发酵液经乙酸乙酯萃取3次，减压冷凝浓缩得到次级代谢产物浓缩物，在真空干燥箱中烘干。

1.6啟良重楼内生细菌代谢产物活性分析

采用滤纸片法测试放良重楼内生细菌对10株供试菌的抑菌活性。10株供试病原细菌由中国科学院热带海洋生物资源与生态重点实验室提供，均经过单孢分离纯化备用（表1）。取20培养至OD值为0.6的供试菌菌液，与20mLLB固体培养基混合均匀倒平板。放良重楼内生细菌浓缩后的次生代谢产物用二甲基亚砜（dime-thyl sulfoxide，DMSO）溶解，取10L分3次滴加于滤纸片（直径为8.00mm）上，将滤纸片置于上述培养基上，另设卡那霉素（25mg/mL）作阳性对照、添加DMSO作阴性对照，37℃培养12h，采用十字交叉法测量抑菌圈直径大小，取3次重复测量的平均值为最终值。

采用微量肉汤稀释法和琼脂培养基平板法测定放良重楼内生细菌代谢产物对供试菌的MIC和MBC值，按美国临床和实验室标准化协会（Clinical and Laboratory Standards Institute CLSI）M07-AIO的标准操作程序进行。抗生素药敏标准：高敏，抑菌圈直径>20mm;中敏，抑菌圈直径10～20mm；轻敏或耐药，抑菌圈直径<10mm。

采用DPPH法测定3株内生细菌的抗氧化活性，以抗坏血酸溶液为对照。将100LDP-PH和100L乙醇混合溶液、100L DPPH溶液和100L不同浓度梯度的放良重楼内生细菌代谢物、100L乙醇和100L不同浓度梯度的放良重楼内生细菌代谢产物分别加入酶标板中，30℃避光孵育30min。在517nm下检测吸光值，计算样品清除DPPH自由基的百分率，公式如下：

1.7啟良重楼内生细菌提取物GC-MS分析

内生细菌发酵液经减压浓缩干燥后，用乙酸乙酯充分溶解，13000r/min离心10min取上清液，0.22m滤膜过滤，取2L滤液进行GC-MS分析，每组3个重复。色谱条件：HP-5MS石英毛细管柱（30mm×0.25 mm×0.25mm）；柱温：起始温度60℃，程序升温3℃/min至280℃，保持40min；柱流量為1.0mL/min；进样口温度250℃；柱前压100kPa;分流比2：1；进样量1.0L；载气为高纯氦气。质谱条件：电离方式E1;电子能量70eV；传输线温度250℃；离子源温度230℃；四极杆温度150℃：质量范围35～500Da;采用NIST11和wiley7n.1标准谱库检索鉴定挥发性成分，采用面积归一化法对各成分进行定量分析。

1.8数据处理与分析

试验数据运用Origin9和GraphPad Prism软件进行统计分析，数据以平均值±标准偏差表示，P<0.05表示具有显著性差异，P<0.01表示具有极显著性差异。

2结果与分析

2.1啟良重楼内生细菌鉴定及进化树构建

从放良重楼根茎中分离纯化鉴定出3株细菌，CLX1为革兰氏阳性，杆状，菌落白色，圆形，不透明，表面光滑且隆起，边缘整齐且光滑；CLX2、CLX3为革兰氏阴性，短杆状。CLX2菌落白色，圆形，不透明，边缘整齐，表面光滑湿润；CLX3菌落白色，圆形，表面光滑、湿润，不透明（图1）。3株内生细菌（CLX1、CLX2、CLX3） 16SrDNA序列的碱基全长分别为1459、1445、1413bp，上传到GenBank中获得的登录号分别为MW321629、MW321628、MW321627。系统发育树如图2所示，结合形态特征与16SrDNA基因鉴定结果，CLX1、CLX2、CLX3菌株分别为巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）、Lelliottia aquatilis、居中克吕沃尔氏菌（Kluyvera intermedia）。

2.2啟良重楼内生细菌提取物活性研究

由图3可知，3株内生细菌具有不同程度的抑菌活性。B．megaterium（CLX1）代谢产物的抑菌圈范围在（10.39+0.24） mm～（13.44+0.10）mm，有中度敏感抑制作用；L．aquatilis（CLX2）代谢产物的抑菌圈范围在（9.52+0.42） mm～（18.20+1.50）mm．对肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、粪链球菌、藤黄微球菌、苏云金芽孢杆菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、多耐铜绿假单胞菌和大肠杆菌有中度敏感抑制作用；kintermedia（CLX3）代谢产物的抑菌圈范围在（9.38+0.42）mm～（16.59+0.41）mm，对肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、粪链球菌、枯草芽孢杆菌、藤黄微球菌、苏云金芽孢杆菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、多耐铜绿假单胞菌和耐甲氧西林表皮葡萄球菌有中度敏感抑制作用。

由表2可知，B．megaterium（CLX1）的代谢产物对粪链球菌、枯草芽孢杆菌、藤黄微球菌、苏云金芽孢杆菌、大肠杆菌的MIC值分别为0.33、2.61、1.31、1.31、2.61mg/mL，MBC值分别为2.61、20.88、10.44、10.44、10.44mg/mL;Laquatilis（CLX2）的代谢产物对肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、粪链球菌、苏云金芽孢杆菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、多耐铜绿假单胞菌、大肠杆菌的MIC值分别为18.55、18.55、18.55、4.64、9.27、9.27、74.18mg/mL，对肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、粪链球菌、多耐铜绿假单胞菌、大肠杆菌的MBC值为74.18mg/mL，对苏云金芽孢杆菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的MBC值为37.09mg/mL；Kintermedia（CLX3）的代谢产物对金黄色葡萄球菌、粪链球菌、枯草芽孢杆菌、藤黄微球菌、苏云金芽孢杆菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、多耐铜绿假单胞菌的MIC值分别是2.53、1.27、2.53、5.06、5.06、5.06、1.27mg/mL，MBC值分别为20.25、10.13、20.25、40.50、40.50、20.25、10.13mg/mL。

总体上看，放良重楼3株内生细菌代谢产物的抑菌谱较广，对于抗卡那霉素的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和粪链球菌都有较好的抑菌效果。

在DPPH自由基清除试验中，ECso值越低代表其抗氧化活性越好。由表3和图4可知，B．megaterium（ CLXl）、L aquatilis（CLX2）、inter-media（CLX3）的乙酸乙酯提取物的浓度与清除效果的线性回归方程分别为v= 1.44x+ 19.01（R2=0.9677）、y=17.94x+27.10（R2= 0.9903）、y=19.35x+22.98（R2= 0.9687），均呈正相关关系，其ECso值分别为21.471、1.276、1.396 mg/mL，抗氧化能力为L

aquatilis（CLX2）>Kintermedia（CLX3）>B.megaterium（CLX1），但都低于阳性对照（ECso值为0.085mg/mL）。

2.3活性成分GC-MS鉴定

3株内生细菌的乙酸乙酯提取物中共检测到53种挥发性成分（表4）。在B．megaterz，um（CLX1）的代谢产物中：酸类7种，烃类5种，酰胺类和含硫化合物各3种，醛类、肽类和酚类各2种，杂环类、酯类、酮类和含氯化合物各1种，其中苯乙酸（16.35%）、六氢-3-（苯基甲基）吡咯并（1，2-A）吡嗪-1，4-二酮（15.91%）和环（脯氨酸一亮氨酸）二肽（15.39%）含量较高。在L．aquatilis（CLX2）的代谢产物中：酯类5种，酸类3种，醇类和酮类各2种，醛类和酚类各1种，其中丙酸乙酯（0.62%）、十六烷酸（0.38%）和2，5一二叔丁基酚（0.31%）含量较高。在Kintennedia（CLX3）的代谢产物中：酯类6种，酸类6种，醇类4种，酚类和腈类各1种，其中2，3-丁二醇（17.83%）、新癸酸环氧乙烷基甲酯（1.22%）和十六烷酸（1.22%）含量较高。L．aquatilis（CLX2）和Kintermedia（CLX3）的代谢产物中检测出的成分较为接近，与B．megaterium（CLX1）的代谢产物检测出的成分相比，成分种类较少且差异较明显。

3讨论与结论

从药用植物中筛选内生细菌用于生产具有药用价值的活性成分，如生物碱、聚酮类、类黄酮和类固醇萜类化合物等，已成为新药开发生物活性化合物的重要来源之一。Chen等从越南槐内生细菌ETR-B22中测定的三硫化二甲酯、吲哚、邻氨基苯甲酸甲酯等挥发性有机化合物表现出广谱抗真菌活性，是ETR-B22菌株抑制各种真菌病原菌的关键化合物：Duan等从丹参内生细菌芽孢杆菌中分离纯化的cyclo-（Ala-4-OH-Pro）和cyclo-Leu-4-OH-Pro）对腐皮镰刀菌和尖孢鐮刀菌抑制效果明显，其MIC值分别为100g/mL和50g/mL。

国内外学者已对药用植物重楼属内生细菌有了一定的研究：程媛媛等从华重楼中分离出一株枯草芽孢杆菌，并从中分离鉴定了对Curvularialunata （Walk.） Boed等真菌和Escherichia coli等细菌有较强抑菌效果的抑菌肽：杨正强等发现华重楼内生细菌芽孢杆菌的发酵液对Phoma as-paragi Sacc、Rape Sclertiniose、Physalospora piricala等13种作物致病菌有较好的抑制效果，但二者都未测定MIC值：宣群等从滇重楼中分离出的内生细菌对金黄色葡萄球菌、伤寒沙门菌、普通变形杆菌、痢疾杆菌、大肠杆菌及白色念珠菌有抑制效果，但是作者未鉴定该内生细菌的种类。本试验分离的芽孢杆菌次生代谢产物对肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、粪链球菌、藤黄微球菌、苏云金芽孢杆菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和多耐铜绿假单胞菌有中度敏感抑制作用，且对抗卡那霉素的粪链球菌有较好的抑菌效果，MIC值为0.33mg/mL，并从中鉴定出二甲基三硫、甲基甲烷硫代磺酸盐、甲基硫代磺酸甲酯、苯甲酸、环（脯氨酸一亮氨酸）二肽和正二十一烷等7种抑菌活性成分；L．aquatilis CLX2的次生代谢产物对DPPH自由基清除能力最强，ECso值为1.276mg/mL，并从中鉴定出2，3-二氢-3，5二羟基-6-甲基一4（H）-吡喃-4-酮和十六烷酸（棕榈酸）两种抗氧化成分，这与李焘分析的滇重楼与七叶一枝花提取物对DPPH自由基清除能力得出的ECso值分别为3.27mg/mL和1.33mg/mL的结果相比，放良重楼内生细菌具有较好的抗氧化性能，在开发抗氧化剂方面有较大潜力，可缓解由氧化损伤引起的健康问题。

啟良重楼内生细菌的次生代谢产物具有良好的抑菌活性和抗氧化性，在制药和医学方面有巨大的开发潜力，为开发利用放良重楼内生细菌资源和筛选活性物质提供了依据。