餐厨垃圾酸碱度对黑水虻灭活致病菌效率影响

金 宁, 姜 慧 敏, 任 苗 苗, 张 守 玉, 刘 燕 霞,鲁 红 旭, 许 建 强, 贺 高 红, 徐 卫 平*,3

(1.大连理工大学 海洋科学与技术学院, 辽宁 盘锦 124221;2.大连理工大学 盘锦产业技术研究院, 辽宁 盘锦 124221;3.大连理工大学 工业生态与环境工程教育部重点实验室, 辽宁 大连 116024;4.大连理工大学 生命科学与药学学院, 辽宁 盘锦 124221;5.大连理工大学 精细化工国家重点实验室, 辽宁 大连 116024)

0 引 言

随着我国经济的增长,人们生活水平不断提高,餐厨垃圾的产量也在不断增大.据调查,我国人均生活垃圾产量约为1.2 kg/d,其中餐厨垃圾占50%以上[1].餐厨垃圾中含有大量未降解有机物,能量密度远高于粪便、污泥等固体废弃物,容易发臭变质、滋生细菌,危害公共卫生[2].但其中的有机物具有较高的可降解性和生物可利用性,有待资源化处理.

黑水虻(black soldier fly),又名光亮扁角水虻(HermetiaillucensL.),为双翅目水虻科昆虫[3],其幼虫有营腐食性,具有降解有机废弃物的能力.利用黑水虻资源化处理餐厨垃圾,是近年来逐渐兴起的一项有机垃圾处理技术,受到广泛关注[4].由于处理产物主要是虫沙(残渣剩余物)和虫体,经肥料化和饲料化而循环使用,所以产物的生物安全性格外重要[5-6].

已有研究表明,黑水虻在处理不同底物时,其灭活致病菌的能力存在显著差异[7-8].Erickson等[8]报道黑水虻能够灭活鸡粪和猪粪中的大肠杆菌O157(3 d),但不能彻底灭活沙门氏菌.而Lalander等[5]报道黑水虻能够彻底灭活人粪中的沙门氏菌(7 d).Lopes等[9]报道黑水虻能够缓慢消减鱼类和面包废弃物中的沙门氏菌和大肠杆菌(14 d).但De Smet等[10]则报道黑水虻对于鸡饲料中的沙门氏菌完全没有消减或抑制能力.可见处理底物对于黑水虻灭活致病菌的效力存在显著影响,餐厨垃圾中致病菌的灭活规律亟待分析和阐释.

底物的酸碱度条件对于致病菌的存活和黑水虻的生长状况有显著影响,能否通过调节餐厨垃圾的初始酸碱度促进黑水虻生长,同时加速致病菌的灭活值得深入研究.Ma等[11]和Meneguz等[12]的研究表明,黑水虻分别适应于pH为6.0～10.0和6.1～9.5的环境条件,在pH为2.0～4.0的条件下有显著的死亡和生长速率下降的现象,所以底物酸碱度条件中,中性至碱性范围更值得深入考察和阐释.

综上,本研究以沙门氏菌和大肠杆菌O157为模式致病菌,以不同初始pH条件下餐厨垃圾中致病菌的灭活规律为研究对象,分析致病菌灭活的主要因素和强化方法,评价餐厨垃圾经黑水虻处理的安全性和可行性.

1 材料与方法

1.1 实验仪器与试剂

实验仪器包括:超净工作台(JD-CJ-2S,北京东联哈尔仪器),高通量组织研磨器(SCIENTZ-48,宁波新芝),pH计(FE38型,瑞士梅特勒-托利多),高速离心机(5417C,德国艾本德),烘箱(DKM610C,雅马拓仪器武汉公司).

实验试剂包括:沙门氏菌选择性显色培养基,法国科玛嘉(CHROMagar);改良大肠杆菌O157选择性显色培养基,法国科玛嘉(CHROMagar);胰蛋白胨大豆肉汤培养基(TSB),杭州微生物试剂有限公司;BCA蛋白定量试剂盒,上海生工生物工程有限公司;宽分子量蛋白质分子量标记,宝生物工程(大连)有限公司;其他试剂均购自阿拉丁试剂(上海)有限公司.

1.2 实验材料的准备

从校园食堂收集餐厨垃圾,使用菜馅机切碎混均,测含水率.添加约湿质量10%的麦麸,调节餐厨垃圾含水率至65%.使用pH计测量餐厨垃圾的pH为5.3±0.1.使用NaOH将餐厨垃圾初始pH分别调节至6.0、8.0、10.0、12.0,保存于4 ℃冰箱中,24 h内使用.黑水虻虫卵购自江苏安佑生物科技有限公司,虫卵在豆粕、玉米粉、麸皮质量比为6∶3∶1且含水率为65%的物料中于25 ℃孵化6 d后使用.本实验使用的模式致病菌为鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellaentericaserovar Typhimurium ATCC14028)和大肠杆菌O157(EscherichiacoliO157:H7,NCTC12900),购自江苏南京百思一基生物材料公司,致病菌的培养参照姜慧敏等[13]的研究.

1.3 实验设计

本实验共设计5个实验组和5个对照组,分别对应pH为5.3、6.0、8.0、10.0和12.0这5个酸碱度条件.实验组接种致病菌且加入黑水虻.对照组仅接种致病菌而不加黑水虻.每个pH条件下进行2个平行实验,且沙门氏菌和大肠杆菌的实验分开进行.实验过程如下:第0 d将250 g调节酸碱度后的餐厨垃圾放入实验塑料盒中,实验组和对照组各接种2.5 mL过夜菌液(约108CFU/mL),搅拌均匀后,实验组加入800只六日龄黑水虻幼虫(每100只虫0.037 5 g,800只虫约0.3 g),对照组不加虫,盖上打孔盒盖.在第0、2、4、6 d采样,第6 d采样后,再向各实验组和对照组中加入250 g调节酸碱度后的餐厨垃圾,再次接种2.5 mL过夜菌液(约108CFU/mL),搅拌均匀后,继续处理12 d.期间,第7、8、9、10、12、18 d采样.第18 d采样后分离虫沙和虫体,计数预蛹(身体变黑色的幼虫)比例,称重虫沙和虫体,检测含水率后冷冻保存.在上述时间点下采集的样品,于采样当天检测致病菌数量(n=4,2个实验平行×2次检测平行).同时,每2 d检测一次物料pH、虫长和虫质量.另外,第6、12、18 d,从每个实验盒中采集5～10只黑水虻幼虫,用于检测黑水虻体内的致病菌数量.在第9 d从每个实验盒中采集10只幼虫,用于检测抗菌肽蛋白含量和抑菌能力.

1.4 致病菌的计数

餐厨垃圾及黑水虻幼虫体内致病菌的计数检测方法为梯度稀释和涂布平板计数法[11].每0.5 g餐厨残渣样品加入5 mL PBS缓冲液(pH 7.4),涡旋振荡,静置10 min,取上清液,使用PBS缓冲液10倍梯度稀释后,取100 μL溶液涂在沙门氏菌或大肠杆菌O157的显色平板上,37 ℃下培养18～24 h,计数.将2～3只洗净幼虫,加入10倍质量的PBS缓冲液,在高通量组织研磨器内,于40 Hz下研磨2 min,得到组织匀浆液,静置10 min,取上清液,通过PBS缓冲液10倍梯度稀释后,涂平板计数.该计数方法的检测极限约为102CFU/g.

1.5 黑水虻抗菌肽的提取与抑菌能力检测

黑水虻抗菌肽的提取使用含有10%乙酸和0.01 mol/L Na2EDTA的溶液为提取试剂,提取方法及变性凝胶电泳检测(SDS-PAGE)方法参照文献[14].以沙门氏菌和大肠杆菌O157为模式致病菌,将抗菌肽粗蛋白稀释至1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mg/mL的浓度,检测各浓度下的抑菌率,将抑菌率达到95%的最小蛋白浓度定义为抗菌肽的最小抑菌浓度(MIC),具体检测方法参照文献[14].

1.6 理化性质检测与垃圾转化率评价

(1)样品pH的检测

将样品与去离子水按照1∶10的比例混合,振荡静置后,通过FE38型pH计读取pH.

(2)样品含水率的检测

将样品放入105 ℃的烘箱内烘干至恒重,烘干过程中减少的质量比率为含水率.

垃圾减量化率(Rwd)、生物转化率(Rbt)、虫产率(Rip)和质量分配率按下式计算:

(1)

(2)

(3)

mb=mi+mt+mm

(4)

式中:mb为初始餐厨垃圾总干质量,mt为处理终止时虫沙总干质量,mi为处理终止时虫体总干质量,mm为处理过程中由于代谢作用所损失的干质量.以上所有质量均以g为单位.

1.7 统计分析

将平板计数结果换算为对数结果进行画图和统计分析.使用SigmaPlot 12.0进行绘图,采用R语言的multcomp程序包进行统计差异分析.当自变量含有时间因素时,以时间为协变量进行单因素协方差分析(ANCOVA),其他情况进行单因素方差分析(ANOVA).将p<0.05的情况定义为差异显著.

2 结果与讨论

2.1 不同初始pH条件下沙门氏菌和大肠杆菌的灭活规律

不同初始pH条件下,沙门氏菌的减量曲线如图1所示.由于实验中,在第0 d和第6 d两次补充了餐厨垃圾和接种了沙门氏菌,所以沙门氏菌的减量规律曲线分为第0～6 d和第6～18 d两条曲线.在第0～6 d,除了pH 12.0条件下无沙门氏菌存活外,其他pH条件下,沙门氏菌均在4 d后被灭活.在第6～18 d实验组中,pH 6.0和8.0条件下沙门氏菌在接种后1 d被灭活,pH 10.0、5.3、12.0条件下分别在接种后2、3、4 d被灭活.实验组和对照组在各个pH下,沙门氏菌的减量曲线都不存在显著性差异.实验组中,除了pH 12.0条件下以外,沙门氏菌在第6～18 d的灭活速度都快于第0～6 d;而在第6～18 d中,pH 6.0和8.0条件下的灭活速度快于pH 5.3、10.0和12.0的.

图1 黑水虻处理餐厨垃圾过程中不同初始pH条件下沙门氏菌的减量曲线

不同初始pH条件下,大肠杆菌O157的减量曲线如图2所示.在第0～6 d,除了pH 12.0条件下无大肠杆菌O157存活外,其他条件下大肠杆菌O157均在4～6 d被灭活.在第6～18 d,实验组的大肠杆菌O157在pH 6.0、8.0和10.0的条件下于接种2 d后被灭活,在pH 5.3和12.0的条件下于接种4 d后被灭活.实验组和对照组相比,除了pH 10.0第6～10 d的条件中有差异外(p<0.05),其他pH和时间条件中,均无显著性差异.实验组中,除了pH 12.0条件下以外,大肠杆菌O157在第6～18 d的灭活速度都快于第0～6 d;而在第6～18 d中,pH 6.0、8.0和10.0条件下的灭活速度快于pH 5.3和12.0的.

图2 黑水虻处理餐厨垃圾过程中不同初始pH条件下大肠杆菌O157的减量曲线

对于第6、12、18 d收集的黑水虻样品,在虫体内均未检测出沙门氏菌和大肠杆菌O157,说明黑水虻未被致病菌感染.

与已有的致病菌灭活规律相比,本研究结果的一个显著特点是,沙门氏菌和大肠杆菌O157在实验组(有虫)和对照组(无虫)中都被快速灭活,而且对照组和实验组在多数条件下无显著差异,这说明环境微生物是致病菌灭活的主要因素,而黑水虻并不是主要因素.在Erickson等[8]、Lalander等[5]、Liu等[15]报道的畜禽粪便的研究中,沙门氏菌和大肠杆菌O157在无虫对照组中均存活了较长时间,说明这两种模式致病菌在粪便中的存活时间较长,而在餐厨垃圾中的存活时间较短.在灭活时效方面,本研究发现沙门氏菌的灭活时间在1～4 d,大肠杆菌O157的灭活时间在2～6 d,这一时间比Lopes等[9]报道的鱼类和面包废弃物中的14 d(沙门氏菌和大肠杆菌)、Lalander等[5]报道的人类粪便中的7 d(沙门氏菌)时间要短,与Erickson等[8]和Liu等[15]报道的畜禽粪便中的3 d(大肠杆菌)时间相接近,说明环境微生物对于黑水虻处理过程中致病菌的灭活起到了促进作用[16].De Smet等[10]报道鸡饲料中的沙门氏菌难以被黑水虻消减或灭活,而本研究证明了在餐厨垃圾中,沙门氏菌是可以被快速灭活的,这可能与鸡饲料的多纤维素环境、环境微生物活性弱于餐厨垃圾中的微生物活性有关.在初始酸碱度条件方面,pH 6.0和8.0是同时有利于沙门氏菌和大肠杆菌O157灭活的共性条件,该条件下,两种致病菌最快可以在1～2 d被彻底灭活,这说明调节初始餐厨垃圾的酸碱度是有利于控制处理过程的生物安全性的,而pH 6.0～8.0是优势的初始酸碱度条件.

2.2 黑水虻抗菌肽的提取评价与抑菌能力分析

初始pH条件对黑水虻抗菌肽蛋白浓度(p<0.001)、提取率(p<0.001)和抑菌能力都有显著影响(图3).在抗菌肽蛋白浓度和提取率方面,pH 8.0、10.0和12.0组有优势;而在抑菌能力方面,pH 5.3、6.0和8.0组优于pH 10.0和12.0组,表现为更小的MIC.蛋白质SDS-PAGE电泳结果显示,所得抗菌肽蛋白粗提物的相对分子质量在0～44.3 kDa,不同pH组间抗菌肽相对分子质量分布无明显差异,在29.0、14.3、6.5 kDa附近,有明显的条带.

图3 不同初始pH条件下黑水虻抗菌肽的提取率与抑菌能力评价

餐厨垃圾的初始pH对抗菌肽提取率和抑菌能力有显著影响,pH 12.0的条件下,虽然抗菌肽提取率高,但是抑菌能力低,而pH 5.3、6.0和8.0的条件下,虽然抗菌肽提取率低,但是抑菌能力高.较高的抑菌能力,有利于黑水虻抵抗微生物侵害,强化对致病菌的灭活,所以pH 5.3、6.0和8.0是有利于强化黑水虻抗菌肽活性的优势条件.该条件下黑水虻抗菌肽的MIC已经达到1.0～1.5 mg/mL,这与Lee等[17]报道的经干酪乳杆菌针刺感染的黑水虻的MIC(1.0～2.0 mg/mL)十分接近,说明在餐厨垃圾中,不经过微生物针刺诱导,黑水虻也能产生高活性抗菌肽,这与黑水虻能够在细菌滋生的腐生环境下健康存活并转化垃圾的现象相吻合.在相对分子质量方面,黑水虻抗菌肽蛋白的相对分子质量一般报道为4.2 kDa[18]、4.3 kDa[19]和22 kDa[20]等,蛋白电泳的结果显示,所提取的抗菌肽粗提物包含上述相对分子质量,是含有黑水虻抗菌肽的蛋白粗提物.

2.3 餐厨垃圾物料pH的变化规律

由于在实验的第0 d和第6 d两次添加了餐厨垃圾,所以物料pH的变化曲线由第0～6 d和第6～18 d的两条曲线呈现,结果如图4所示.除了pH 12.0的条件,餐厨垃圾物料在处理的前12 d主要呈现酸性条件,pH在4.0～6.0变化,不受初始pH条件的影响,且实验组和对照组无差异,然而在第12～18 d,物料pH开始从酸性向中性或弱碱性转变,且在第18 d,实验组的pH高于对照组的(p<0.05).

图4 不同初始pH条件下餐厨垃圾物料的pH变化

餐厨垃圾虽然在初始阶段被调节了pH,但是在处理过程中,仍以酸性为主,这与餐厨垃圾含有大量的碳水化合物、油脂、蛋白等成分有关,这些高能分子在持续的降解过程中,不断释放有机酸,维持系统的酸性,在降解结束时,物料才从酸性向碱性转变.处理过程的酸性pH显然有利于致病菌的灭活,同时也证明了高度活跃的环境微生物的作用.Ma等[11]和Meneguz等[12]同样调节了底物酸碱性,但是在处理过程中,不同组的酸碱性差异明显,这与Ma等[11]和Meneguz等[12]使用以苜蓿草、玉米粉等纤维素成分为主的底物有关,纤维素类成分释放有机酸的速度比餐厨垃圾慢,而环境微生物的活性也可能比餐厨垃圾低,所以处理过程中的pH受物料初始pH的影响更为明显.Ma等[11]和Meneguz等[12]报道黑水虻分别适应于pH 6.0～10.0和6.1～9.5的环境条件,本研究结果表明,在餐厨垃圾处理中,从致病菌灭活效率和黑水虻抗菌肽抑菌活性的角度分析,pH 6.0～8.0是餐厨垃圾处理的最优初始pH条件,这一结论与Ma等[11]和Meneguz等[12]的报道基本一致.

2.4 黑水虻生长发育评价

不同初始pH条件下,黑水虻体质量和体长的增长速率存在差异(图5).pH 6.0和8.0条件下的体质量和体长的增长速率显著高于pH 5.3、10.0和12.0条件下的(p<0.05).第18 d,不同pH组的体长和体质量分别达到15.43 mm、0.122 g(pH 5.3),20.11 mm、0.212 g(pH 6.0),20.79 mm、0.226 g(pH 8.0),18.95 mm、0.189 g(pH 10.0)和16.65 mm、0.122 g(pH 12.0).体长和体质量增长速度的差异说明pH 6.0和8.0是有利于黑水虻生长代谢的优势条件.

图5 不同初始pH条件下黑水虻体质量和体长的增长

2.5 餐厨垃圾转化效果评价

餐厨垃圾的初始pH对黑水虻预蛹率无影响(p=0.109),对垃圾减量化率(p<0.001)、虫产率(p=0.001)、生物转化率(p<0.001)有显著影响(图6).其中预蛹率达到74.8%～88.7%;虫产率中,pH 6.0(12.7%)、pH 8.0(15.9%)、pH 10.0(16.2%)组高于pH 5.3(10.0%)和pH 12.0(7.9%)组;垃圾减量化率中,pH 5.3～10.0(75.1～79.5%)组高于pH 12.0(51.3%)组;生物转化率中,pH 6.0(16.0%)、pH 8.0(20.0%)、pH 10.0(21.7%)组高于pH 5.3(13.1%)和pH 12.0(15.3%)组.质量分配率结果显示,不同pH条件下,餐厨垃圾转化为虫沙、虫体以及代谢损失的比例分别为20.5%～48.7%、7.9%～16.2%、43.4%～66.7%,说明餐厨垃圾减量化以黑水虻代谢消耗为主.

(a)预蛹率

综合垃圾减量化率和虫产率的结果分析,初始pH 6.0～10.0的条件优于pH 5.3和12.0的.而在pH 6.0、8.0、10.0中,虽然在虫产率方面,pH 10.0略高于pH 6.0和8.0的条件,但这可能是因为pH 6.0和8.0的幼虫生长发育更快(图5),提前进入预蛹期而产生的虫质量下降所造成的[21].所以,通过致病菌灭活速度、抗菌肽抑菌活性、幼虫生长速率以及垃圾减量化率的综合分析,初始pH 6.0～8.0是黑水虻处理餐厨垃圾的优势条件,值得应用和推广.0在pH 6.0～8.0的条件下,餐厨垃圾的减量化率达到78.3%～79.5%的水平,在已报道的黑水虻处理餐厨垃圾的减量化率(53%～80%)中[22],为中上游水平,说明黑水虻能够在降解餐厨垃圾的同时高效灭活致病菌,是餐厨垃圾转化的高效且安全的处理方法.

3 结 语

餐厨垃圾的初始pH对于致病菌灭活速度、黑水虻抗菌肽抑菌活性和幼虫生长速率都有显著影响.环境微生物以及物料酸性条件是沙门氏菌和大肠杆菌O157灭活的主要因素.黑水虻是垃圾减量化的主要动力,但并不是致病菌灭活的主要因素.调节餐厨垃圾的初始pH至6.0～8.0,可显著促进致病菌的灭活,提高黑水虻抗菌肽抑菌活性,增进幼虫生长速率,是黑水虻处理餐厨垃圾的优势条件,值得在实践中应用和推广.