葡萄酒中链脂肪酸乙酯产生机制与调控策略探讨

胡文效，姚彬彬，陈明光，朱宇彤，沃晓妍，邱磊*

（1. 齐鲁工业大学（山东省科学院），山东济南 250353；2. 山东中烟工业有限责任公司，山东济南 250013）

中链脂肪酸乙酯（MCFAEE），如己酸乙酯、辛酸乙酯和癸酸乙酯，具有浆果、花香香韵，对提高葡萄酒感官品质发挥着关键作用。该类物质是葡萄酒香气的重要组成部分，普遍存在于葡萄酒、白兰地、威士忌、朗姆酒等饮料酒中[1-2]。汤晓宏等[3]的研究发现，‘赤霞珠’果实中未检出C8、C10的MCFAEE化合物，而对其葡萄酒的香气化合物分析显示，酯类的种类和含量最丰富，其中辛酸乙酯、癸酸乙酯相对含量显著高于其它酯类；刘静等[4]分析了3个年份‘维欧尼’葡萄酒的香气成分，得出类似结果，即MCFAEE相对含量较高，且辛酸乙酯显著高于其它酯类化合物；前苏联高格察西维里[5]从葡萄酒酵母沉淀物中分离出的康酿克油，其主要成分是癸酸乙酯、辛酸乙酯、月桂酸乙酯等；李记明等[6]分析鉴定了XO级白兰地挥发性成分，结果表明酯类是白兰地中主要的挥发性成分，其中辛酸乙酯、癸酸乙酯、十二酸乙酯相对含量较高。

葡萄浆果中脂肪族挥发性化合物的组成主要为直链或支链的短链C6醛和醇[7]，葡萄中存在的所能检测到的酯类脂肪族化合物通常处于较低丰度，且对香气的影响较小[8]，说明葡萄酒中MCFAEE是在葡萄酒发酵过程中产生。有研究指出，在厌氧发酵过程中，酿酒酵母会释放大量的中链脂肪酸（MCFA）和相关的乙酯，对于发酵饮料的芳香品质非常重要[9]。进一步说明发酵过程中乙酯是通过脂质代谢产生[10]。本文通过对已有文献分析MCFAEE的生成机制，探讨MCFAEE是来源于脂质合成代谢或者分解代谢，以及调控环境变量对MCFAEE产量的影响。

1 酿酒酵母脂肪酸代谢

葡萄酒发酵过程中，酵母菌生长经迟缓期、对数期、稳定期、衰亡期，直至发酵停止，一般需要7～14 d，期间持续进行复杂的物质代谢和能量代谢。物质代谢的结果除产生酵母菌体和主产物乙醇外，还有众多副产物，共同构成葡萄酒发酵产物。葡萄酒发酵中酵母菌生长对数后期至稳定期，生物量一般达到108cfu·mL-1。酵母菌生长繁殖需要相应量的长链脂肪酸（LCFA）合成特定的磷酸甘油酯（1, 2-二酯酰-L-甘油-3-磷酸），构建细胞膜系统。酿酒酵母菌的脂肪酸主要由饱和脂肪酸棕榈酸（C16）、硬脂酸（C18）和不饱和脂肪酸油酸（C18:1）、棕榈油酸（C16:1）组成[11]。因菌株和发酵基质、有氧或厌氧等变量差异，脂肪酸组成有所不同。陈声明等[12]对酿酒酵母菌脂肪酸组成分析结果显示，C16:1占59.6%、C18:1占24.73%、C16:0占6.9%。

1.1 脂肪酸分解代谢

葡萄汁中含有一定量的脂质。段亮亮[13]测得‘赤霞珠’葡萄果浆总脂肪酸含量为755.33 mg·kg-1，其中，亚油酸316.37 mg·kg-1、软脂酸127.90 mg·kg-1、α-亚麻酸81.60 mg·kg-1、油酸64.62 mg·kg-1、硬脂酸44.45 mg·kg-1。在葡萄酒发酵过程中，葡萄汁中的脂肪酸经过相应机制进入酵母细胞被用于脂质合成或作为能量来源，如以三酰基甘油形式存在的脂肪酸，在酿酒酵母胞外酰基甘油酯酶作用下水解产生游离脂肪酸，并通过扩散或转运蛋白被吸收进入酵母细胞。在定位于内质网、脂质滴的酰基辅酶A合成酶作用下，进入细胞质的外源性脂肪酸与辅酶A结合生成脂酰辅酶A，产物脂酰辅酶A可以用于细胞复杂的脂质合成或在过氧化物酶体中进行β-氧化[14]。酿酒酵母中脂肪酸的β-氧化作用仅限于细胞的过氧化物酶体区室[15-16]，如图1。

图1 葡萄酒发酵酿酒酵母过氧化物酶体长链脂肪酸氧化示意图Figure 1 Schematic diagram of long-chain fatty acid oxidation in wine fermentation by Saccharomyces cerevisiae

长链脂酰辅酶A（LCFA-CoA）通过过氧化物酶体膜转运蛋白Pxa1p和Pxa2p导入过氧化物酶体[17]。β-氧化过程首先是酰基辅酶A氧化酶Fox1p（Pox1p）将脂酰辅酶A氧化为反式2-烯酰辅酶A；反式-2-烯酰辅酶A在Fox2p（Mfe2p）作用下，经水化、脱氢转化为β-酮脂酰辅酶A；硫解酶Fox3p（Pot1p）催化β-酮脂酰辅酶A裂解为乙酰辅酶A和减少2个碳的脂酰基-CoA[18]。过氧化物酶体内产生的乙酰辅酶A进入胞质或线粒体有两条途径，即通过转化为乙醛酸循环中间体或通过肉碱乙酰转移酶转化为乙酰肉碱[19]。肉碱乙酰基转移酶催化肉碱与乙酰辅酶A之间的可逆反应，从而形成乙酰肉碱和游离辅酶A，肉碱乙酰基转移酶的表达可以成功地用于调节酒的风味[20]。

葡萄酒发酵前菌种活化以及葡萄除梗、破碎，或者为满足酵母菌快速生长的需要，葡萄汁中自然溶入一定量的氧，这使得葡萄酒发酵初期部分脂肪酸可以发生β-氧化。脂肪酸β-氧化主要意义在于释放能量和产生乙酰辅酶A。乙酰辅酶A不仅是初级代谢中间体，还在酯类物质的合成中起关键作用。

1.2 脂肪酸合成代谢

根据酿酒酵母脂肪酸组成，葡萄酒发酵过程中酿酒酵母生长繁殖需要相应量的C16:1、C18∶1和C16:0等脂肪酸，菌体所需脂肪酸来自自身合成和环境基质提供，当葡萄汁中外源性脂肪酸不能满足生长繁殖需要时，酵母菌必须自身合成。酿酒酵母脂肪酸初始合成在细胞浆和线粒体中发生，由乙酰辅酶A羧化为丙二单酰辅酶A（图2）。

图2 酿酒酵母细胞浆中脂肪酸合成及中链脂肪酸释放示意图Figure 2 Fatty acid synthesis and medium chain fatty acid release in Saccharomyces cerevisiae cytoplasm

胞浆中的乙酰辅酶A在乙酰辅酶A羧化酶作用下，生成丙二单酰辅酶A。乙酰辅酶A、丙二单酰辅酶A分别在乙酰辅酶A-ACP转酰基酶、丙二单酰辅酶A-ACP转酰基酶作用下，转酰基为乙酰-ACP、丙二酰-ACP（ACP为酰基载体蛋白），之后在脂肪酸合成酶多酶复合体作用下，经过“缩合-还原-水解-还原”循环，每完成一次循环碳链增加2个碳原子，碳链延长过程经丁酰-ACP、己酰-ACP、辛酰-ACP、癸酰-ACP、十二酰-ACP等，直至目的产物，终止于硫酯酶作用，并在转酰基酶作用下转脂酰基到辅酶A上，生成LCFA-CoA，进入磷酸甘油酯合成或脂肪合成[21]。在脂质合成过程中，乙酰辅酶A羧化酶是脂肪酸合成的限速酶，该酶的催化反应是脂质合成代谢中的一个关键调控环节，已知的激活剂有柠檬酸和异柠檬酸；长链乙酰辅酶A（如棕榈酸）则是强反馈抑制剂，乙酰辅酶A的活化与抑制作用非常协调[22]。

酵母菌脂肪酸合成过程中，在乙酰辅酶A羧化酶活化启动到被抑制之间，释放出LCFA-CoA（图2）。乙酰辅酶A羧化酶启动脂肪酸合成，并在缺氧条件下被长链饱和酰基辅酶A抑制，导致脂肪酸合成酶复合物中释放出MCFA-CoA；在有氧的情况下，长链饱和酰基辅酶A转化为不饱和酰基辅酶A，不抑制乙酰辅酶A羧化酶，不引起脂肪酸合酶复合物中MCA-CoA的释放[23]。所以说，发酵过程中排出的MCFA是通过脂肪酸合成代谢而不是通过分解代谢产生[24]。MCACoA作为LCFA合成代谢中间体，又作为MCFAEE合成前体物，在酰基转移酶作用下生成MCFAEE。

2 葡萄酒发酵中链脂肪酸乙酯合成机制与调控策略分析

2.1 中链脂肪酸乙酯合成酶的特异性

根据MCFAEE合成前体物MCFA来自脂肪酸合成中间体。对具体一款葡萄酒来说，各MCFA产生的量基本相同，但前述葡萄酒、白兰地香气分析中辛酸乙酯相对含量出现高于其它酯类化合物的结果，可能是由酰基转移酶特异性导致。Saerens等[25]研究显示，酿酒酵母中Eht1p和Eeb1p具有合成MCFAEE的能力和酯酶活性，是形成MCFAEE最重要的酶，EHT1和EEB1双重缺失使辛酸乙酯的生成减少70%，Eht1p偏爱辛酰辅酶A做底物。Knight等[26]从动力学角度研究了体外Eht1对己酰辅酶A、辛酰辅酶A、癸酰辅酶A、十二酰辅酶A的亲和性和催化效率，结果显示，Eht1p的米氏常数（Km，mol·L-1）值顺序为：辛酰辅酶A＜癸酰辅酶A＜十二酰辅酶A＜己酰辅酶A，对辛酰基亲和力最大；Eht1的催化常数（Kcat，S-1）值顺序为：辛酰辅酶A＞癸酰辅酶A＞己酰辅酶A＞十二酰辅酶A，对辛酸酰基催化转化最快；Eht1的Kcat/Km（L·mol-1S-1）值顺序为：辛酰辅酶A＞癸酰辅酶A＞十二酰辅酶A＞己酰辅酶A，对辛酰基催图化效率最高。Lilly等[27]的研究进一步证实，Eht1p催化了MCFAEE的合成，用商业葡萄酒酵母菌株VIN13（pEHT1-s）发酵的佐餐葡萄酒中己酸乙酯、辛酸乙酯和癸酸乙酯的浓度显著增加，感官分析中癸酸乙酯、己酸乙酯（苹果香气）和辛酸乙酯的影响也明显增强。这些研究结果表明，Eht1p具有催化辛酸乙酯等MCFAEE合成的特异性。

Byrne等[28]研究发现，EHT1和EEB1密切相关，碱基序列有58%的同一性、73%的相似性，是基因组重复复制的旁系同源蛋白。酿酒酵母Eht1p和Eeb1p是在底物诱导下产生的，辛酸（C8）能够诱导EEB1和EHT1的表达，且EEB1表达上调显著[29]。熊国通等[30]研究了乙醇胁迫条件下EEB1相对表达，3%、6%、10%乙醇处理的基因表达量分别是对照组的22倍、407倍和5113倍，差异显著。

目前，人们已发现并鉴定了酿酒酵母中5种与酯类化合物合成相关的醇酰基转移酶，即Atf1p、atf2p、Eht1p、Eeb1p和与Atf1p同源的Lg-Atf1p；分别由ATF1、ATF2、EHT1、EEB1编码；1种与分解有关的酯酶Iah1p，由IAH1编码。Eht1p和Eeb1p在发酵中催化MCFAEE合成；Atf1p、atf2p催化乙酸乙酯和乙酸异戊酯生产，Lg-Atf1p参与乙酸乙酯和乙酸异戊酯的生产；Iah1p酶水解乙酸异戊酯、乙酸乙酯和乙酸-2-苯乙酯，并在很大程度上水解乙酸己酯[24]。

Nancolas等[31]在研究Atf1p生化性质时发现，Atf1p对一系列脂酰辅酶A具有活性，并且对C8（辛酰基）底物具有最大的催化效率。Eht1p与Atf1p两种酶之间的主要区别在于Eht1p的底物范围更窄、效率更高，对辛酰基辅酶A的偏爱性更强。Eht1p和Atf1p相对于辛酰基辅酶A的Kcat/Km分别为15×104和8×104L·mol-1·S-1，二者均具有硫酯酶活性。Eht1p兼有硫酯酶功能，即使在高乙醇浓度下也能水解MCA-CoA生成MCFA，与Saerens、Knight等[25-26]的研究结果一致。

2.2 中链脂肪酸乙酯合成机制

Eht1p是一种位于酵母脂质颗粒和线粒体外膜的脂蛋白[32-33]，具有转移酶（乙醇-O-酰基转移酶）和水解酶（硫酯酶）功能，与酶蛋白质一级和三级结构及底物诱导蛋白构像发生变化有关。Knight等[26]多序列比对预测，在Eht1p C末端的α/β水解酶结构域具有丝氨酸、天冬氨酸、组氨酸残基（Ser-Asp-His）催化三联体，核心催化残基Ser247、Asp395和His423的作用。酿酒酵母可产生多种硫酯酶，Cantu等[34]预测了酿酒酵母硫酯酶可催化残基Ser161、Asp241和His276。

葡萄酒发酵过程中，酿酒细胞内MCFA-CoA与乙醇在酰基转移酶Eht1p、Eeb1p作用下生成MCFAEE（图3）。根据Knight等[26]和Saerens等[24]对Eht1p核心催化残基预测结果，结合催化三联体亲核催化和广义酸碱催化协调机制，做Eht1p催化合成MCFAEE机制图（图4）。

图3 酰基转移酶催化中链脂肪酸形成示意Figure 3 Acyltransferase catalyzes the formation of mediumchain fatty acids

图4 酰基转移酶催化中链脂肪酸乙酯合成机制Figure 4 Acetyltransferase-catalyzed synthesis mechanism of medium-chain fatty acid ethyl esters

首先MCFA-CoA与酶活结合，诱导酶构象契合变化，在活性中心催化三联体（Ser-Asp-His）丝氨酸残基羟基质子转移到组氨酸残基咪唑基，带负电荷氧原子攻击底物酰基辅酶A羰基碳原子，形成底物与丝氨酸残基共价过渡态，继而组氨酸残基咪唑基脱去质子，酰基辅酶A硫酯键断裂，丝氨酸残基羟基氧与底物羰基碳形成酯共价键，完成第一次亲核反应；接着乙醇进入，在组氨酸残基作用下脱去羟基质子，带负电荷氧原子攻击酯键羰基碳原子，再一次发生亲核反应，将酰基转移与乙醇中的氧结合形成MCFAEE，同时丝氨酸残基获得质子被还原。

2.3 葡萄酒发酵中链脂肪酸乙酯调控策略分析

葡萄酒中已鉴定出800多种香气化合物[35-36]，每款葡萄酒的香气都是众多香气化合物整体组合的嗅觉表现，且每一香气组分增量都会引起香气整体嗅觉变化，特别是嗅觉阈值较低的化合物引起的整体变化更为显著。葡萄酒发酵酵母菌代谢产生的酯类化合物乙酸酯类（乙酸乙酯、乙酸异戊酯、乙酸苯乙酯、乙酸己酯等）和乙酯类（乙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、十二酸乙酯等）对葡萄酒香气具有重要贡献，MCFAEE是白兰地酒特征香气成分，所以MCFAEE的代谢积累是葡萄酒、白兰地酿造关注的重点。

基于MCFAEE源于脂肪酸合成代谢，并且催化MCFAEE合成的酰基转移酶Eht1p、Eeb1p受底物MCFA-CoA诱导，以及EHT1或EEB1过表达不明显影响乙酯的生产[25,27]，即：MCFAEE的产量取决于底物的浓度，酵母细胞内MCFA-CoA浓度是MCFAEE产量的限制因素[24]。所以，MCFAEE发酵调控对象是脂肪酸合成，调控目标是MCFA-CoA释放量。脂肪酸合成过程中，乙酰辅酶A是基础原料，它的生成量、流向脂肪酸合成方向的量决定着脂肪酸合成水平。乙酰辅酶A的生成量与酵母菌生物量呈正相关，厌氧条件下乙酰辅酶A向脂肪酸合成的流量与细胞生命力（时序寿命、比生长率）相关。所以，通过调控葡萄酒发酵过程中酿酒酵母生物量、比生长率和时序寿命，可以达到调控脂肪酸合成水平的目的。

发酵温度影响酿酒酵母生长速率、生物量，能够调整酿酒酵母次生代谢产物通量，强烈影响脂质代谢。Beltran等[37]分析了13 ℃和25 ℃发酵条件下酿酒酵母显著差异表达的535个基因，发现在25 ℃下的发酵中，与胞质脂肪酸合成有关的几个基因下调；在13 ℃下的发酵中，与线粒体短链脂肪酸合成有关的基因上调。Schwinn等[38]研究了‘雷司令’发酵过程中温度对酵母生长、挥发物等的影响，结果显示，在19 ℃下发酵的后半段，除丁酸乙酯外，所有乙酯的最大浓度均高于14 ℃的发酵处理；在19 ℃下葡萄酒中酵母总数也最高，为1.5×108cfu·mL-1，而在14 ℃和16-11-17 ℃梯度发酵的葡萄酒中，酵母总数分别为1.3×108、1.2×108cfu·mL-1，差异约为20%。所以，温度因素通过影响脂肪酸合成途径相关基因的表达来影响MCFAEE产量。

氮是构成蛋白质和核酸的元素，氮素是常见的微生物生长限制因素。对于确定的酿酒酵母菌株，葡萄汁可同化氮影响葡萄酒发酵生物量、发酵速率和发酵产物。刘沛通等[39]比较了不同菌株150、250 mg·L-1氮浓度下发酵动力学和产物挥发性成分，结果显示，氮的利用具有菌株特异性，但都表现出低浓度可同化氮的甘油产量高的特点，不同菌株表现出不同的酯和脂肪酸生成模式，商业菌株酯产量与初始可同化氮浓度正相关。

在葡萄酒发酵过程中，不饱和脂肪酸（UFAs）是酿酒酵母生长繁殖的必需营养物质，酿酒酵母主要从葡萄汁中获得UFAs[39]，因为UFAs不能在缺氧的条件下合成。Beltran等[40]研究了发酵培养基脂质组成对酒中挥发性成分的影响，发现葡萄汁与合成葡萄汁相比，前者比后者完成发酵快，分别为14、25 d；由葡萄汁获得的葡萄酒中挥发性化合物的浓度较高，辛酸乙酯的含量是合成葡萄汁发酵的两倍。这与合成葡萄汁中缺乏UFAs等生长因子，厌氧条件下限制了酵母菌生长有关。

氧气是葡萄酒发酵中不可忽视的重要因素，葡萄酒发酵并非绝对厌氧发酵，酵母菌脂肪酸代谢是在有氧条件下进行的，微量氧气对于酵母菌缓慢生长和提高次生代谢产物产量具有重要作用。有研究比较了酿酒酵母需氧培养和厌氧培养，结果显示有500个基因表达存在显著差异，只有23个基因是厌氧菌生长所特有，对于这些基因在无氧条件下表达量的差异性或其关键作用机制还需要进一步探索[41]。

综上所述，葡萄酒发酵过程中酿酒酵母生物量、细胞生命活力（比生长率、时序寿命）状态参量决定着MCFAEE代谢产量，环境变量温度、发酵基质和氧气等，显著影响细胞总量、细胞生命活力。葡萄酒发酵采用适度低温、适当溶氧和控制葡萄汁脂质、适量可同化氮，提高细胞群体峰高和细胞时序寿命，降低细胞比生长率，可以达到提高MCFAEE产量目的。这符合一般发酵规律，次级代谢作用只有当菌体在低的比生长率条件下才可发生[22]。

3 总结与展望

本文以酿酒酵母脂肪酸代谢、中链脂肪酸乙酯合成酶系的研究进展为基础，探讨了葡萄酒发酵中链脂肪酸乙酯的生成机理及调控策略，理清了基于酿酒酵母脂肪酸合成代谢的中链脂肪酸乙酯合成途径，讨论了脂肪酸合成限速酶（乙酰辅酶A羧化酶）、脂肪酸合成酶复合体、硫酯酶、硫激酶在中链酯酰辅酶A形成中的作用。并指出中链酯酰辅酶A为中链脂肪酸合成的限制因子，重点分析了酰基转移酶Eht1p和Eeb1p的特异性及催化机制，结合实践，围绕提高葡萄酒发酵中链脂肪酸乙酯产量，提出了以发酵环境变量（温度、溶氧、葡萄汁脂质、可同化氮）为手段，以酿酒酵母细胞总数、细胞生命活力为靶标的调控策略，为优化葡萄酒、白兰地酒香气质量提供了参考。

酒类风味是风味科学的重要领域，香气在饮料酒风味中占主要地位，中链脂肪酸乙酯是饮料酒产品果香香韵特征香气成分，研究其合成机制与调控策略，不但是酿酒风味科学向纵深发展的选项，而且对于促进饮料酒产品品质升级和饮料酒产业高质量发展具有重要意义。

中链脂肪酸及其衍生物在能源、医药领域有着广阔的应用前景。基于酿酒酵母模式生物探索中链脂肪酸生物合成途径与机制，进而利用合成生物学手段创新生物资源，从头合成中链脂肪酸及其衍生物，符合经济建设、人类健康需求。