宁夏贺兰山东麓葡萄灰霉病菌类群分析

李晓庆，闫思远，顾沛雯

（宁夏大学农学院，宁夏银川 750021）

宁夏贺兰山东麓地区是我国最大的葡萄酒地理标志保护产区，随着葡萄种植面积不断扩大，由葡萄灰葡萄孢（Botrytis cinerea）引起的葡萄灰霉病已成为宁夏贺兰山东麓葡萄产业重大病害之一[1]。据调查，不同年份造成的葡萄产量损失在20%～50%[2]。灰葡萄孢可以侵染葡萄的叶片、花穗、果实和穗轴等，环境适宜时会在病斑表面产生鼠灰色霉层，直接影响葡萄的产量和品质[3-4]。

葡萄灰葡萄孢属于复合种，由于繁殖快、遗传变异大和适合度高的特点[5]，导致其产生很多类群。不同类群菌株之间致病性和抗药性均存在较大差异，这给葡萄灰霉病的有效防治带来了巨大的挑战，因此对灰葡萄孢进行类群划分十分重要。蒋忠洪[6]根据生长特征将来自湖南不同地区的223株灰霉病菌株划分为菌丝型、菌核型、孢子型3种类型。张艳杰等[3]对来自全国不同地区的143个灰葡萄孢菌株进行形态学划分，其中40.56%为菌丝型、59.44%为菌核型，根据其生长速率可分为高、中、低3个等级，形态学分布与采集地地理距离无明显相关性。冯晓菲[7]通过菌落类型、生长速率和离体草莓叶片致病力对来自四川195株草莓灰霉病菌株进行分析，表明不同菌株之间存在差异。冯宝珍[8]从运城保护地茄子病株中分离纯化出15个灰葡萄孢菌株，依据菌株的生长速率、菌核的大小、形状，将其划分为4个类群，分别为菌丝型、孢子型、细小菌核型和大菌核型。

近年来，随着宁夏贺兰山东麓产区葡萄种植面积扩大，葡萄灰霉病的危害也越来越严重，但贺兰山东麓灰霉病菌的类群划分研究较少，对灰霉病类群进行系统划分显得尤为重要。本研究以从宁夏贺兰山东麓地区不同葡萄品种病果中分离的13株葡萄灰霉病菌为研究对象，对比其分别在马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）、改良马丁琼脂培养基和燕麦培养基上的形态和生长速率、产孢量、微菌核以及致病性差异，并通过分子生物学的方法，对其进行类群划分，以期摸清该地区灰霉病菌的种群结构，为宁夏贺兰山东麓葡萄灰霉病的有效防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

葡萄灰霉病病果采集：2021年6—9月，在宁夏贺兰山东麓葡萄6个酒庄共采集葡萄灰霉病果30份，用自封袋密封后立即带回实验室，采用组织分离法分离病原菌[9]，共获得13株葡萄灰霉病菌（B. cinerea）见表1，使用PDA培养基和冻干滤纸进行短期和长期保存。

表1 13株葡萄灰霉病菌的采集信息Table 1 Collection information of 13 strains of B. cinerea

2021年8月购买无病斑、果粒大小均等、着色一致的‘红地球’葡萄果穗，用于致病性测定。

依据13株葡萄灰霉病菌的形态学分析和致病性测定结果，使用SPSS 25进行聚类分析，以欧式距离为10作为聚类分割点，对其进行类群划分。依据在PDA培养基上的菌落表现及生长速率[14]（图3A）可分为2类，其中菌株BC3、BC6、BC7、BC8、BC9、BC10、BC11和BC12为第一大类，菌株BC1、BC2、BC4、BC5和BC13为第二大类。依据在燕麦培养基上的菌落表现及生长速率（图3B），可分为3类，其中菌株BC2、BC3、BC5、BC11和BC12为第1类，菌株BC6、BC7、BC8、BC9和BC10为第2类，菌株BC1、BC4和BC13为第3类。依据在改良马丁培养基上的菌落表现及生长速率（图3C），可分为3类，其中菌株BC1、BC2、BC3、BC5、BC6、BC8、BC9、BC10、BC11、BC12和BC13为第1类，菌株BC4为第2类，菌株BC7为第3类。依据13株葡萄灰霉病菌产孢量（图3D），可分为2类，其中菌株BC1、BC2、BC3、BC4、BC5、BC6、BC7、BC8、BC9、BC10、BC11和BC13为第1类，菌株BC12为第2类。依据13株葡萄灰霉病菌产菌核情况（如图3E），可分为2类，其中菌株BC1、BC2、BC3、BC4、BC5、BC6、BC7、BC9、BC10、BC11、BC12和BC13为第1类，菌株BC8为第2类。依据13株葡萄灰霉病菌致病性（图3F），可划分为2类，其中菌株BC1、BC2、BC3、BC4、BC5、BC8和BC13为第1类，菌株BC6、BC7、BC9、BC10、BC11和BC12为第2类。

1.2 供试仪器、试剂、培养基

1.3.3 病菌菌核形体比较

光学显微镜（OLYMPUS BX53，Japan）；凝胶成像系统（Azure Biosystems c200，USA）；Sigma 3K 15通用台式冷冻离心机（Sigma公司，USA）；PCR仪（T100TMThermal Cycler，Singapore）。Biospin®真菌DNA提取试剂盒（BioFlux公司，日本）；2×Easy Taq PCR Super Mix、RNase A、DNA marker、Agarose和GelStain染液购自北京全式金生物技术有限公司；50×TAE缓冲液、DNase/RNase-Free Water购自北京索莱宝科技有限公司。

上述区域内的流速场会对物体漂移速度产生影响，因此首先将该区域内所有流场数据提取出来，假设该区域流速场用以下两个矩阵表示为

1.2.2 供试培养基

马铃薯葡萄糖（PDB）培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20.0 g，定容至1.0 L。马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20.0 g，琼脂粉15.0 g，定容至1.0 L。改良马丁琼脂（GM）培养基：蛋白胨5.0 g，磷酸氢二钾1.0 g，硫酸镁0.5 g，酵母浸出粉2.0 g，葡萄糖20.0 g，琼脂粉15.0 g，定容至1.0 L。燕麦琼脂（YM）培养基：燕麦片30.0 g制备浸出液，琼脂粉15.0 g，定容至1.0 L。以上各培养基121℃，20 min高压蒸汽灭菌后，备用。

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1.3 形态学分析

1.3.1 不同培养基上的培养性状比较

接种前5 d在PDA培养基上活化培养，使用灭菌打孔器在活化后的菌落边缘打取直径为5 mm的葡萄灰霉病菌饼，分别接于PDA培养基、YM培养基和GM培养基中，25 ℃黑暗培养5 d，测定菌落直径，并记录其菌落形态，各处理重复3次。

1.3.2 产孢量测定

接种前5 d在PDA培养基上活化培养，使用灭菌打孔器在活化后的菌落边缘打取直径为5 mm的葡萄灰霉病菌饼接种于PDB培养基中，180 r·min-1，26±2 ℃下振荡培养5 d过滤制成孢子悬浮液，血球计数板计数，各处理重复3次。

1.2.1 主要仪器和试剂

回到家里，紫云拿出那个黑色公文包，里面有一张调令文书。所有的手续都办好了，新的工作单位是华夏出版社。她把房子卖了，带着儿子，到上海去了。

水平三角形的第（4）浪之后，进入一气呵成的第（5）浪，至2015年6月7559点结束。当初将2013年6月底的低点划分作第（4）浪终点，将（4）浪D看作（5）浪1——这是常见的错误——因此才有后来的（5）浪5预期。7559点结束第（5）浪，这是循环浪III的顶点，因此后面的调整属于循环浪IV。其中，第一个浪A可能会于2019年结束，特别是当国证A指跌至上升通道的下轨时，配合波浪理论，将成为循环浪IV第一个买点。

1.4 葡萄灰霉病菌致病性测定

将‘红地球’果粒用自来水冲洗表面灰尘后，放入75%（Vol）乙醇浸泡3 min消除气泡，用5%（Vol）次氯酸钠溶液浸泡5 min，无菌水冲洗4次，置于无菌滤纸晾干果粒表面的水分备用。用无菌接种针刺伤葡萄果粒表面，挑取直径5 mm的灰霉菌饼接于葡萄果粒伤口处，置于25 ℃、湿度85%的保湿培养箱培养，每菌株处理21粒，无菌水为对照，分别于第5天、第7天观察并统计发病情况，并计算发病率及病情指数。

病害分级标准[10]如下：

使用Biospin®真菌DNA提取试剂盒提取真菌DNA。PCR反应体系（25 μL）：2×Eco Taq®PCR Super Mix 12.5 μL，正、反向引物（10 μmol·L-1）各1 μL（表2），DNA模板1 μL，ddH2O补足。PCR反应条件：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，58～64 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测后，凝胶成像系统分析结果。将所得PCR原液送至生工生物工程（上海）有限公司进行测序，并将测序结果在NCBI进行BLAST比对。依据测序结果合并序列相同的菌株，确定菌株的分类地位。

由表5可知，13株葡萄灰霉病菌单孢菌株在接种后第5天发病率均达90.00%以上。其中菌株BC9致病力显著高于其它菌株，在接种后第5天，发病率为99.04%，病情指数为88.24，产生大量的菌丝将离体果粒迅速包裹，造成果粒腐烂；其次是菌株BC7，在接种第5天时，发病率为99.01%，病情指数为68.63，症状表现为产生了少量灰黑色菌丝附着在离体果粒表面，造成果粒部分干枯和果皮凹陷；菌株BC3致病力较弱，在接种后第5天时，发病率为93.07%，病情指数为9.80，发病症状为只产生少量菌丝附着于果粒表面，没有造成任何果粒损伤。

开孔钢板连接件(perfobond strip connector，也称为PBL连接件)是1987年，德国学者Leonhardt在解决委内瑞拉的卡罗尼第三大桥组合结构剪力连接件的疲劳问题时提出的一种新型剪力连接件[2].PBL连接件是通过开孔钢板在混凝土板中形成的一系列混凝土榫、开孔钢板和贯穿钢筋共同承担剪力.

1.5 葡萄灰霉病菌产孢类群的系统发育分析

0级：果实无病；1级：病果（病斑）面积占整个果穗（果粒）面积的5%以下；3级：病果（病斑）面积占整个果穗（果粒）面积6%～15%；5级：病果（病斑）面积占整个果穗（果粒）面积16%～25%；7级：病果（病斑）面积占整个果穗（果粒）面积26%～50%；9级：病果（病斑）面积占整个果穗（果粒）面积50%以上。

1.2.3 观察指标：术前及术后DASH评分、住院天数、肌电图、术后当日疼痛VAS评分。DASH评分是一种问卷式的评分方式，旨在调查上肢的症状及从事日常活动的能力[17]。VAS疼痛评分法[18](0分～10分)：0分:无痛；3分以下:有轻微的疼痛，能忍受；4分～6分:患者疼痛并影响睡眠，尚能忍受；7分～10分:患者有渐强烈的疼痛，疼痛难忍，影响食欲，影响睡眠[19]。剪切波弹性成像，通过发射高频超声来激发组织产生剪切波，根据其波速结合弹性测量公式就可以计算出正中神经的实际弹性值从而反映组织的受压情况[20-21]。

表2 所用引物Table 2 Primers used

1.6 数据分析

数据采用Microsoft Excel 2019对灰霉病样进行统计分析，使用IBM SPSS Statistics 25进行单因素方差分析及聚类分析。使用MEGA 6.0软件采用邻接（Neighbor-Joining）法构建系统发育树。应用SDTv.1.2软件分析基因序列间核酸的一致性。

2 结果与分析

2.1 灰葡萄孢在不同培养基上的形态差异

图1、表3分别为13株葡萄灰霉病菌株在3种培养基上5 d时的菌落形态和平均生长速率。在PDA培养基上，菌株BC1、BC2、BC4、BC5和BC13菌丝生长速率较快，均大于0.53 cm·d-1，菌丝浓密；菌株BC6、BC7、BC8、BC9和BC12菌丝生长速率其次，平均速率为0.36～0.39 cm·d-1；而菌株BC3、BC10和BC11的菌丝生长速率较慢，平均生长速率为0.30～0.33 cm·d-1，菌株BC9的生长速率显著高于菌株BC3、BC10，菌丝稀疏。在燕麦培养基上，菌株BC7、BC9和BC10菌丝生长速率较快，平均生长速率均大于0.49 cm·d-1，菌丝浓密；菌株BC3、BC5、BC6、BC8、BC11和BC12生长速率较慢，平均生长速率为0.35～0.45 cm·d-1。在改良马丁培养基上，菌株BC3、BC4、BC5和BC10菌丝生长速率较快，平均生长速率均大于0.6 cm·d-1，菌丝浓密；菌株BC1、BC2、BC9和BC12生长速率较慢，平均生长速率为0.52～0.56 cm·d-1。

图1 13株葡萄灰霉病菌菌株在不同培养基上的菌落形态Figure 1 Colony morphology of 13 Botrytis cinerea strains on different media

表3 13株葡萄灰霉病菌生长速率Table 3 Growth rate of 13 Botrytis cinerea strains cm·d-1

2.2 葡萄灰霉病的产孢量差异

在表4中，除BC13外，其他12株菌株均能产生分生孢子，其分生孢子形状为卵圆或椭圆形。其中菌株BC12的产孢量最多，为6.32×107cfu·mL-1。

打取直径为5 mm的葡萄灰霉病菌饼接种于PDA培养基中，25 ℃黑暗培养30 d后测定菌核数量和大小，各处理重复3次。

表4 13株葡萄灰霉病菌的产孢量和微菌核Table 4 Spore production of 13 Botrytis cinerea strains

2.3 葡萄灰霉病菌微菌核形态差异

由表4和图2可知，13株葡萄灰霉病菌单孢菌株中，只有菌株BC7和BC13不产生菌核，其余11株都可产生微菌核。菌株BC8产生的菌核数最多，颜色为灰黑色、每皿菌核数量387个，直径为1～2.8 mm。其次是菌株BC11产生的菌核颜色为黑色、每皿菌核数量109个，直径为2～5 mm。菌株BC9和菌株BC12产生的菌核数较少，颜色均为黑色，菌株BC9每皿菌核数量2个，直径为1～1.7 mm，菌株BC12每皿菌核数量2个，大小为1～4 mm。

图2 13种葡萄灰霉病菌微菌核产生情况Figure 2 Microsclerotia production of 13 species of Botrytis cinerea

2.4 不同葡萄灰霉病菌的致病力差异

病情指数=(∑各级病果穗或果粒数×病害级别数)/(调查总果穗或果粒数×9)×100

表5 13株葡萄灰霉病菌致病性测定Table 5 Pathogenicity determination of 13 strains of Botrytis cinerea on the 5th day and 7th day

2.5 类群分析

3、棚温控制：下种后棚温白天保持在30～35℃之间，夜间保持在15℃以上，注意下种后棚内温度不能超过38℃以上，因为达到40℃高温时，种子不利于发芽。根据实践经验，幼苗出土后，如果温度超过26℃时，下胚轴会急速伸长，而形成高脚苗，所以幼苗拱土后，白天棚内温度降到25～22℃之间，特别要注意的是此时晚间棚内温度不能超过10℃以上，不能低于5℃，控制夜间苗不生长，棚内高温、高湿会导致幼苗徒长。第一片真叶见长后白天要适当加大棚内温度，温度白天保持在28～33℃之间，夜间5～10℃之间。真叶见长后喷一次“金元宝”液肥，可增加植株叶绿素含量及生根量，使幼苗生长旺盛健壮，提高幼苗抗寒能力。

图3 13株葡萄灰霉菌聚类分析图Figure 3 Cluster analysis of 13 strains of Botrytis cinerea

依据13株葡萄灰霉病菌在3种培养基上的生长速率和形态、产孢量、产微菌核情况、致病性差异将13株葡萄灰霉病菌单孢菌株划分为8个类群。其中菌株BC6、BC9、BC10和BC11归为Ⅰ类群，菌落表现为菌丝生长速率较快，菌丝浓密，既可以产生分生孢子又可产生菌核，其菌丝呈现灰白色的灰霉病菌类群。菌株BC2、BC5归为Ⅱ类群，菌落表现为菌丝生长速率较快，菌丝呈现灰白色，即产生分生孢子又产生菌核的灰霉病菌类群。菌株BC1和BC13归为Ⅲ类群，菌落表现为菌丝生长速率中等，菌丝较稀疏，菌丝颜色呈现灰白色的灰霉病菌类群，菌株BC1产生分生孢子量最低，BC13既不产生分生孢子也不产生菌核。菌株BC3归为Ⅳ类群，菌落表现为菌丝生长速率较慢，菌丝较稀疏，菌丝颜色呈现灰白色的灰霉病菌，即可产生分生孢子也可产生菌核。菌株BC4归为Ⅴ类群，菌落表现为菌丝生长速率较快，且菌丝稀疏，菌落颜色呈现灰白色的灰霉病菌类群，即可产生分生孢子也可产生菌核。菌株BC7归为Ⅵ类群。菌株BC8归为Ⅶ类群。BC7和BC8菌落表现均为菌丝生长速率较慢，且菌丝稀疏。在PDA培养基上培养30 d后BC7不产生菌核，BC4在培养28 d后产生菌核，BC8在培养29 d后产生菌核。菌株BC12归为Ⅸ类群，菌落表现为菌丝生长速率较快，且菌丝浓密，菌落颜色呈现灰白色的灰霉病菌类群，即可产生分生孢子也可产生菌核，产孢量最高。

巴志鹏认为，中国共产党的生态文明建设思想是对中国古代朴素的人与自然和谐观“天人合一”及朴素的自然伦理“仁民爱物”论等传统生态文化的扬弃和对马克思恩格斯的人与自然协调发展观的传承［19］。而荣开明则认为，生态文明建设思想的主要渊源，包括马克思主义生态文明理论，党的三代领导集体探索中国社会主义建设的论述和前期经验，国外有关生态文明建设的理念和经验，中华文明中的生态文明智慧［20］。

2.6 葡萄灰霉病菌的分子鉴定

通过对8 株代表性葡萄灰霉病菌的B C7 2 9、BChch、Rpb2和G3pdh进行扩增，结果都能够扩增出目的基因片段。由图4可知，分别将8株葡萄灰霉病菌代表菌株依据BC729、BChch、Rpb2和G3pdh四组基因序列构建的系统发育树。通过4组基因鉴定，证明其均为灰葡萄孢B. cinerea，但是8株葡萄灰霉病菌的基因碱基序列均有差异，与形态学类群划分结果一致。

图4 8株葡萄灰霉病菌菌株基因间的相关性热图及构建的系统发育树Figure 4 Correlation heat map and phylogenetic tree of eight strains of Botrytis cinerea

应用SDTv.1.2软件分析了8株代表性菌株与灰霉病菌株的BC729、BChch、Rpb2和G3pdh基因拼接序列间核酸的一致性。由图4可知，菌株BC9与其他灰霉病菌株之间的一致性为99.40%；菌株BC7与其他灰霉病菌株之间的一致性为99.50%～99.70%；菌株BC12与其他灰霉病菌株之间的一致性为99.20%～99.50%；菌株B C 1 3 与其他灰霉病菌株之间的一致性为99.40%～99.70%；菌株BC2与其他灰霉病菌株之间的一致性为98.90%～99.30%；菌株BC3与其他灰霉病菌株之间的一致性为99.0%～99.40%；菌株BC4与其他灰霉病菌株之间的一致性为99.10%～99.60%。

刚走到大街上，就看见村东边燃放了一个钻天猴，这个钻天猴钻得真叫一个高，摇头摆尾像火箭一样直冲上天去了，到了最高处还叭地响了一下。我心里就踏实了。这是我跟刘铁头约定的暗号，这说明他已经得手了，他和李金枝已经像钻天猴一样钻上天了。

3 讨论

灰葡萄孢（B. cinerea）可通过侵染葡萄植株的叶片、枝干、花和果实导致葡萄灰霉病的发生[15]。其侵染植株后，引起植株体细胞程序性死亡，从而破坏组织正常生长，属于植物致病的死体营养型病原真菌类型[16]。目前，喷施化学农药是防治灰霉病的主要方法[17]，但是灰葡萄孢为复合种，其种内不同类群之间的致病性和抗药性都存在很大的差异[18]，因此研究其类群划分对于灰霉病的有效防治非常重要。

目前常利用形态学和致病性鉴定对病原菌进行类群划分[19]。黄燕等[20]对来源于中国6个不同地区的100株蚕豆灰葡萄孢B. fabae进行形态学鉴定，根据菌落形态可分为菌核型、菌丝型和分生孢子型，其中76个分离物为菌核型。周梓良[21]对湖北省17个地区采集的灰霉病样品进行离体叶片测定，将942株灰霉病菌的致病力分为强致病力和弱致病力两类，其中强致病力（病斑直径＞10 mm）灰霉病菌的比例高达93.94%，而弱致病力菌株（病斑直径≤10 mm）的比例约为6.06%。王贺[22]通过致病性划分将54个水稻秆腐菌核病菌Helminthosporium sigmoideum划分为4个致病类群，并发现盐碱地区水稻秆腐菌核病病原菌致病性高于非盐碱地区。本研究以从宁夏贺兰山东麓地区不同葡萄品种葡萄灰霉病病果上分离的13株葡萄灰霉病菌，通过对比其在马铃薯葡萄糖琼脂培养基、燕麦琼脂培养基、改良马丁培养基三种不同培养基上的生长速率和形态、产孢量、微菌核和致病性差异划分为8个类群，比王忠兴[23]的划分更精确和细致。

单基因鉴定对于一些亲缘关系较近的种仍不能进行有效区分，因此普遍采用多基因分子鉴定[24]。Yan等[25]从我国6个省的葡萄园中分离得到34个菌株，通过多基因（ACT、ITS、GAPDH、TUB2和CHS）分析结合形态学分析表明，黑刺盘孢（Colletotrichum aenigma）、河北刺盘孢（C. hebeiensis sp. nov.）和炭疽菌属（C. viniferum）与我国葡萄炭疽病有一定关联。张佳等[26]根据草莓灰霉病菌（B. cinerea）的RPB2、G3PDH和HSP60的单基因和多基因系统发育分析结果发现，我国草莓灰霉病的病原菌至少包括3个系统发育种。侯圣凡等[27]对来自全国12个草莓产区的109株草莓根腐病样品通过分子鉴定、多基因序列（ITS-ACT-GAPDH-CALTUB2-CHS）联合鉴定发现，有27.5%的样品是由草莓炭疽根腐病病原菌胶孢炭疽菌复合种（Colletotrichum gloeosporioides complex）引起。本研究通过对8株代表性葡萄灰霉病菌的BC729、BChch、Rpb2和G3pdh进行扩增，表明都为灰葡萄孢，但是基因序列略有差异，验证了形态学划分的结果。

本研究对分离自宁夏贺兰山东麓不同葡萄品种的13株葡萄灰霉病菌通过形态学方法对其类群进行划分为8大类群，并通过分析BC729、BChch、Rbp2和G3pdh4个基因序列，对其进行多基因分子鉴定，显示这些菌株均为灰葡萄孢，但是碱基序列有差异，与形态学类群划分结果一致。本研究通过形态学观察和分子鉴定手法，明确贺兰山东麓地区灰霉病菌的种群结构，为该地区葡萄灰霉病的有效防治提供理论依据。