酿酒酵母及马克斯克鲁维酵母生理特性及应用研究

王靓贤，贾 鳗，李科先，冉 苒，康燕山，高林瑞

（云南大益微生物技术有限公司，云南 昆明 650000）

近年来，随着科技的发展和人们生活水平的提高，消费者在购买发酵食品时会越来越注重发酵食品的口感、风味、菌株来源等，因此西藏牦牛原料乳及发酵乳中的微生物成为广大科研工作者的研究热点，尤其是从乳制品中分离出来的目录内菌株，更是吸引了很多的学者对其进行深入研究[1-2]。

酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是一种单细胞生物，同时也是最重要的模式生物，其生长速度快、pH 适应性广、耐高渗透、高产酒精、富含多种营养元素、易于分离和培养的特性使酿酒酵母更方便在各领域进行研究及应用[3]。目前，酿酒酵母在日常食品生产中占据重要作用，一直作为面包、馒头、乳制品以及酿造葡萄酒和啤酒等产品的发酵菌株，可增加面包、馒头、酿造酒的营养价值、口感、风味[4-9]。近年来，酿酒酵母还进行注射疫苗抗原生产，使用重组型酿酒酵母进行HPV 和乙肝病毒抗原的培养纯化，安全且抗原得率高[10]。由于酿酒酵母具有安全性，还可与肠上皮细胞相互作用，诱发机体粘膜免疫应答等特性，有学者正在进行基于酿酒酵母表面展示技术构建寨卡（ZIKV）、甲型流感等病毒的口服疫苗的研究[11-12]。

马克斯克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus）由于普遍酒精产量不高，应用较少，在酸奶生产中易引起涨袋，需要遏制其生长[13-14]。马克斯克鲁维酵母目前对其的研究及应用相较于酿酒酵母均较少，但其菌株性能稳定，产香性能较好，发酵的食品感官较好，因此常常单独或与乳酸菌一起用于发酵乳制品，生产低酒精度、气味芳香怡人的奶啤、乳清等低醇发酵型风味饮料[15-16]；或进行纳豆、稀奶油等食品的发酵风味研究及工艺优化[17-18]；或进行混合发酵提升冰酒、黄酒的风味及感官品质[19-20]。

总而言之，酿酒酵母及马克斯克鲁维酵母具有重要的经济价值和科研意义，但目前对于马克斯克鲁维酵母的研究和应用都比较少见，而针对高原藏区来源的酵母菌的研究及应用就更为稀少。本研究中，以从高原藏区乳制品中分离得到的酿酒酵母及马克斯克鲁维酵母为生物材料，对其进行了生理特性及食品发酵方面的一系列研究，为后期研究及应用奠定基础且提供数据支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

2021年在云南大益微生物技术有限公司内，对多个藏区来源的酸奶进行分离，研究中使用的是其中分离保藏的7 株酵母菌，菌株具体信息见表1。

表1 菌株信息

1.2 试验方法

1.2.1 最适生长温度研究

将OD600=1.0 的菌悬液稀释后涂布于YPD 固体培养基上，分别放置于25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45℃条件下培养48 h 后取出计数。

将OD600=1.0 的菌悬液按1%比例接种于牛奶试管中，将牛奶试管分别置于25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃条件下培养24 h 后取出稀释涂布后计数。

1.2.2 碳源替换研究

将OD600=0.5 的菌悬液按1%体积比分别接种于葡萄糖、麦芽糖、D-木糖、乳糖、蔗糖YPD 液体培养基中，37℃培养32 h，期间每隔4 h 取样测量其OD600 值。

1.2.3 产气能力研究

将OD600=0.5 的菌悬液取100 μL 分别接种于含杜氏小管的YPD 液体培养基中，37 ℃培养24 h，取出观察产气现象。

1.2.4 溶血试验

于血平板上进行各菌株的划线，37 ℃培养48 h后取出观察有无溶血反应。

1.2.5 葡萄糖及乙醇耐受性测定

将OD600=0.5 的菌悬液按1%体积比分别接种于含20 g·L-1、40 g·L-1、60 g·L-1、80 g·L-1、100 g·L-1、120 g·L-1葡萄糖的YPD 液体培养基中，37 ℃培养，24 h 和48 h 时取出分别测定其OD600 值。

1.2.6 乙醇耐受性测定

将OD600=0.5 的菌悬液按1%体积比分别接种于含0%、1%、3%、6%、9%、12%、15%乙醇的YPD 液体培养基中37 ℃培养，24 h 和48 h 时取出分别测定其OD600 值。

1.2.7 牛奶发酵研究

将OD600=2.0 的菌悬液按1%体积比接种于奶茶及牛奶中，置于37 ℃条件下分别培养12 h、22 h、36 h取出，测定发酵前后pH 值，并进行风味评估。

1.2.8 茶汤发酵研究

将OD600=2.0 的菌悬液按1%体积比接种于茶汤中，置于37 ℃条件下培养12 h 取出，测定发酵前后pH 值，并进行风味评估。

2 结果与分析

2.1 7 株酵母菌生理特性研究

2.1.1 最适生长温度测定

由图1 可知，各菌株温度耐受存在一定差异，但35 ℃条件下长势均比较良好。在利用牛奶发酵时，各菌株温度耐受差异较大，综合来看40 ℃条件下长势较好，但其中菌株11783 随着温度升高活菌数不断增加，45 ℃时有效活菌数显著较高。

图1 7 株酵母菌最适生长温度测定

2.1.2 碳源替换生长曲线测定

由图2 可知，在碳源为常用的葡萄糖时，除菌株11708 外，其余6 株菌的菌株数量均在15 h 后无显著增加；在24 h 后菌株11708 生长略显缓慢，其菌株数量无明显增加；碳源替换后，7 株酵母菌对不同碳源表现出了显著的个体性差异，但均更能适应葡萄糖和蔗糖，且当碳源为蔗糖时，长势较葡萄糖更好。

图2 7 株酵母菌糖替换生长曲线

2.1.3 产气能力测定

由表2 可知，培养24 h 后，菌株11704、11708 无产气反应；菌株11714 产气较少；菌株11701、11703产气较多，杜氏小管中有一半气体；菌株11783、11595产气最多，气体充满整个杜氏小管。

表2 7 株酵母菌产气能力测定

2.1.4 溶血试验

由表3 可知，7 株酵母菌溶血反应均为阴性，表明7 株酵母菌均不产生可使红血球细胞溶解的溶血素。

表3 7 株酵母菌溶血试验

2.1.5 葡萄糖耐受性测定

由图3 可知，7 株酵母菌在培养时间为24 h 时，菌株11701、11703、11783 的OD600 值变化较大，在葡萄糖浓度为40 g·L-1时，OD600 值大幅下降，当浓度高于60 g·L-1后，OD600 值无显著变化；而在培养48 h 后，7 株菌中只有菌株11701 对培养条件中葡萄糖浓度较为敏感，当葡萄糖浓度高于40 g·L-1时，OD600值大幅降低，其余菌株无较大变化。

图3 葡萄糖耐受性测定

2.1.6 乙醇耐受性测定

由图4 可知，7 株酵母菌中乙醇耐受最弱的为菌株11708，只能耐受3%以下的乙醇浓度，菌株11703、11704、11783、11595 耐受性稍好，在乙醇浓度为3%时，生长不受影响，浓度为6%时，表现为不耐受，而菌株11714 及11701 耐受性较好，可耐受6%的乙醇浓度，其中耐受性较强的菌株11701，6%乙醇浓度对其生长无明显影响。

图4 乙醇耐受性测定

2.2 食品发酵研究

2.2.1 牛奶发酵

由图5 可知，从开始发酵后，随着时间的推移，各处理pH 值均呈现下降趋势，发酵12 h 后均有一定程度的降低，但各处理间差异并不明显；发酵22 h 后pH值继续降低，其中菌株11701、11783 较低，pH 值分别为5.70、5.50；发酵36 h 后各处理pH 值均在6.0 以下，其中菌株11701、11595、11783 较低，pH 值分别为5.67、5.56、4.86。

图5 牛奶发酵前后酸碱度变化

在进行牛奶发酵时，随着发酵时间的延长，7 株酵母菌均出现凝固现象，除菌株11703、11708 无乳清析出外，其余处理均有乳清析出现象；在风味口感方面，菌株11704 风味不佳，发酵12 h 后，菌株11701、11714、11783 具有奶啤风味且气泡感强，其余均为普通乳酸饮品风味；而随着发酵时间的延长，最终均为奶啤风味。

2.2.2 茶汤发酵

由图6 可知，生普洱茶汤发酵12 h 后，各处理pH均有显著下降，除菌株11783 pH 值为5.19 外，其余均下降至5.0 以下，菌株11701、11703 较低，pH 值分别为4.54、4.47。熟普洱茶汤发酵12 h 后，各处理pH 也呈现下降趋势，其中菌株11714、11783 较低，pH 值分别为4.51、4.43。

图6 茶汤发酵前后酸碱度变化

7 株酵母菌均能在生茶、熟茶茶汤中生长，在发酵12 h 后，均有明显产气现象，其中，菌株11701、11704、11714、11783 风味较佳，同时具有茶香与酒香，两种香气较为协调，且有气泡感。

3 结论

本研究7 株酵母菌代谢物均无溶血素，对人体无害，其生理特性符合一般酵母菌特征，与李新玲等人的结果一致[16]。对牛奶及茶汤发酵试验结果进行分析，菌株11701、11703、11714、11783 发酵牛奶具有奶啤风味且气泡感强，菌株11701、11704、11714、11783风味较佳，同时具有茶香与酒香，两种香气较为协调，且有气泡感，最终得出菌株11701、11703、11704、11714、11783 的发酵特性更适宜进行后期的相应研究及应用，但其不能耐受>6%的乙醇，按照一般乙醇耐受分类，可划分为乙醇耐受能力差[21]。而针对菌株乙醇耐受性差的问题，目前已有许多提高酵母菌乙醇耐受性的研究，例如利用乳酸菌共培养、原生质体融合、紫外线照射、基因重组技术等方法都可以针对性的提高酵母菌对乙醇的耐受性[21-23]，到时可根据不同用途及发酵条件再选取具有相应特性的菌株。

本研究中，以从高原藏区乳制品中分离得到的酿酒酵母及马克斯克鲁维酵母为生物材料，对其进行了生理特性及食品发酵方面的一系列研究，发现菌株11701、11703、11704、11714、11783 较为适宜进行低醇风味乳制品或者茶酒的发酵，也再一次证实马克斯克鲁维酵母在发酵风味上的优越性，为日后深入研究并将菌株应用于乳制品或其他发酵食品的生产中奠定了基础且提供了数据支撑，以便未来实现产学研一体化，从而达到实现真正意义上的以科研服务企业、服务消费者。