基于ctDNA的分子残留病灶检测对非小细胞肺癌根治术后生存的预测效能

晨正宇,周 薇,熊 婧,李 强,赵巧丹,梁 栋，艾 成 （.重庆医科大学第一临床学院/重庆医科大学附属第一医院全科医学科/胸外科，重庆 40006；.重庆医科大学基础医学院，重庆 40006；.重庆医科大学附属璧山医院胸心外科，重庆 40760）

肺癌在全球所有恶性肿瘤中发病率仅次于乳腺癌，其中非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）在肺癌中占比高达80%[1]。肺癌根治术是外科治疗NSCLC的重要手段，但仅部分患者治愈或长期生存获益。既往研究显示，ⅠA~ⅢB期肺癌患者根治术后3年及5年生存率仅为54%和46%，说明根治术后肺癌患者的生存率仍较低[2]。术后复发和转移是NSCLC患者手术治疗失败和死亡的主要原因，研究显示，部分患者即使辅助放化疗，其术后2年复发率高达36%且复发患者病死率达83%[3]。目前，NSCLC术后常通过影像学检查、肿瘤标志物检测来监测肿瘤复发和转移，肿瘤标志物水平升高虽可早期发现肿瘤复发，但特异度不高，仍需结合影像学检查进一步明确，但当影像学检查发现复发病灶时患者肿瘤负荷已明显升高，治疗困难，患者病死率极高，因此具有一定局限性[4]。在影像学检查发现NSCLC复发前，找到能够有效预测肿瘤复发的标志物对指导临床早期治疗、提高患者生存率具有重要意义。分子残留病灶（minimal residual disease，MRD）概念来源于血液系统肿瘤，指治疗后传统实验室和影像学检查不能发现的癌来源分子异常。循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）是游离于血液中的肿瘤细胞DNA片段，可以跟踪肿瘤负荷状态，目前常以ctDNA作为MRD的检测指标，具有评估肿瘤治疗效果及预后的价值[5]。近年来研究发现，MRD与结肠癌、乳腺癌等实体瘤术后复发密切相关[6-7]，但其在肺癌中的作用有待进一步研究。故本研究基于ctDNA检测评估NSCLC患者根治术后MRD，并分析其对患者近远期生存的预测价值，以期为NSCLC临床早期预测、治疗提供参考。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选取2016年7月至2017年6月在重庆医科大学附属第一医院胸外科行肺癌根治术治疗的114例NSCLC患者作为研究对象。纳入标准：原发性NSCLC，且经病理检查证实；年龄>18岁；接受肺癌根治术治疗。排除标准：合并心、脑、肝、肾等重要器官疾病；合并其他恶性肿瘤；合并急性感染、免疫或血液性疾病；术前已发生远处转移；术前接受放化疗、免疫治疗等；术后病理检查示手术标本切缘阳性。本研究已通过重庆医科大学附属第一医院伦理委员会批准（201605-002），所有患者均对本研究知情同意。

1.2 方法

1.2.1 基于ctDNA的MRD检测 血样采集及处理：术后1周采集患者肘静脉血10 mL，并于2 h内4 ℃下3 000 r/min离心10 min，将上层血浆分装到离心管中，再次以3 000 r/min离心10 min，去除血细胞成分，将上层血浆保存到冻存管中备检。ctDNA的提取及检测：采用QIAsymphony DSP循环DNA试剂盒（德国Qiagen公司，批号：1103177）从血浆中提取游离DNA，采用NanoDrop 2000超微量分光光度计（美国Thermo Fisher Scientific）和PicoGreendsDNA定量检测试剂盒（美国Life Technologies公司，批号：2475382）检验游离DNA的质量和数量。文库构建及测序：采用NEBNext®Ultra™ DNA Library Prep Kit for Illumina®试剂盒构建文库，根据说明书在DNA片段中添加带有f'f唯一标识符的测序接头，采用IlluminaHiseq 3000平台对DNA进行测序，每个样本平均测序量为15 GB。生物信息学分析：采用GATK软件对测序所得reads信息与人类参考基因组hg19比对进行突变分析和注释，将突变丰度≥0.02%的DNA设定为ctDNA突变阳性检出标准，即检出MRD[8]。依据检测结果将患者分为MRD阳性组和MRD阴性组。

1.2.2 资料收集 收集NSCLC患者的基本信息（年龄、性别、吸烟史等）、病理资料（病理类型、分化程度、病理分期、肿瘤直径、纵隔淋巴结转移等）和治疗情况（手术方式、术后化疗）。

1.2.3 随访术后 采用电话或门诊复查定期对患者进行随访，术后前3年每3~6个月随访1次，之后每6~12个月随访1次，以2022年6月1日或患者死亡作为随访终点，统计患者近期（术后1年）、远期（术后5年）生存率。

1.3 统计学分析

采用SPSS 26.0统计学软件进行数据处理，计量资料以均数±标准差（）表示，组间比较采用独立样本t检验；计数资料以率（%）表示，组间比较采用χ2检验。绘制MRD阳性和阴性患者的Kaplan-Meier生存曲线，近远期生存率比较采用Log-rank检验；采用单因素和多因素Cox回归模型分析NSCLC患者术后近远期生存的影响因素。以患者术后随访结局为金标准，采用四格表法分析MRD检测对患者近远期生存的预测价值。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NSCLC不同临床病理特征患者MRD阳性率

114例NSCLC患者中有42例（36.84%）MRD阳性。低/未分化、肿瘤直径>3 cm、纵隔淋巴结转移、TNM分期ⅢA期的NSCLC患者MRD阳性率分别高于高/中分化、肿瘤直径≤3 cm、无纵隔淋巴结转移、TNM分期Ⅰ~Ⅱ期患者，差异有统计学意义（P<0.05），见表1。

表1 NSCLC不同临床病理特征患者MRD阳性率比较[例（%）]

2.2 MRD阳性和阴性患者近远期生存情况

114例患者术后1年生存率为83.33%（95/114），5年生存率为52.63%（60/114）；其中术后1年MRD阳性患者中25例存活、17例死亡，术后5年3例存活、39例死亡。Kaplan-Meier生存曲线显示，MRD阳性患者近远期生存率均低于MRD阴性患者（Log-rank χ2=28.987、83.630，P<0.001），见图1。

图1 MRD阳性和阴性患者术后远期Kaplan-Meier生存曲线

2.3 NSCLC根治术后近远期生存的影响因素分析

将患者性别（女=0，男=1）、年龄（≤65岁=0，>65岁=1）、吸烟史（无=0，有=1）、病理类型（腺癌=0，鳞癌=1，其他=2）、分化程度（高/中分化=0，低/未分化=1）、肿瘤直径（≤3 cm=0，>3 cm=1）、纵隔淋巴结转移（无=0、有=1）、TNM分期（Ⅰ~Ⅱ期=0，ⅢA期=1)、手术方式（开放式=0、胸腔镜=1）、化疗周期（≤2个周期=0，>2个周期=1）、术后MRD阳性（否=0，是=1）作为自变量，将患者近远期生存情况（生存=0，死亡=1）作为因变量进行单因素分析，将单因素分析中差异有统计学意义的变量纳入Cox模型中进行多因素逐步回归分析，结果显示：低/未分化、肿瘤直径>3 cm、TNM分期ⅢA期、术后MRD阳性均是影响NSCLC根治术后患者近远期生存的危险因素（P<0.05），纵隔淋巴结转移是影响NSCLC根治术后远期生存的危险因素（P<0.05），见表2。

2.4 MRD对NSCLC根治术后近远期生存的预测价值

以NSCLC患者根治术后随访生存结局作为金标准，探讨术后MRD检测结果作为预测指标的价值，结果显示术后MRD预测患者术后近期生存的灵敏度、特异度、准确度分别为73.68%（70/95）、89.47%（17/19）、76.32%（87/114），预测远期生存的灵敏度、特异度、准确度分别为95.00%（57/60）、72.22%（39/54）、84.21%（96/114）。

3 讨论

在全球范围内，我国是肺癌发病例数最多的国家，随着手术、放化疗等肿瘤治疗技术不断发展，肺癌病死率有所下降[9]，但NSCLC患者近远期生存率仍不高，本研究中NSCLC患者术后1年、5年生存率仅为83.33%、52.63%。近年来液态活检技术在恶性肿瘤中的应用备受关注，国内外已有研究证实血液中ctDNA在肿瘤诊疗、MRD和预后评估中具有巨大潜力[10-12]。因此，基于ctDNA对NSCLC患者进行MRD检测来预测其术后生存情况具有重要意义。

既往相关研究报道，胃癌Ⅰ~Ⅱ期、Ⅲ期患者ctDNA阳性率分别为21%、68%，胰腺癌转移患者ctDNA阳性率为78.3%，宫颈癌患者ctDNA阳性率为33.3%，且在胃癌、宫颈癌不同病理分期、肿瘤直径、浸润程度中存在差异[13-15]，提示不同类型恶性肿瘤ctDNA阳性率也有差异。目前普遍认为ctDNA主要来源于肿瘤原发灶、转移灶、循环肿瘤细胞等，含有拷贝数变异、缺失、重排、甲基化等肿瘤基因突变信息，多因肿瘤细胞破裂或凋亡时释放入血，且取材方便、检测无创、半衰期不到2 h，能够实时反映肿瘤负荷和突变信息，监测治疗后MRD变化情况[16]。因此，本研究基于ctDNA检测MRD，结果显示NSCLC患者根治术后MRD阳性率为36.84%，且低/未分化、肿瘤直径>3 cm、纵隔淋巴结转移、TNM分期ⅢA期的NSCLC患者MRD阳性率分别高于高/中分化、肿瘤直径≤3 cm、无纵隔淋巴结转移、TNM分期Ⅰ/Ⅱ期患者，提示MRD阳性率与NSCLC分化程度、大小、分期、淋巴结转移等有关。考虑可能为低/未分化肿瘤恶性程度高，不仅生长速度快，还容易发生侵袭、转移，即使通过手术切除局部病灶，机体残留癌细胞的可能较大，导致ctDNA含量较高；肿瘤大小与肿瘤浸润、肿瘤分期相关，并且肿瘤的生长依赖血管生成，随着肿瘤增大，新生血管增多，进入血液循环的肿瘤细胞增多[17]；有淋巴结转移的患者手术难以清扫所有转移的淋巴结，残留的转移淋巴结亦会通过体液循环散播，导致ctDNA含量增加；TNM分期综合肿瘤大小、浸润深度、侵犯范围等评估肿瘤进展程度，分期越晚越有可能存在浸润和转移，术后肿瘤细胞残留可能性越大，故MRD阳性率也越高。

本研究采用Kaplan-Meier生存曲线比较MRD阳性和阴性患者的近远期生存率发现，MRD阳性患者近远期生存率均显著低于MRD阴性患者；经Cox回归分析发现，术后MRD阳性、低/未分化、肿瘤直径>3 cm、TNM分期ⅢA期等均是影响患者近远期生存的危险因素。术后MRD阳性提示NSCLC患者术后仍有肿瘤细胞残留，这些肿瘤细胞携带有原始肿瘤细胞的突变基因，仍有可能导致肿瘤复发和进展。Tie等[18]研究显示，结肠癌术后ctDNA检测示MRD阳性是影响无复发生存期的独立危险因素（HR=3.8），本研究结果与之相符，证实MRD与肿瘤患者生存率密切相关，是肿瘤预后的标志物。Chaudhuri等[19]通过检测治疗后ctDNA识别MRD评价肺癌患者预后发现，72%的患者在CT检查出肿瘤直径增大前行ctDNA检查即检测到MRD，MRD阳性患者3年内均发生疾病进展，MRD阳性患者无进展生存率和总生存率均明显低于阴性患者，说明基于ctDNA的MRD检测是早期识别肺癌治疗后进展的重要方法，可能对术后生存具有预测价值。故本研究进一步分析术后MRD预测NSCLC患者根治术后近远期生存的价值，发现其预测近、远期生存的灵敏度、特异度、准确度均较高，表明术后MRD检测对NSCLC术后生存具有重要预测价值。

综上，术后基于ctDNA检测MRD阳性是影响NSCLC患者根治术后近远期生存的危险因素，有助于术后早期预测患者近远期生存率。但本研究中ctDNA检测费用较高且操作复杂，开展大样本量研究较为困难；NSCLC根治术后常需辅助治疗清除残留病灶，ctDNA检测结果可能会发生变化，故在术后可连续监测ctDNA评估MRD，以指导临床早期调整治疗方案，尽可能改善患者预后。