lncRNA NEAT1通过抑制miR-let-7a激活BZW2促进喉乳头状瘤细胞的增殖和凋亡逃逸

张 波,王 松,阿依恒·曲库尔汗 （新疆医科大学第一附属医院耳鼻喉科，新疆 乌鲁木齐 830054）

喉乳头状瘤（laryngeal papilloma,LP）是一种常见的良性肿瘤，主要影响10岁以下儿童[1]，一般认为人乳头瘤病毒（human papilloma virus,HPV）感染是主要原因[2]。LP患者可能出现异物感、吞咽困难、呼吸困难或口齿不清等症状[1]。目前，手术是LP的标准治疗方法，包括手术切除、CO2激光切除和内镜下切除。LP虽然是良性肿瘤，但在儿童中肿瘤生长较快，易复发，且其发展机制尚不清楚[3]。因此，有必要深入研究LP发生发展的分子机制。

长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）是由200多个核苷酸组成且不编码蛋白的RNA分子[4]，在肿瘤发生和进展中具有关键作用[5-7]。研究表明，长链非编码RNA核富集转录本1（nuclear enriched abundant transcript 1,lncRNA NEAT1）在喉癌中通过吸附抑制miR-204-5p促进其靶基因轴突导向因子4B（semaphorin 4B,SEMA4B）的表达从而诱导喉癌细胞的增殖和侵袭[8]。然而，lncRNA NEAT1在LP中的作用和调控机制仍不清楚。

miR-let-7a最早是在线虫研究过程中发现的一种高度保守的微小RNA，已被证明可抑制宫颈癌和肝癌等多种肿瘤的进展[9-10]。研究显示，miR-let-7a可靶向抑制碱性亮氨酸拉链和W2结构域2（basic leucine zipper and W2 domains 2，BZW2）的表达，从而抑制肝癌细胞的迁移和侵袭[10]。然而，miR-let-7a/BZW2轴是否在LP中起作用尚不清楚。

本研究从lncRNA NEAT1在LP细胞中的表达以及对miR-let-7a和BZW2的作用入手，探讨lncRNA NEAT1对LP细胞的增殖和凋亡逃逸的机制。

1 材料与方法

1.1 试剂与耗材

人喉乳头状瘤细胞Hs840.T及人口腔上皮细胞（human oral epithelial cells,HOECs）均购于美国典型培养物保藏中心。DMEM购于美国Gibco公司。10%胎牛血清购于美国Thermo Fisher Scientific公司。TaqMan human miRNA检测试剂盒、TRIzol购于美国Invitrogen公司。Power SYBR Green购于日本Takara公司。lncRNA NEAT1的过表达重组载体pcDNA3.1（+）-lncRNA NEAT1（pcDNA-NEAT1）以及 pcDNA-NEAT1阴性对照（pcDNA-NC）、沉默lncRNA NEAT1的小干扰RNA载体（siNEAT1）以及 siNEAT1的阴性对照（siNC）、miR-let-7a的模拟物（mimic）、mimic的阴性对照（mimic-NC）、miR-let-7a抑制剂（inhibitor）、inhibitor阴性对照（inhibitor-NC）、BZW2的小干扰RNA载体（siBZW2）以及siBZW2的阴性对照（siBZW2-NC）均购于上海Genepharm公司。lipofectamine 3000转染试剂盒购于美国Invitrogen公司。Prime Script RT试剂盒和SYBR Green Real Time PCR试剂盒均购于日本Takara公司。RIPA缓冲液和MTT测定试剂盒购于上海Beyo‑time公司。细胞裂解缓冲液购于美国Sigma公司。PVDF膜购于美国Millipore公司。ECL试剂盒购于美国Bio-Rad公司。兔抗BZW2、GAPDH的一抗和相应的羊抗兔二抗均购于英国Abcam公司。

1.2 细胞培养和转染

Hs840.T和HOECs用DMEM培养基培养，HOECs作为Hs840.T中lncRNA NEAT1、miR-let-7a、BZW2表达检测的对照细胞。

pcDNA-NEAT1、siNEAT1、siNEAT1、mimic、inhibitor、siBZW2以及各自的阴性对照组均基于lipofectamine 3000转染试剂盒说明书转染指定的质粒。针对 lncRNA NEAT1特定的siRNA序列是5'-GAGGGAUGAGGGUGAAGAA-3'。将Hs840.T分为pcDNA-NEAT1组、pcDNA-NC组、siNEAT1组、siNC组、mimic组、mimic-NC组、inhibitor组、inhibitor-NC组、siBZW2组、siBZW2-NC组、pcDNA-NEAT1联合siBZW2给药（pcDNA-NEAT1+siBZW2）组和 pcDNANEAT1联合siBZW2-NC给药（pcDNA-NEAT1+siBZW2-NC）组。

1.3 qRT-PCR检测lncRNA NEAT1和miR-let-7a的表达

收集正常培养的Hs840.T和HOECs以及1.2中Hs840.T的各处理组细胞，按照说明书用TRIzol试剂提取总RNA。根据Prime Script RT试剂盒说明书合成互补DNA（cDNA），采用茎环法合成miR-let-7a的cDNA。并根据SYBR Green Real Time PCR Kit的说明书检测lncRNA NEAT1、miR-let-7a和BZW2的相对表达水平，反应体系：1 μL cDNA、上下游引物各0.5 μL、10 μL SYBR Premix Ex Taq、8 μL ddH2O。反应条件：95 ℃预变性 5 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 34 s，共 40个循环。GAPDH为lncRNA NEAT1和BZW2的内参，U6为miR-let-7a RNA 的内参。相对表达量采用 2-ΔΔCt法计算。引物序列见表1。

表1 引物序列

1.4 Western blot检测BZW2的表达

收集正常培养的Hs840.T和HOECs以及1.2中Hs840.T的各处理组细胞，用RIPA缓冲液进行裂解，使用SDS-PAGE凝胶电泳（90 V 30 min,120 V 1 h）分离收集的细胞裂解物，然后用湿法转移至PVDF膜上（400 mA,2 h）。使用5%脱脂牛奶封闭2 h，洗涤后用BZW2一抗（1∶500）4 ℃孵育16 h。洗涤后用辣根过氧化物酶偶联的二抗室温孵育2 h。内参蛋白为GAPDH。采用ECL对蛋白条带进行显色并成像。Image J分析各组条带的灰度值。

1.5 双荧光素酶报告基因实验

lncRNA NEAT1和miR-let-7a及miR-let-7a和BZW2的碱基结合位点用StarBase数据库进行预测分析。进一步验证lncRNA NEAT1和miR-let-7a及miR-let-7a和BZW2的靶向关系。含预测miR-let-7a结合位点的野生型（WT）和突变型（MUT）lncRNA NEAT1和BZW2 3'-非翻译区（UTR）片段的荧光素酶转染载体均由上海吉玛公司构建。根据说明书将Hs840.T接种在6孔板中并使用lipofectamine 3000联合转染mimic和NEAT1 WT/NEAT1 MUT以及mimic和BZW2-WT/BZW2-MUT。转染后48 h收集细胞，使用双荧光素酶报告基因分析系统（美国Promega公司）分析lncRNA NEAT1和BZW2的荧光素酶活性。

1.6 细胞增殖实验

采用MTT测定细胞增增殖率。将各组处理好的Hs840.T接种于96孔板，培养4 h后与MTT试剂混合再维持4 h，弃上清，加DMSO溶解甲瓒。使用多板读数器（美国Bio-Rad公司，680型）检测570 nm波长处的吸光度。

1.7 Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞的凋亡情况

采用Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒检测Hs840.T的凋亡情况。将每组1×105个Hs840.T重悬于500 μL Annexin结合缓冲液，然后用5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI标记，室温下避光孵育15 min。用流式细胞仪（美国MilliporeSigma公司）检测绿色（Annexin V-FITC）和红色（PI）荧光。检测波长为488 nm，发射波长为530 nm。

1.8 统计学分析

采用GraphPad PRISM 5.01软件对数据进行统计学分析，符合正态分布的数据以均数±标准差（-x±s）表示。Pearson相关性分析法分析Hs840.T中lncRNA NEAT1与miR-let-7a表达的相关性。2组间的数据差异采用t检验。多组间比较采用单因素方差分析（ANOVA），然后进行LSD-t多重比较。检验水准为α=0.05，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 lncRNA NEAT1、miR-let-7a、BZW2 在 HOECs和Hs840.T中的表达

qRT-PCR实验结果显示，Hs840.T中的lncRNA NEAT1、BZW2 mRNA表达高于HOECs（P<0.05），而Hs840.T中 miR-let-7a的表达低于 HOECs（P<0.05），见图1a~c。Hs840.T中BZW2蛋白水平高于HOECs（P<0.05），见图1d。

图1 Hs840.T和HOECs中lncRNA NEAT1、miR-let-7a和BZW2的表达

2.2 LP细胞中lncRNA NEAT1作为分子海绵吸附miR-let-7a

Hs840.T中lncRNA NEAT1与miR-let-7a的表达呈负相关，见图2a。与pcDNA-NC组比较，pcDNA-NEAT1组中lncRNA NEAT1的表达水平显著升高（P<0.05），而miR-let-7a的表达水平显著降低（P<0.05），见图2b、c。而与siNC组比，siNEAT1组中lncRNA NEAT1的表达水平显著降低（P<0.05），miR-let-7a的表达水平显著升高（P<0.05），见图2d、e。

图2 lncRNA NEAT1吸附抑制Hs840.T中的miR-let-7a

从StarBase数据库中查询到lncRNA NEAT1包含miR-let-7a的互补位点，见图2f。双荧光素酶报告基因实验结果显示，Hs840.T中转染mimic导致NEAT1 WT的荧光素酶活性被抑制（P<0.05），而NEAT1 MUT的荧光素酶活性无显著变化（P>0.05），见图2g。

2.3 lncRNA NEAT1通过抑制miR-let-7a上调BZW2

Hs840.T中BZW2与miR-let-7a表达呈负相关（P<0.05），而与lncRNA NEAT1呈正相关（P<0.05），见图 3a、b。与 pcDNA-NC 组比，pcDNA-NEAT1组中BZW2的表达显著增加（P<0.05），见图3c、d。与siNC组比，siNEAT1组中BZW2的表达显著减少（P<0.05），见图 3e、f。与 mimic-NC 组比，mimic组中 lncRNA NEAT1的表达无显著变化（P>0.05），miR-let-7a的表达显著增加（P<0.05），而BZW2的表达显著减少（P<0.05），见图3g~j。与inhibitor-NC组比，inhibitor组lncRNA NEAT1的表达无显著变化（P>0.05），miR-let-7a的表达显著减少（P<0.05），而BZW2的表达显著增加（P<0.05），见图3k~n。

从StarBase数据库中查询到BZW2的3'UTR序列包含miR-let-7a的互补位点，见图4a。另外，双荧光素酶报告基因实验结果显示，Hs840.T中转染mimic导致BZW2-WT的荧光素酶活性被抑制（P<0.05），而BZW2-MUT的荧光素酶活性无显著变化（P>0.05），见图4b。说明BZW2是miR-let-7a的靶基因。

图4 lncRNA NEAT1吸附抑制Hs840.T中的miR-let-7a

2.4 lncRNA NEAT1促进LP细胞增殖及凋亡逃逸

pcDNA-NEAT1组Hs840.T的增殖率为（97.33±4.12）% ，高 于 pcDNA-NC 组 的（91.56±2.63）%（t=6.369,P=0.009）。siNEAT1组Hs840.T的增殖率为（76.89±4.58）%，低于 siNC 组的（92.03±5.32）%（t=10.230,P=0.001）。

Annexin-V FITC/PI实验结果显示，pcDNA-NEAT1组的早期凋亡率（0.16 ±0.02）%低于pcDNA-NC组的（0.43±0.02）%（t=5.966,P=0.031）。 pcDNA-NEAT1组的晚期凋亡率（0.33±0.04）%低于pcDNA-NC组的（0.62±0.05）%（t=6.230,P=0.011）。另外，siNEAT1组的早期凋亡率（30.07±2.01）%高于siNC组的（0.46±0.03）%（t=10.330,P=0.001）；siNEAT1组的晚期凋亡率（7.12±0.95）%高于 siNC 组的（0.54±0.07）%（t=9.623,P=0.002）。

2.5 lncRNA NEAT1通过激活BZW2促进LP细胞增殖及凋亡逃逸

与pcDNA-NEAT1+siBZW2-NC组比较，pcDNANEAT1+siBZW2组的BZW2 mRNA和蛋白表达都明显降低（P<0.001），见图5a、b。MTT结果显示，pcDNANEAT1+siBZW2组中 Hs840.T的增殖率（68.26±7.11）%明显低于 pcDNA-NEAT1+siBZW2-NC组的（96.30±4.62）%（t=8.569,P=0.002）。

图5 lncRNA NEAT1通过激活BZW2促进LP细胞增殖及凋亡逃逸

pcDNA-NEAT1+siBZW2组中Hs840.T的早期凋亡率（2.45±0.31）%明显高于pcDNA-NEAT1+siBZW2-NC组的（0.11±0.01）%（t=9.882,P=0.001）。pcDNANEAT1+siBZW2组中Hs840.T的晚期凋亡率（12.35±0.95）%明显高于 pcDNA-NEAT1+siBZW2-NC组的（0.28±0.02）%（t=9.882,P=0.001）。

3 讨论

lncRNA NEAT1是癌症进展的关键分子，与HPV引起的多种肿瘤密切相关[11-12]。本研究通过体外实验发现了lncRNA NEAT1促进LP发展的关键证据。通过qRT-PCR、MTT、Western blot、流式细胞术等实验确定了lncRNA NEAT1过表达可以促进LP细胞增殖并抑制细胞的早期凋亡和晚期凋亡。通过StarBase数据库、qRT-PCR、Western blot实验以及双荧光素酶报告基因实验发现，lncRNA NEAT1通过分子海绵的作用直接吸附miR-let-7a并激活LP细胞中的BZW2。而敲低BZW2则阻断了lncRNA NEAT1诱导的LP细胞增殖，并挽救了细胞凋亡，敲低BZW2可以明显促进LP细胞的早期凋亡和晚期凋亡。表明lncRNA NEAT1通过调控miR-let-7a/BZW2轴促进细胞增殖和凋亡逃逸从而在LP中发挥致癌作用，本研究为LP的治疗提供了潜在的靶点。

目前，关于lncRNA在LP中的作用报道极少。有研究表明，lncRNA LINC00174可以通过吸附抑制miR-4500促进BZW2表达，从而加速LP细胞增殖并抑制细胞凋亡[13]。在本研究中，lncRNA NEAT1在LP细胞中高表达，而且lncRNA NEAT1过表达促进了LP细胞增殖并阻碍了细胞凋亡，而lncRNA NEAT1沉默则显著阻止了细胞增殖，明显加剧了细胞的凋亡。证实了lncRNA NEAT1在LP中的致癌作用，表明lncRNA NEAT1与LP进展的调节有关。研究显示，lncRNA NEAT1在多种癌症中发挥关键作用。例如，癌症相关的成纤维细胞分泌的外泌体携带lncRNA NEAT1可以通过上调miR-26a/b-5p靶向STAT3信号通路促进子宫内膜癌的发展[14]；Shen等[15]证明了lncRNA NEAT1通过介导KDM5A/Cul4A和Wnt通路加速结直肠癌的恶性进展。本研究结果也证实lncRNA NEAT1在LP中具有致癌作用。

lncRNA通过分子海绵的作用吸附抑制miRNA从而发挥生物学作用。据报道，lncRNA 408通过海绵化miR-654-5p激活LIMK1信号通路，从而加速乳腺癌的转移和侵袭[16]，lncRNA MT1JP已被证明通过海绵化miR-24-3p增强肝癌细胞对乐伐替尼的耐药性[17]。此外，lncRNA ISG20通过抑制miR-486-5p促进活化T细胞核因子5的表达并诱导糖尿病肾病的肾纤维化[18]。

本研究也证实了lncRNA NEAT1含有miR-let-7a的互补位点。此外，本研究通过生物信息学分析、lncRNA NEAT1对miR-let-7表达的调控作用分析以及双荧光素酶报告基因实验，证明了LP中lncRNA NEAT1在功能上吸附miR-let-7a从而抑制miR-let-7a的表达。此外，本研究发现，BZW2是miR-let-7a的靶基因，也可以被lncRNA NEAT1直接上调。在过表达lncRNA NEAT1的基础上沉默BZW2明显抑制了过表达lncRNA NEAT1导致的LP细胞增殖和凋亡逃逸，证实BZW2是lncRNA NEAT1和miR-let-7a的关键功能性下游靶点，表明lncRNA NEAT1通过促进BZW2信号通路激活了LP的恶性行为。

综上所述，本研究发现lncRNA NEAT1在LP细胞中发挥致癌作用，并通过直接调控miR-let-7a/BZW2轴促进细胞增殖并加快细胞凋亡逃逸，可作为诊断和治疗LP的潜在靶点。