PEX 基因转染人脐带间充质干细胞的体外培养及鉴定

谢 炯，戚 继

（北京丰台医院神经外科，北京 100000）

胶质瘤（glioma）是神经系统发病率最高、预后不佳的原发性脑肿瘤，胶质母细胞瘤（glioblastoma，GBM）是胶质瘤中恶性程度最高的一种，即使采用手术及同步放化疗的标准治疗方法，患者的一般生存期仅为14.4 个月左右[1]。因血脑屏障的存在，很多药物无法准确到达肿瘤病灶，但具有跨血脑屏障特性的人脐带间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells，HuMSCs）可以作为细胞载体有效地将所需药物及目的基因送到靶向部位[2]，进而提高胶质瘤的治疗效果。PEX 基因能够干预恶性胶质瘤的侵袭行为，在胶质瘤基因治疗中具有很好的临床应用前景。本研究主要探讨PEX 基因修饰HuMSCs 的可行性，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 HuMSCs（天津和泽生物科技有限责任公司提供），U87 胶质瘤细胞（中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心），DMEM/F-12 培养基（美国GIBCO 公司），FBS（以色列BI 公司），胰蛋白酶（美国AMRESCO 公司），EDTA（美国Sigma 公司），青/链霉素霉素溶液（Solarvio 公司），质粒pcDNA3.1（+）（Invitrogen），JM109 高效率感受态细胞、pGEM®-T Easy 载体、RNA 提取试剂盒、逆转录试剂盒、小提质粒试剂盒、G418、转染试剂FuGENE®HD、HEPES（Promega 公司），Xho Ⅰ、BamHⅠ、T4 DNA 连接试剂盒（日本TaKaRa 公司），Universal DNA Purifieation Kit DNA 纯化回收试剂盒、大提质粒试剂盒（北京艾德莱公司），FITC 标记小鼠抗大鼠CD19、CD34、CD90、CD45、CD105 单克隆抗体（BD Biosciences 公司），引物由Invitrogen 公司合成，其它常规试剂为进口分装或国产分析纯。

1.2 HuMSCs 培养鉴定与U87 胶质瘤细胞培养 将HuMSCs 和U87 细胞分别接种于面积为75 cm2的细胞培养瓶中，加入10%胎牛血清的DMEM 培养基，置入37 ℃，5% CO2培养箱中培养，每48 h 换一次培养基。当有约90%左右的细胞贴壁生长时传代培养，传代时向培养瓶中加入0.25%的胰蛋白酶消化1.5 min 后弃去消化液，加入含10%胎牛血清的DMEM 培养液终止消化，吹打冲洗成细胞悬液，将细胞悬液置入15 ml 离心管中于室温下，1500 rpm/min离心5 min；弃去上清液，加入2 ml 全培养反复吹打冲洗成细胞悬液。以1∶3 传代接种到75 cm2的细胞培养瓶中，后项培养瓶中加入全培养基约至10 ml，置入37 ℃，5% CO2培养箱中培养。取传代至第3 代HuMSCs，待细胞长满80%～90%时，应用流式细胞仪检测细胞CD11b、CD19、CD34、CD73、CD90、CD45、CD105 表面抗原的表达。

1.3 PEX 真核表达载体构建与鉴定 参照GenBank中MMP-2 碱基序列（NM-031054），设计PEX 正反引物：正向引：5'-CCGCTCGAGAGATCTGCAAGCAAGACAT-3'，反向引物：5'-CGGGATCCGCAGCCCAGCCAGTCCGATT-3'，产物为582 bp。分别加入XhoⅠ、BamHⅠ酶切位点（引物中划线部分）。采用Promega 公司的RNA 提取试剂盒从U87 胶质瘤细胞中提取总RAN，按RT-PCR 试剂盒操作步骤扩增目的基因，退火温度为60 ℃，PCR 产物经纯化回收后，与单克隆pGEM®-T Easy 载体连接，转化JM109 高效率感受态细胞，经LB/Amp 培养基和蓝白（IPTG/X-Gal）筛选挑取阳性克隆进行细菌培养。以菌液为模板，按RT-PCR 体外获取扩增PEX 基因。目的基因与质粒载体分别采用XhoⅠ、BamHⅠ进行双酶切，酶切后胶回收获得载体片段和目的基因片段，然后连接、转化，小抽质粒，酶切鉴定，并送菌液测序。

1.4 重组质粒转染HuMSCs 将对数生长期的第3 代HuMSCs 接种于24 孔培养板，37 ℃、5% CO2细胞培箱中培养。当细胞融合约80%时，用转染试剂Fu－GENE®HD 和重组质粒转染HuMSCs 细胞，具体步骤按照FuGENE®HD 转染步骤操作。设立未转染组、空载体转染作为对照。转染48 h 后，采用G418筛选（400 ng/μl），10 d 后以200 ng/μl 筛选，4 周后将筛选出的细胞培养扩增。以β-actin 为内参，RTPCR 法检测转染组和对照组PEX 基因表达表达的差异性。设计GAPDH 正反引物：正向引物：AGAAGGCTGGGGCTCATTTG；反向引物：AGGGGCCATCCACAGTCTTC；产物为258 bp。

2 结果

2.1 HuMSCs 的培养及鉴定 原代培养的HuMSCs 细胞呈长条状或长梭状，细胞随着培养时间的增加逐渐变长变大并贴壁完全，形态学变为扁平状，于传代后第5 天左右即可完全融合，呈放射状或者螺旋状生长（图1）。

图1 HuMSCs 细胞生长形态（螺旋状、发散型生长）（×40）

通过流式细胞学技术分别检测P5 代HuCMSCs，表面分子标志物结果显示各代均表达间充质干细胞标志CD73、CD90 和CD105，而不表达造血干细胞标志CD11b、CD19、CD34、CD45 和组织相容抗原HLA-DR，见图2。

图2 原代培养的HuMSCs 流式细胞仪检测结果

2.2 目的基因培养及重组质粒载体构建 RT-PCR 检测显示，目的基因PEX 位于DNA Maker 500～750 bp 的特异性条带（图3），说明成功培养PEX；同时，抽提质粒后双酶切鉴定显示，重组质粒PEX-pcDNA3.1（+）位于DNA Maker 5000 bp 的特异性条带，且重组质粒PEX-pcDNA3.1（+）双酶切后位于DNA Maker 500～750 bp 和5000 bp 两条特异性条带（图4），说明重组质粒构建成功，且成功转染HuMSCs；留取菌液测序，结果证实证实质粒载体PEX-pcDNA3.1（+）构建成功，见图5。

图3 目的基因PEX 的扩增

图4 抽提质粒后双酶切鉴定

图5 测序验证结果

2.3 重组质粒PEX-pcDNA3.1（+）表达情况 RTPCR 检测验证了重组质粒PEX-pcDNA3.1（+）成功转染HuMSCs，且在HuMSCs 中高表达。重组质粒转染HuMSCs 及经G418 筛选获得稳定表达PEX 基因的HuMSCs，其于紫外灯下可见分别位于DNA Maker 250～500 bp 和500～700 bp 产生两条特异性条带，与预期的GAPDH 及PEX 产物片段大小相符。转染组和对照组细胞的GAPDH 产物亮度相仿，而转染组细胞PEX 产物亮度较对照组明显增强（图6）。以G418 筛选（400 ng/μl），10 d 后以200 ng/μl 筛选，4 周后筛选出的细胞可稳定生长。

图6 RT-PCR 检测转染组和对照组HuMSCs 中PEX 基因的表达

3 讨论

研究发现[3，4]，几乎所有MMPs 在其羧基末端均含有1 个血红素结合蛋白样结构域，通过C 端和αvβ3 关联，激活其催化活性，产生C 端类血红素结合片断PEX。PEX 可抑制胶质瘤细胞、内皮细胞与成纤维细胞生长因2（FGF-2）、整合素αvβ3 以及玻连蛋白等的粘附，从而起到抑制胶质瘤和内皮细胞的迁移，进而达到抑制胶质瘤的生长和复发。有研究表明[5]，PEX 对体外培养的胶质瘤干细胞增殖有显著抑制作用。因此，PEX 在针对人脑胶质瘤侵袭性的治疗上具有很好的临床应用价值，但如何使PEX基因精确且有效的发挥抑瘤作用值得临床进一步研究和探索。

基因疗法作为治疗胶质瘤的一种新方式，如何寻找一种特异而有效性的靶向肿瘤细胞的载体，且可携带抗癌基因来跟踪并有效抑制肿瘤细胞有待探索。研究发现[6-8]，MSC 本身具有易于体外扩增、强大的迁移能力和趋瘤性、低免疫原性和免疫调节作用，因此移植细胞的免疫排斥轻微，从而极大地降低了移植风险，其作为靶细胞基因载体在治疗疾病中的作用越来越重要，并已成为最具临床前景的细胞治疗产品。Deng L 等[9]研究发现，TRAIL 的基因修饰MSCs 有抑制胶质瘤生长的特性。罗晓红等[10]成功构建了携带HGF 基因的BMSC，不仅可以稳定表达并可增强MSCs 增殖及迁移能力。李千会等[11]验证了VEGF 可稳定转染BMSCs 内并可稳定表达发挥作用。

BMSCs 虽然具有高度增殖能力及多向分化潜能，但在实际应用中，BMSCs 含量易受年龄因素影响，对供者有一定的创伤性，加之BMSCs 分离纯化的难度增加、病毒感染率高，限制了其在临床的应用。相比之下，HuMSCs 的来源广泛、成本低、取材方便、培养成功率较高、增殖能力强，并具有免疫原性低、免疫调节特性强的特点，使其成为一种潜在的、可大规模生产的神经损伤“修复剂”及神经炎症“调节剂”[12-14]。崔连旭等[15]研究验证了HuMSCs 有减少神经元细胞凋亡的作用。另外，HuMSCs 还具有多向分化、旁分泌、免疫调节、定向迁移、基因稳定易于转染等优势，不易引起宿主对移植细胞的免疫排斥反应等优点[16，17]。因此，HuMSCs 具有更大的应用潜能，可能成为BMSCs 的理想替代物，越来越受到临床关注[18]。

另有研究发现[19，20]，HuMSCs 也具有抑制肿瘤生长、选择性迁移到损伤组织的归巢能力，并可以通过释放有益的细胞因子促进自身组织的再生。已有学者研究PEX 基因修饰间充质干细胞治疗肿瘤研究[21-23]，结果发现PEX 不仅可以阻止胶质瘤细胞和内皮细胞的迁移，同时可以诱导内皮细胞的凋亡，进而抑制胶质瘤细胞和血管的增殖以及转移。因而，本研究拟构建携带抗瘤基因PEX 的HuMSCs 细胞载体，利用其不间断地表达、释放可溶性的抗瘤分子来治疗肿瘤，进而发挥抑制肿瘤生长，提高胶质瘤患者的生存周期。最终，本研究成功构建了PEXpcDNA3.1（+）真核表达载体，并将PEX 基因高效导入靶细胞，成功分泌出PEX 蛋白，使其不仅具有PEX 抗肿瘤血管形成、诱导凋亡和抑制肿瘤生长的作用，又兼有HuMSCs 示踪肿瘤的多重特性，为其在恶性胶质瘤的基因治疗开辟了一条新途径。该体系的构建为更深入地研究PEX 基因及HuMSCs 的作用提供了实验基础，为后续胶质瘤的靶向治疗提供了科学依据。

综上所述，本研究构建的PEX-pcDNA3.1（+）真核表达载体可用于转染HuMSCs，为进一步探讨其在胶质瘤治疗中的作用奠定了基础。