常春藤皂苷B 抗氧化活性研究

刘 鑫，温 健，李剑男

（长春中医药大学药学院，长春 130117）

常春藤皂苷B 是两头尖中重要的活性成分，但目前对其抗氧化活性研究较少，本研究以常春藤皂苷B 作为研究对象，采用电子自旋共振仪探究其对于烷基自由基、羟基自由基和DPPH 自由基的清除作用。同时以Vero 细胞作为研究模型，研究其对过氧化氢诱导的Vero 细胞的保护作用及其对细胞内活性氧生成速率的影响，探讨常春藤皂苷B 的抗氧化作用，为深入研究常春藤皂苷B 抗氧化的机制奠定基础。

1 试剂和仪器

两头尖药材购于吉林宏检大药房，经长春中医药大学姜大成教授鉴定为正品两头尖。TU1810 紫外可见分光光度计（普析，中国），核磁共振光谱仪（安捷伦，美国），酶联免疫测定仪（伯乐，美国），电子自旋共振光谱仪（JEOL，日本），2，2-偶氮二（2-甲基丙基咪）二盐酸盐（AAPH），2，2-二苯基-1-苦基肼（DPPH），α-（4-吡啶基-1-氧）硝酮（POBN），5，5-二甲基-1-二氢吡咯甲基氮芥（DMPO）（sigma，美国），其他试剂均分析纯。

2 实验方法

2.1 两头尖总皂苷的制备

取两头尖药材1 kg 粉碎，用60%乙醇冷浸法提取至提取液颜色消失，每次用7 倍量的乙醇放在恒温振床中，室温下以120 rpm 提取24 h。过滤，合并滤液并用旋转蒸发仪回收乙醇，将其水溶液加到大孔树脂D101 色谱柱中，蒸馏水除杂，以60%乙醇洗脱，洗脱至薄层检识为阴性，合并洗脱液，回收乙醇。

2.2 常春藤皂苷B 的纯化和结构鉴定

取两头尖总皂苷5 g，用硅胶柱色谱进行分离，以CHCl3-MeOH-H2O（6:1:3）作为洗脱剂进行洗脱，采用薄层色谱法检识并合并相同组分，之后采用薄层色谱法，以CHCl3-MeOH-H2O（7:3:1）做为展开剂进行纯化即得常春藤皂苷B。以C5D5N 为溶剂，采用JEOL JNM-ECP 600 MHz 核磁共振光谱仪测定化合物F2的H1-NMR 谱和C13-NMR 谱。

2.3 常春藤皂苷B 清除烷基自由基的活性研究

采用电子自旋共振仪检测两头尖总皂苷清除烷基自由基的活性。仪器参数如下Power：1 mmol·L-1；Amplitude：10×100；Modulation width：0.8 mT；Sweep width：10 mT；Sweep time：30 s；Time constant：0.03 s。向离心管中加入40 μL浓度分别为0.0625、0.125、0.25、0.5 mg·mL-1和1 mg·mL-1的两头尖总皂苷样品，然后加入60 μM的 DPPH 40 μL，混合均匀并室温下孵化120 s 后上机检测。

2.4 常春藤皂苷B 清除羟基自由基的活性研究

采用电子自旋共振仪检测两头尖总皂苷清除烷基自由基的活性。仪器参数Amplitude：2×100；Modulation width：0.2 mT，其余同2.3 项下。向离心管中加入20 μL 浓度分别为0.125 mg·mL-1、0.25 mg·mL-1、0.5 mg·mL-1和1 mg·mL-1的样品，然后加入0.3 mol·L-1DMPO 20 μL、10 mmol·L-1FeSO420 μL 和10 mmol·L-1H2O220 μL，混匀后室温孵化150 s 后上机检测。

2.5 常春藤皂苷B 清除DPPH 自由基的活性研究

采用电子自旋共振仪检测两头尖总皂苷清除DPPH 自由基的活性。仪器参数同2.3 项下。向离心管中加入浓度分别为0.25 mg·mL-1、0.5 mg·mL-1、1 mg·mL-1和2 mg·mL-1的样品40 μL，然后加入60 μmol·L-1DPPH 40 μL，混匀后室温孵化120 s 后上机检测。

2.6 常春藤皂苷B 对过氧化氢诱导的Vero 细胞的保护作用研究

将Vero 细胞接种到96 孔板后培养24 h。对照组加10 μL PBS 缓冲溶液，给药组分别加入25 μg·mL-1、50 μg·mL-1和100 μg·mL-1的常春藤皂苷B 10 μL，培养1 h。然后对照组加10 μL PBS 缓冲溶液，给药组加10 μL 过氧化氢（最终浓度为1 mmol·L-1），放置在37℃、5% CO2及饱和湿度的培养箱中培养24 h，用酶标仪在540 nm 处测定各孔吸光度值。

2.7 常春藤皂苷B 对过氧化氢诱导的Vero 细胞的活性氧生成率的研究

将细胞接种到96 孔板后培养24 h。对照组加10 μL PBS 缓冲溶液，给药组分别加 25 μg·mL-1、50 μg·mL-1、100 μg·mL-1常春藤皂苷B 10 μL，培养1 h。然后对照组加10 μL PBS 缓冲溶液，给药组加10 μL 过氧化氢（最终浓度为1 mmol·L-1），培养30 min，之后加10 μL DCFH-DA（500 μg·mL-1），孵化2 h，用酶标仪检测荧光，激发波长为488 nm，发射波长为525 nm。

2.8 统计学方法

所有数据都采用SPSS 21软件进行统计学处理，采用t检验的方式进行数据分析。

2 实验结果

2.1 两头尖总皂苷的制备

经过冷冻干燥后两头尖总皂苷35.8 g，得率为3.6%。两头尖总皂苷呈白色无定型粉末，无臭无味。

2.2 常春藤皂苷B 的纯化和结构鉴定

常春藤皂苷B 为白色无定型粉末，无臭无味。采用JEOL JNM-ECP 600 MHz 核磁共振光谱仪测定，以C5D5N 为溶剂。H1-NMR 谱δ1.25（s，3H，CH3），1.18（s，3H，CH3），1.11（3H，s，CH3），1.11（3H，s，CH3），0.88（s，9H，3 个CH3）。1.65，1.74（各 3H，d，J = 5.9 Hz 和J = 5.05 Hz，鼠李糖的CH3），4.90 （1H，d，J -7.0 Hz 端H），4.77（1H，d，J =6.2 Hz，端基H），5.41（1H，brs，C12-H），5.93，6.21（各1H，brs，鼠李糖的端基H），6.28（1H，d，J =7.6 Hz，端基H）。C13-NMR 谱结果见表1。化学结构见图1。

图1 常春藤皂苷B

表1 常春藤皂苷B 碳谱化学位移表

2.3 常春藤皂苷B 清除烷基自由基、羟基自由基、DPPH 自由基的活性研究

常春藤皂苷B 清除烷基自由基活性半数抑制浓度IC50为0.123 mg·mL-1，羟基自由基活性半数抑制浓度IC50为0.204 mg·mL-1，DPPH 自由基活性半数抑制浓度IC50为0.439 mg·mL-1。本实验表明两头尖总皂苷具有良好的抗氧化作用。实验结果见图2、图3、图4。

图2 烷基自由基清除率

图3 羟基自由基清除率

图4 DPPH 自由基清除活性

2.4 常春藤皂苷B 对过氧化氢诱导的Vero 细胞的保护作用

在前期预实验过程中，发现当常春藤皂苷B 浓度＜100 μg·mL-1时对Vero 细胞没有明显的毒性。因此，在本实验中给药浓度控制在100 μg·mL-1以下。采用MTT 法检测不同浓度的常春藤皂苷B 对1 mM 的过氧化氢诱导的Vero 细胞损伤的保护作用。实验结果表明，过氧化氢减少细胞存活率至39.79%，然而常春藤皂苷B 处理组在浓度分别为25 μg·mL-1、50 μg·mL-1和100 μg·mL-1时其细胞存活率分别为42.20%、52.29%和55.11%。其IC50值为（52.29±1.87）μg·mL-1。本实验说明常春藤皂苷B 对于过氧化氢诱导的Vero 细胞氧化损伤具有良好的保护作用且呈现良好的量效关系。见图5。

图5 Vero 细胞存活率实验结果

2.5 常春藤皂苷B 对过氧化氢诱导的Vero 细胞的活性氧生成率的研究

本实验采用DCFH-DA 荧光法检测Vero 细胞中的活性氧生成率。实验结果表明，当Vero 细胞采用过氧化氢诱导后，细胞内活性氧生成率明显随着常春藤皂苷B 浓度的增加而减少。本实验说明常春藤皂苷B 对于过氧化氢诱导的Vero 细胞中活性氧的生成具有抑制作用且呈现良好的量效关系。见图6。

图6 Vero 活性氧生成率

3 讨论

两头尖为东北道地药材，在临床上具有广泛的应用[1]。在前期研究中我们发现，两头尖中的皂苷类成分具有抗氧化[2-3]、抗肿瘤[4-6]、抗炎[7-9]等活性，因此研究两头尖中皂苷类成分的化学组成具有重要意义。常春藤皂苷B 作为两头尖中一类重要的皂苷类成分，研究其生物活性对于具有现实意义。

本研究采用大孔吸附树脂和薄层色谱法对常春藤皂苷B 进行了分离纯化，并通过电子自选共振仪检测了常春藤皂苷B 的抗氧化活性。实验结果表明，常春藤皂苷B 对于烷基自由基、羟基自由基、DPPH自由基具有良好的清除作用，且随着总皂苷浓度呈量效关系。此外，本次实验还采用了过氧化氢诱导的Vero 细胞的氧化损伤模型评价常春藤皂苷B 的抗氧化效果。实验结果表明，常春藤皂苷B 能够显著提高过氧化氢诱导的Vero 细胞的存活率并降低细胞内活性氧的生成，从而保护细胞免受活性氧的伤害。

综上所述，本研究利用多种方式对常春藤皂苷B 的抗氧化活性进行了研究，结果发现其具有良好的抗氧化作用。但常春藤皂苷B 的抗氧化作用机制还需进一步研究。