肛周脓肿组织SBP1、IL-17表达与患者临床病理特征及预后的关系

罗蕾,黄鸿翔,庄怡青,唐英

肛周脓肿为临床常见的肛肠疾病,主要是由于细菌入侵导致肛管直肠周围软组织内或其周围间隙内的急性化脓性感染[1]。部分患者切开引流术后出现肛瘘或脓肿复发,给患者的身心、经济负担带来严重影响[2]。因此了解影响肛周脓肿患者预后的因素有利于及时进行干预,并提高患者的治愈率。研究显示,肛周脓肿组织中炎性分子的表达在肛周脓肿的发生、发展及预后评估中发挥重要作用[3-4]。硒结合蛋白1(selenium-binding protein1,SBP1)可通过一种未知的机制与硒结合,介导疾病的炎性反应状态而影响患者病情进展[5]。白介素-17(interleukin-17,IL-17)是一种促炎性细胞因子,主要诱导炎性因子的表达和诱发自身免疫病的炎性反应,在多种病原微生物所致的感染性疾病中起着重要作用[6]。现分析肛周局部组织中SBP1、IL-17表达与肛周脓肿患者临床病理特征的关系及对预后的影响,旨在为肛周脓肿患者的治疗及预后评估提供参考,报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2020年1月—2021月12月上海交通大学医学院附属新华医院日间病房手术治疗肛周脓肿患者120例作为肛周脓肿组,其中男87例,女33例,年龄24～60(39.01±4.87)岁;病程2～18(8.26±2.15)月;克罗恩病形成的肛周脓肿33例,伴发糖尿病48例,结核性脓肿18例,肛周坏死性筋膜炎7例,其他14例。另选取同期收治的无感染混合痔患者120例作为对照组,其中男89例,女31例,年龄25～55(38.63±4.29)岁;病程6～20(8.58±2.37)月;因感染形成痔71例,因饮食因素形成痔23例,因疾病因素形成痔15例,其他11例。2组患者性别、年龄比较差异无统计学意义(P>0.05);本研究经医院伦理委员会批准(SJHS2019-11042),全部受试者及家属均知情同意并签署知情同意书。

1.2 肛周脓肿病例选择标准 (1)纳入标准:①符合“肛周脓肿临床诊治中国专家共识”[7]有关肛周脓肿的诊断标准;②肛周部位出现红肿包块等;③术前评估无手术禁忌证,并行切开引流术。(2)排除标准:①伴有严重全身性疾病者;②外伤所致肛周脓肿患者;③瘢痕体质、过敏性体质、凝血功能障碍患者;④肛门狭窄或功能障碍患者。

1.3 观测指标与方法

1.3.1 SBP1、IL-17 mRNA表达检测:留取2组患者病变组织标本,将冷冻的病理石蜡组织标本解冻,Trizol试剂一步法提取总RNA,反转录为cDNA。再行实时荧光定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR),反应条件:94℃预变性1 min、94℃变性1 min、56℃退火1 min、72℃延伸2 min,共30个循环。以GAPDH作为内参。每个样品均重复检测3次,取平均值,运用相对表达量2-ΔΔCt法进行数据分析,引物序列信息见表1。

表1 SBP1、IL-17 mRNA引物序列

1.3.2 免疫组化法检测SBP1、IL-17蛋白表达:病变组织标本以4%多聚甲醛固定24 h,脱水、透明、浸蜡及石蜡包埋,切片厚度4 μm。切片脱蜡、水合后经柠檬酸钠抗原修复,滴加特异性一抗,4℃孵育过夜,加入二抗孵育1 h,自来水冲洗,复染、脱水、透明、封固,于CX23BGUV荧光显微镜(日本Olympus公司)下观察局部组织中蛋白表达情况。结果判定:以细胞(细胞核和细胞质)中出现棕黄色或棕褐色颗粒,呈均匀染色为阳性表达;计数10个高倍视野下阳性细胞占细胞总数的百分比,评分标准:阳性细胞百分比<1%为0分,1%～5%为1分,6%～25%为2分,26%～75%为3分,>75%为4分;染色强度无色为0分,浅黄色为1分,棕黄色为2分,棕褐色为3分,染色强度与阳性细胞百分比评分的乘积≥2分为阳性。

1.3.3 随访及预后评估:肛周脓肿患者出院后以电话或门诊复诊的方式随访6个月,随访截止日期为2022年6月。6个月内患者肛周脓肿未复发或未形成肛瘘为预后良好,反之为预后不良。

2 结 果

2.1 2组肛周组织SBP1、IL-17表达比较 肛周脓肿组SBP1 mRNA相对表达量、蛋白阳性表达率均低于对照组(P<0.01),IL-17 mRNA相对表达量、蛋白阳性表达率均高于对照组(P<0.01),见表2。

2.2 不同预后肛周脓肿患者肛周局部组织中SBP1、IL-17表达比较 预后不良亚组患者肛周局部组织中SBP1 mRNA相对表达量、蛋白阳性表达率均低于预后良好亚组(P<0.05),而IL-17 mRNA相对表达量、蛋白阳性表达率均高于预后良好亚组(P<0.05),见表3。

2.3 SBP1、IL-17表达在不同临床/病理特征中的差异 肛周局部组织中SBP1、IL-17表达在不同性别、年龄、脓肿位置、感染类型、病程中比较差异无统计学意义(P>0.05);而在脓肿≥5 cm、术后愈合时间≥4周患者中SBP1 mRNA相对表达量、蛋白阳性率低于脓肿<5 cm、术后愈合时间<4周患者,IL-17 mRNA相对表达量、蛋白阳性率高于脓肿<5 cm、术后愈合时间<4周患者(P<0.05),见表4。

表2 对照组与肛周脓肿组SBP1、IL-17表达比较

2.4 影响肛周脓肿患者预后的多因素Logistic回归分析 以患者预后为因变量(预后良好=0,预后不良=1),以上述结果中P<0.05项目(脓肿大小、术后愈合时间及SBP1、IL-17表达)为自变量,均为原值输入,进行Logistic多因素回归分析。结果显示,术后愈合时间≥4周、SBP1表达降低、IL-17表达升高是影响肛周脓肿患者预后的独立危险因素(P<0.05),见表5。

2.5 SBP1、IL-17 mRNA对肛周脓肿患者预后的预测价值 绘制SBP1、IL-17 mRNA对肛周脓肿患者预后的ROC曲线,并计算曲线下面积(AUC),结果显示,SBP1、IL-17 mRNA及二者联合预测肛周脓肿的AUC分别为0.888、0.890、0.933,二者联合优于各自单独预测效能(Z=3.583,4.252,P均<0.001),见表6、图1。

表3 预后良好亚组与预后不良亚组肛周脓肿患者SBP1、IL-17表达比较

表4 肛周局部组织中SBP1、IL-17表达在不同临床/病理特征中的差异

表5 影响肛周脓肿患者预后的Logistic多因素回归分析

表6 SBP1、IL-17 mRNA水平对肛周脓肿患者预后的预测价值

图1 SBP1、IL-17 mRNA表达对肛周脓肿患者预后的ROC曲线

3 讨 论

目前,学者认为肛周脓肿是细菌感染引起的疾病,患者免疫力降低无法阻止炎性反应扩散也是其致病因素之一,故炎性反应参与了肛周脓肿疾病的发生发展[8]。切开引流是外科治疗肛周脓肿的常用方案,可以充分引流脓腔内分泌的渗血、渗液,缓解术后疼痛和红肿,保护肛门括约肌功能,但也存在复发及预后不良风险[9-11]。因此,积极寻找可靠的分子标志物,明确其与临床病理特征的相关性及预测术后转归的价值对指导临床治疗和预后评估具有重要意义。

SBP1是构成物种间高度保守的蛋白质,生理功能包括细胞分化、蛋白质降解、高尔基体内囊泡转运、细胞运动和氧化还原调节,其表达受到缺氧的强烈影响,反映了硒代谢和免疫细胞激活之间的新联系。由于硒状态受到炎性反应和缺氧的影响,SBP1主要被认为是一种参与硒代谢和氧化还原控制的细胞内蛋白[12]。本研究结果显示,肛周脓肿组中SBP1 mRNA相对表达量、蛋白阳性率低于对照组,与脓肿大小、术后愈合时间有显著相关性,预后不良亚组患者肛周局部组织中SBP1蛋白阳性率、mRNA相对表达量均低于预后良好亚组。金黄色葡萄球菌是最常见的外源性致病菌,也是脓肿感染和肛瘘复发的根本条件[13],本研究推测SBP1可能是以硒元素依赖性的方式发挥抵御肛周脓肿细菌感染作用,降低预后不良风险,其可能原因为:(1)硒可以促进金黄色葡萄球菌感染的巨噬细胞自噬,缓解自噬流的阻断,降低细菌的胞内存活,从而参与调节和改善感染金黄色葡萄球菌[14];(2)硒可以抑制髓过氧化物酶活性,抑制炎性细胞因子基因表达,保护组织免受过度炎性反应造成的损伤[15];(3)硒可以通过抑制信号通路改善金黄色葡萄球菌诱导的炎性反应[16-17]。

不同的辅助T细胞亚群有助于调节对病原体的免疫反应。IL-17由T辅助细胞17分泌,可促进炎性细胞因子和趋化因子的分泌,且具有强大的招募中性粒细胞的作用,能够促进多种细胞的成熟,在多种炎性反应及自身免疫性疾病病理过程中发挥关键作用,通过促细胞分裂原活化蛋白激酶、髓过氧化物酶活性、核因子κB信号通路激活中性粒细胞,调节T细胞免疫在细菌感染中发挥重要作用[18-20]。IL-17介导炎性反应增加机体对革兰阴性菌和真菌感染。细胞因子还通过维持局部黏膜屏障的完整性来保护身体免受病毒感染。IL-17与细胞因子产生协同作用后便具备募集中性粒细胞等炎性细胞的能力,从而引起局部炎性反应[21]。在本研究中,预后不良亚组局部组织中IL-17蛋白阳性率、mRNA相对表达量均高于预后良好亚组,且IL-17 mRNA相对表达量、蛋白阳性率与患者脓肿大小、术后愈合时间具有相关性,故推测IL-17表达上调可能通过加重炎性反应途径参与肛周脓肿的发生进展过程,IL-17表达上升提示炎性反应未完全控制,进一步造成局部组织损害,病情迁延不愈,增加了预后不良的发生风险。本研究Logistic多因素回归分析显示,SBP1表达降低、IL-17表达升高、术后愈合时间≥4周是影响肛周脓肿患者预后的独立危险因素,这进一步说明肛周局部组织SBP1、IL-17水平与肛周脓肿患者的预后不良关系密切。

本研究经ROC曲线分析显示,肛周脓肿局部组织SBP1、IL-17水平预测患者预后的 AUC分别为0.888和0.890(均大于0.8),说明2项指标对于预后的预测均有一定准确性,二者单独及联合检测的敏感度分别为0.802、0.835、0.927,特异度分别为0.733、0.667、0.800,提示二者联合检测预测肛周脓肿患者预后的价值高于任一单独检测。

综上所述,肛周脓肿患者局部组织中SBP1、IL-17表达异常,且与肛周脓肿大小、愈合时间及患者预后相关。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明

罗蕾:实施研究过程,分析试验数据,论文撰写与修改;庄怡青:数据整理及统计学分析;唐英:实施研究过程,资料搜集与整理;黄鸿翔:提出研究思路,设计研究方案,论文审核