利用纤维素酶水解碱处理稻草生产葡萄糖

顾天华,曹亚群,李烜琦,任晓冬

(1.吉林大学 生命科学学院,长春130012; 2.内蒙古自治区城乡人居环境发展促进中心,呼和浩特 010020)

木质纤维素是一种丰富的自然资源,全球每年产量超过两千亿吨,但其结构复杂,难以降解利用.目前,大部分的木质纤维素以焚烧和堆积等方式处理,不但浪费资源,而且污染环境[1].木质纤维素主要由纤维素、半纤维素和木质素3种成分组成,其中半纤维素和木质素相互缠绕,将纤维素包裹,形成结晶结构,这种复杂的空间结构使木质纤维素不易降解.为利用木质纤维素,需先破坏木质纤维素的晶体结构,再用纤维素酶降解[2].目前,对木质纤维素预处理方法主要有物理法、化学法和生物法等[3].稻草中的主要成分为木质纤维素.本文采用NaOH对稻草进行预处理,分别用扫描电镜(SEM)、Fourier变换红外光谱(FTIR)和 X射线衍射(XRD)对预处理的稻草进行分析,研究NaOH预处理对秸秆结构的影响,并利用纤维素酶水解预处理稻草生产葡萄糖,为利用稻草生产生物化工产品提供了理论基础.

1 实 验

1.1 仪器和试剂

ZQLY-180V型立式全温震荡培养箱(上海知楚仪器有限公司); SP-722E型可见分光光度计(上海光谱仪器有限公司); HH-6A型恒温水浴锅(上海皓庄仪器有限公司); KYKY-EM3900型扫描电子显微镜(北京中科科仪股份有限公司); Nicolet 6700型Fourier红外光谱(美国,Thermo Fisher公司); Empyrean型X射线晶体衍射仪(荷兰,PANalytical B V公司); TGA PT1000型热重分析仪(上海林赛斯科学仪器有限公司).

PDL培养基: 土豆洗净去皮,切成小块,取200～300 g熬汁,用8层纱布过滤出汁液,加入葡萄糖20 g,用去离子水定容至1 000 mL.

产酶培养基: 配制含蛋白胨3 g/L,酵母提取物0.5 g/L,KH2PO43 g/L,(NH4)2SO42 g/L,尿素0.3 g/L,MgSO40.3 g/L,CaCO35 g/L,气爆秸秆30 g/L的溶液,调节溶液pH=5.5.

1.2 纤维素酶制备

从土壤中分离纯化一株产纤维素酶的菌株AspergillusnigerQ7.将A.nigerQ7接种到40 mL PDL培养基中,于30 ℃,130 r/min条件下培养3 d.再按5%接种量接种到产酶培养基中,于30 ℃,130 r/min条件下培养5 d.将发酵液于8 000 r/min离心15 min,弃沉淀,收集上清液为粗酶液.

1.3 纤维素酶纯化

利用70%相对饱和度的(NH4)2SO4进行沉淀,于4 ℃盐析2 h后,于4 ℃,8 000 r/min离心30 min,弃上清液.使用少量缓冲液(pH=5.0)溶解沉淀,于4 ℃保存.将获得的酶转移至透析袋中(相对分子质量截留10 000),透析除盐,4 ℃保存备用[4].

1.4 酶活力测定

采用滤纸酶活测定法[5]测酶活力.滤纸酶活力定义为: 在温度50 ℃,pH=4.8条件下,每分钟水解底物产生1 μg还原糖所需的酶量,定义为一个酶活力单位(U).

1.5 稻草预处理

将30 g稻草粉末加入500 mL蓝盖瓶中,加入质量分数为1%的NaOH溶液300 mL,用双层牛皮纸包扎,放入高压灭菌器中,于121 ℃反应60 min.待反应液降至室温后取出,用8层纱布过滤预处理液,用蒸馏水反复洗涤预处理后的稻草,室温下晾干,于-20 ℃保存备用.

1.6 预处理稻草的SEM分析

用SEM对预处理稻草表面形貌进行分析.取少量预处理后的稻草,在样品台上固定双面导电胶带,于真空条件下进行镀金处理.待样品表面均匀镀上一层导电膜后,将样品置于扫描电子显微镜下,在10 kV和15 mA下,放大400倍和 2 000倍进行观察.

1.7 预处理稻草的FTIR分析

取预处理后的稻草,与溴化钾以1∶100的质量比混匀,用玛瑙研钵研磨至粉末状,取少量样本在压片机上制成薄片.利用Fourier红外光谱仪进行分析,扫描波长范围为400～4 000 cm-1,光谱分辨率为4 cm-1,单一样品进行50次扫描.

1.8 预处理稻草的XRD分析

取预处理样品用X射线衍射仪进行结晶度分析.对预处理稻草进行扫描,工作电压和电流分别为40 kV和40 mA,扫描范围(2θ)为5°～40°,扫描速度2°/min.样品结晶度(ICr)通过

(1)

计算,其中I002为纤维素结晶区衍射角的峰值,Iam为无定形区衍射角的峰值.

1.9 稻草成分分析

按照美国国家可再生能源实验室(NREL)的LAP002,003,004方法进行分析[6].

1.10 利用纤维素酶降解预处理前后的稻草

向20 mL的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(pH=5)中分别加入50 mg预处理前后的稻草,按20 U/g纤维素加入纤维素酶,于50 ℃水浴振荡,分别在12,18,24,30,36 h取样,利用葡萄糖试剂盒法测量葡萄糖的质量浓度.

2 结果与讨论

2.1 预处理前后稻草的成分分析

按照NREL方法对预处理前后的稻草进行成分分析,结果列于表1.由表1可见,经质量分数为1%NaOH预处理的稻草,木质素的质量分数降低,有助于纤维素酶吸附到纤维素上,从而促进纤维素降解成葡萄糖.

表1 预处理前后稻草的成分分析Table 1 Component analysis of rice straw before and after pretreatment %

2.2 SEM分析结果

用SEM观察预处理前后稻草的结构,结果如图1所示.由图1(A),(B)可见,未处理的稻草表面结构平整光滑.经NaOH预处理后,稻草表面结构被破坏,出现孔洞,纤维断裂弯曲,表明天然木质纤维素结构被破坏.可见碱预处理可有效降解植物细胞壁中的木质素[7].稻草中半纤维素、纤维素和木质素缠绕在一起,形成紧凑结构,去除木质素可大幅度提高纤维素的降解率[8].

图1 预处理前后稻草的SEM照片Fig.1 SEM images of rice straw before and after pretreatment

2.3 FTIR结果分析

利用FTIR分析预处理前后的稻草,结果如图2所示.由于稻草为混合物,本文以羟基的O—H伸缩振动3 410 cm-1为强度标度归一化比较其他吸收带.由图2可见: 3 300～3 500 cm-1处振动来自羟基的O—H伸缩振动模式,其强吸收和较宽的吸收带表明稻草分子内或分子间可能产生了氢键[9]; 2 848,2 916 cm-1处的吸收带为亚甲基的对称伸缩和不对称伸缩振动吸收峰,相比于羟基峰,预处理后明显少于预处理前稻草的亚甲基含量,这可能是因为部分纤维素的糖环在处理后被打开; 1 728 cm-1处的吸收带为羰基碳氧双键的伸缩振动[10],与羟基相比,预处理后明显比预处理前稻草羰基的含量增多,预处理前稻草在1 251 cm-1(羧基或酯羰基的碳氧单键伸缩振动)处未出现吸收峰,但处理后的稻草在该处出现了吸收峰,推断羰基可能来自纤维素糖环打开后,亚甲基氧化为羧基,部分亚甲基被氧化成了羧酸; 1 621,1 531 cm-1处的峰是苯环的碳碳双键伸缩振动峰,是木质素特征峰,由于处理后仅失去部分木质素,因此该峰仍存在于FTIR中.

2.4 XRD分析结果

木质纤维素中有结晶区和非结晶区.结晶度是木质纤维素聚集形成结晶程度的指标[11].对预处理前后的稻草进行X射线晶体衍射分析,并计算结晶度,结果如图3所示.经NaOH预处理的稻草结晶度为43.36%,而未预处理的稻草结晶度为18.51%.这是由于预处理后,木质纤维素的非结晶成分溶出,导致稻草整体的结晶度升高[12].

图2 预处理前后稻草的FTIRFig.2 FTIR of rice straw before and after pretreatment

图3 预处理前后稻草的XRD谱Fig.3 XRD patterns of rice straw beforeand after pretreatment

2.5 利用纤维素酶酶解预处理前后稻草的结果

图4 A.niger Q7 纤维素酶水解预处理前后 稻草生产葡萄糖的时间进程曲线Fig.4 Time course curves of glucose production fromrice straw before and after pretreatmentwith A.niger Q7 cellulase hydrolysis

利用A.nigerQ7纤维素酶分别水解预处理前后稻草,水解时间分别为12,18,24,30,36 h.预处理前后稻草水解产生葡萄糖的质量浓度如图4所示.由图4可见,水解预处理后稻草的葡糖糖产量始终高于水解预处理前稻草的葡萄糖产量[13].

综上所述,本文用质量分数为1%的NaOH对稻草进行预处理,稻草中纤维素质量分数从37.40%提高至58.87%,半纤维素质量分数为24.39%,木质素质量分数为15.30%.对预处理前后的稻草进行分析,SEM结果表明,预处理后的稻草表面出现塌陷,纤维断裂弯曲,木质纤维素原有的结构被破坏; XRD结果表明,预处理后稻草的结晶度大幅度提高.用从土壤中分离纯化的A.nigerQ7产生的纤维素酶水解稻草,预处理稻草比未预处理稻草产生葡萄糖的质量比提高了47.5%.结果表明,预处理稻草中的木质素被降解,稻草结构发生显著改变,水解效率显著提高.因此,先用NaOH预处理稻草,再用纤维素酶水解稻草生产葡萄糖是稻草利用的有效方式.