采自山西省毛缘菇属和假香蘑属2个新纪录种

赵磊 张春兰

摘    要：为发现山西省大型真菌新成员，通过随机踏查，对山西省北部地区林区的大型真菌进行调查，采集了481份样本，在经典形态分类鉴定的基础上，采用分子生物学的方法（ITS1/ ITS4  2个保守基因片段）进行辅助验证鉴定，利用最大似然法构建其分子系统学关系，采用多相分类法进行物种综合鉴定。结果表明：结合形态学、分子生物学鉴定，发现2个新纪录种，分别为毛缘菇Ripartites tricholoma和空柄假香蘑Notholepista fistulosa。研究结果增补了采自山西省毛缘菇属和假香蘑属的2个大型真菌新纪录种，提供了2个新纪录种的详细宏观描述、显微特征描述和野外生态信息，对山西省大型真菌名录是较好的补充，为相关物种的鉴定、资源开发与利用以及生物地理学的研究提供参考数据。

关键词：毛缘菇；空柄假香蘑；分子系统学

中图分类号：Q19        文献标识码：A          DOI 编码：10.3969/j.issn.1006－6500.2023.05.014

Abstract： In order to discover new members of macrofungi in Shanxi Province， a random survey was conducted to investigate the macrofungi in the northern forest region of Shanxi Province and 481 samples were collected. Based on the classical morphological classification and identification， molecular biological methods （ITS1/ITS4 conservative gene segments） were used for auxiliary verification and identification. The maximum likelihood method was used to construct their molecular phylogenetic relationships and the heterogeneous classification method was used for comprehensive species identification. The results showed that combining morphological and molecular biological identification， two new recorded species were found， namely， Ripartites tricholoma and Notholepista fistulosa. The results of the study supplement two new recorded species of macrofungi collected from the genera Ripartites and Notholepista in Shanxi Province， providing detailed macroscopic descriptions， microscopic characterization and field ecological information of the two new recorded species， which is a good supplement to the list of macrofungi in Shanxi Province and provides reference data for the identification of related species， resource development and utilization and biogeographical research.

Key words： Ripartites tricholoma; Notholepista fistulosa; molecular systematics

中国是世界上重要的生物多样性研究热点地区之一，具有丰富的物种多样性。我国地理结构和地貌特征比较复杂，并且地区间气候因素差异较大，导致在生物物种演化进程中具有特殊地位。山西省位于黄土高原东部，由于其特殊的生态区位和自然地理特征，自然生态系统的保护与恢复工作显得尤为重要[1]。为了改善生态环境，山西省近年来，在防沙治理工程、平原绿化工程、三北防护林工程、太行山绿化工程等提高森林覆盖率和保护森林生态学等方面开展着卓有成效的工作。生物多样性是维持生态系统稳定的重要要素，其中真菌作为分解者，已成为地球上生物多样性组成与生态系统构建中的重要成员。明确区域性的大型真菌物种多样性组成，对区域性的生态保护具有科学的指导意义。

毛缘菇属（Ripartites P. Karst.）最早由P. Karsten 在1879年建立，该属的模式种为毛缘菇Ripartites tricholoma（Alb. & Schwein.） P. Karst.[2]。该属在北半球分布广泛，index fungorum记录该属17條信息，经过核准后该种已知物种数为9个。2008年出版的第十版《菌物字典》记录该属隶属于担子菌门（Basidiomycota）、伞菌纲（Agaricomycetes）、伞菌目（Agaricales）、口蘑科[3]，但最新分类系统将该属归入分类位置未定类群（Incertae sedis）（担子菌门、伞菌纲、伞菌目）[4]。假香蘑属Notholepista为Vizzini等人于2012年建立的属，该属归入担子菌门、伞菌纲、伞菌目、分类位置未定类群[5]，目前该属仅有2个物种。传统物种鉴定主要采用形态鉴定方法[6]，该方法目前依然是现代分类学的主要方法，但随着越来越多的物种被发现，很多隐形种、复合种难以被识别[7]。

自1990年后，分子系统学方法，在真菌分类学与系统学的研究上得到了广泛应用，对大型真菌多个类群系统学研究的快速发展起到重要的推动作用。Breitenbach等[8]在1991年，开展“门”水平的高级分类单元的框架系统研究。随着分子生物学方法的广泛应用，其在大型真菌分类领域也得到了普遍应用，多基因谱系一致性系统发育学物种识别方法出现以后，使其得到了更好的应用。该方法的建立为属内种间形态证据少的类群提供了新方法和思路。近些年，多基因谱系一致性的系统发育学物种识别法在大型真菌分类和生物地理学领域得到了较好的应用和发展。系统发育分析是研究物种进化和系统分类的一种常用方法，构建系统发育树是研究的核心。

本研究通过随机踏查，采集山西省芦芽山自然保护区大型真菌样本400余份，利用经典分类学方法，结合多基因谱系一致性的方法进行物种鉴定，发现了2种山西省新纪录大型真菌。

1 材料与方法

1.1 研究材料

本研究的全部材料均为2022年采自山西省北部多个林区的大型真菌样本，共计481份。其中主要采集样本的林型为针叶林、针阔混交林和阔叶林。样本均保藏于长春大学标本研究室。

1.2 研究方法

1.2.1 样本调查 样本采集采用随机踏查法

1.2.2 样本采集与处理 样本野外生态信息获取采用直接观察记录。主要设备：单反相机（佳能有限公司，80D）、三脚架（广东富图宝工业有限公司，X-Aircross mini）、干燥器（长虹电器股份有限公司，CKX-H310）；其他采集用工具：标本整理盒、刀、小刷子、接种镊子、尺子、反光板等；标本存放工具为：标本盒，茶叶袋，自封袋。

1.2.3 形态学研究 标本处于野外生长状态时，在自然状态下对标本进行详细的记录。其中包括：准确记录标本的采集地、采集时间及样本发生的生境及拍照后的照片编号等相关信息。找到适合反应标本特征角度的位置放置背板，使用相机的手动挡调整拍照参数进行拍照。记录菌盖不同生长状态的形状、颜色、变色情况、是否有条纹、是否有绒毛（若有记录绒毛颜色及形态）、水渍状情况、菌盖边缘特征；菌褶形状、褶幅大小、颜色、着生方式、疏密程度、菌褶附属物及特征、是否有缺口及其他特征；菌柄从幼时至成熟的形状、颜色、表面的状态、是否有条纹，是否扭曲，顶部与基部是否特殊、实心还是空心；将成熟担子果切开，取一块菌肉，记录气味与味道。典型颜色反应采用5%KOH、梅氏试剂、棉蓝染液、1%刚果红染液等进行。孢子大小测量使用随机选取20个孢子测定其正面观计算其均值。形态观察所用设备：显微镜（奥林巴斯株式会社，BX53）、成像系统（奥林巴斯株式会社，DP80）；切片制作工具：剃须刀片、镊子等；浮载剂：5％KOH；染色剂：1％刚果红、梅氏试剂等[9-11]。

1.2.4 分子生物学研究 基因组DNA提取采用改良CTAB法，分子生物学辅助鉴定使用基因片段为 ITS 序列（internal transcribed spacer，ITS1/ ITS4），ITS1/ ITS4引物使用通用引物，PCR反应体系为25 μL通用体系。反应程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共33个循环，72 ℃延伸5 min；4 ℃保存。PCR扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳检测，电泳程序为110 V，55 min。扩增片段由华大基因（北京）公司进行一代测序，将获得的序列提交GenBank。

1.2.5 系统发育关系研究 将测序成功序列的峰图文件进行分析，而后将其导入Geneious（测序公司在线自助拼接软件），进行在线自主拼接，然后将其保存为fasta格式文件。所得序列在网站NCBI（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）上进行blast比对，其参数默认，结合片段所属菌株的形态特征确保所得基因片段非污染条带，然后再经tblastp处理，参数默认，从而进一步来验证所得片段的准确性。对于测序有问题或不成功序列以及比对后与形态鉴定相差较远的序列，判定为污染序列，进行剔除并重新测序。系统发育关系构建选用序列为GenBank下载，具体序列信息见表1。序列比对使用MAFFT 7.0，用ModelFinder进行模型选择，最大似然法分析（Maximum Likelihood，ML）构建系统发育关系，用自举法对ML树进行评估，自举值为1 000 bootstrap，用Figtree v1.4软件对进化树进行后续处理。

2 結果与分析

2.1 物种鉴定

2.1.1 毛缘菇Ripartites tricholoma Ripartites P. Karst. 子实体中等大小，菌盖直径2～6 cm，凸镜形，菌盖中央略凹陷，菌盖边缘近波状或毛刺状附属物，未成熟时盖缘内卷，成熟后盖缘平展，菌盖表层具有明显的绒毛状附属物，由中央浅褐色，向四周呈灰白色，干。菌褶直生至延生，褶幅略宽，灰白色至淡肉桂色。菌柄3～6 cm×0.5 cm，空，灰白色至淡肉桂色。孢子椭圆形至近圆形，淡棕色，表面粗糙，5.0～8.5 μm×4.0～5.5 μm。担子棒状，4担孢子。菌褶菌髓菌丝无色，薄壁，菌丝宽6～11 μm，不明显的锁状联合。盖皮菌丝呈匍匐状。菌肉菌丝锁状联合明显。菌柄菌丝锁状联合明显。子实体的生态照片及显微特征手绘图见图1。

生境：单生或散生于针叶林地上。

分布：瑞士[4]、中国吉林省[4]、中国山西省等。

2.1.2 空柄假香蘑 Notholepista fistulosa Z. M. He & Zhu L. Yang     子实体中等大小，菌盖2～5 cm，近杯伞形，表面干或近水渍状，表面光滑，淡黄色至黄色，菌盖边缘成熟时易开裂。菌褶明显延生，白色或灰白色或略带淡黄色，菌褶中等致密，褶幅中等。菌柄2～5 cm×0.3～0.5 cm，中生，圆柱形，中空，菌柄淡黄色向下颜色渐深，菌柄略带绒毛。担孢子近圆形，表面粗糙，4～6 μm×3.5～4.5 μm。担子圆柱形，4担孢子。囊状体缺。菌褶菌髓规则，菌丝宽5～10 μm，圆柱形，薄壁。锁状联合。子实体的生态照片及显微特征手绘图见图2。

生境：散生或单生于针叶林和阔叶林地上。

分布：中国甘肃省[12]、中国山西省等。

2.2 毛缘菇和空柄假香蘑的系统发育关系

将测序获得的序列提交GenBank，毛缘菇登录号为：OP978283，柄假香蘑登录号为：OP978293。通过对毛缘菇和柄假香蘑的系统发育关系研究发现，样本7595与Ripartites tricholoma聚为1支，根据NCBI比对结果，结合系统发育关系，均支持形态分类学结果，即7595为毛缘菇。样本7965与 Notholepista fistulosa聚为1支，根据NCBI比对结果，结合系统发育关系，均支持形态学鉴定结果，即样本7965为空柄假香蘑。系统发育关系结果见图3。

3 讨论与结论

山西省的特殊地理位置孕育着特殊的生物资源，本研究在广泛调查的基础上采集到毛缘菇属和假香蘑属2个山西省新纪录种。毛缘菇为该属的模式种，模式种产地为瑞士，在我国主要分布在东北地区，本研究样本采自山西，该物种生于针叶林或阔叶林地上，形态学鉴定和分子生物学结果均支持该种为毛缘菇，该种主要特征为菌盖凸镜形，菌盖边缘带有波状毛，孢子表面有疣。本种与毛缘菇模式种在菌盖边缘附属物和孢子表面疣突大小方面略有区别，毛缘菇模式种菌盖边缘的附属物（绒毛或纤维）比较明显而本种略显稀疏，毛缘菇模式种的担孢子表面疣突较本种略小。分析产生以上情况的原因，主要由于同种在不同的地理分布和生境关系较大而导致的。

空柄假香蘑为假香蘑属下的2个物种之一，该种目前仅报道在中国有分布，其模式种产地为甘肃省[6]，形态学鉴定和分子生物学结果均支持该种为空柄假香蘑，该物种主要特征是杯伞状，子实体淡黄色至黄色，菌柄中空，孢子粗糙。假香蘑属目前仅有2个物种，分别是Notholepista fistulosa和Notholepista

subzonalis，目前，我国仅发现Notholepista subzonalis的分布，二者形态特殊区别非常明显，通过形态及分子生物学结果均较好的支持空柄假香蘑的鉴定结果。大型真菌多样性的研究已成为区域性生物多样性研究的重点之一，如王建瑞[13]、王迪等[14]、徐济责[15]分别对区域性的大型真菌多样性开展研究。

本研究的2个物种的食药用情况并未见相关报道，2个物种均可以在针叶林环境中生长，作为资源利用的前期工作本研究将为相关资源的开发利用提供基础参考。

参考文献：

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[14] 王迪， 李玉. 医巫闾山国家级自然保护区大型真菌名录[J]. 菌物研究， 2015， 13（3）： 138-145.

[15] 徐济责. 海棠山国家级自然保护区大型真菌物种多样性和生态系统多样性研究[D]. 长春： 吉林农业大学， 2013.

基金项目：吉林省科技厅重点研发计划支持（20210202080NC）

作者简介：赵磊（1999—），男，山西沂州人，在读硕士生，主要从事食药用菌种质资源研究。

通讯作者简介：张春兰（1988—），女，吉林长春人，副教授，博士，主要从事食药用菌资源与病害研究。