PCR-反向斑点杂交技术在即食果蔬常见致病微生物快速筛查中的应用

◎ 杨丹妮，邹雨虹

（常州市食品药品纤维质量监督检验中心，江苏 常州 213000）

水果蔬菜中富含人体必需的维生素、有机酸、无机盐和植物纤维等营养成分，而即食生鲜果蔬食品因食用方便、口味清新和味道鲜美，更是人们日常生活中和餐桌上常见的食物。但是，生鲜果蔬食品仅经简单清洗，未经高温杀菌处理，其表面和内部附着的微生物对其食用安全性造成了极大的隐患[1-2]。因此，如何做好即食生鲜果蔬中病原性微生物检测成为食品安全领域关注的一个重要课题。

目前即食生鲜果蔬中致病菌检测的方法主要有分离培养[3]、生化鉴定[4]、酶联免疫吸附[5]、聚合酶链式反应[6]和基因芯片法[7]等。常规方法费时费力，既增加了企业的成本，也加大了政府对于食品安全的监管难度，还无法满足致病病毒和细菌的同时检测。荧光定量PCR 法在一定程度上弥补了传统方法的部分不足，但受其荧光通道的限制，在样本量大、检测指标多的情况下，大大增加工作量。因此，急需一种操作简单、结果直观、单次反应可满足多指标筛检要求的方法来对即食果蔬中的多种致病微生物进行同时筛检。

膜芯片法利用反向斑点杂交技术（Reverse Dot Blot Hybridization，RDBH）将待测靶标基因中的特异性序列作为探针固定在尼龙膜上，同时利用多对带生物素标记的引物对待测靶标基因进行扩增，通过酶-底物显色，产生肉眼可辨的信号，具有快速、简便、高效、直观等特点。同时结合多重PCR 技术，双重反应体系确保检测结果的准确性，单次反应可同时筛检数十种指标[8]。本研究拟在PCR-膜芯片技术的基础上，建立包括沙门氏菌（Salmonella）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大肠埃希氏菌O157:H7（Escherichia coliO157:H7）、单核增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）、轮状病毒（Rotavirus，RV）、诺如病毒（Norovirus，NV）GI 型和GII 型在内的7 种食源性致病微生物的快速筛查方法。

1 材料与方法

1.1 样品、标准菌及病毒样本

市场样品共14份，均购自常州市各大流通环节市场。

沙门氏菌（21513）、大肠埃希氏菌O157:H7（21530）、金黄色葡萄球菌（10384）、单核增生李斯特氏菌（21633）、阪崎肠杆菌（21544）、志贺氏菌（21535）、霍乱弧菌（23794）、副溶血性弧菌（21617）、蜡样芽孢杆菌（21261）和创伤弧菌（21615）等均购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。轮状病毒（BDS-IQC-072）、诺如病毒（BDS-IQC-226）核酸质控品购自广州邦德盛生物科技有限公司。

1.2 主要试剂

细菌基因组DNA 提取试剂盒（DP302）、病毒基因组DNA/RNA 提取试剂盒（DP315）购自天根生化科技（北京）有限公司；膜芯片检测试剂盒，由四川华汉三创生物科技有限公司提供；PCR 引物及探针，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成并纯化。

1.3 实验方法

1.3.1 PCR 引物及探针设计

根据所查文献、生物信息学分析并结合实验测试结果，最终选取了具体对应的特异性基因，详细信息见表1。

表1 多重PCR 引物、探针信息表

1.3.2 样品处理与DNA 提取

无菌条件下迅速称取待检样品20 g，并平均分为等质量的两份（每份10 g）。

（1）细菌前增菌。取待检样品加入100 mL 共增菌培养基中。在恒温振荡培养箱中35 ℃、150 r·min-1培养24 h后取出培养基，静置3～5 min后，取1～3 mL增菌液至一灭菌EP 管中，12 000 r·min-1离心2 min，弃上清留沉淀进行细菌基因组DNA 提取。

（2）病毒富集。参考GB 4789.42—2016 软质水果和生食蔬菜中诺如病毒富集方法进行病毒的富集，并用于病毒RNA 提取。

（3）细菌、病毒基因组DNA/RNA 提取及质量测定。进行细菌、病毒基因组DNA/RNA 提取，提取后的基因组DNA 用Nanodrop 2000 测定质量，一般要求核酸浓度在20 ng·μL-1以上，A260/A280介于1.8 ～2.0。

1.3.3 PCR 扩增

以待测样品DNA 为模板，依次加入多重PCR Buffer10 μL、EnzymeMix 0.45 μL、Hela cell total RNA 1 μL、样品总核酸2 ～5 μL，最后用ddH2O 补足20 μL体系。

PCR 扩增程序：反转录45 ℃，30 min；95 ℃，2 min；95 ℃，30 s，55 ℃，30 s，72 ℃，30 s，35 cycles；72 ℃延伸5 min；12 ℃保温。扩增结束后，即可得到多重PCR 产物。

1.3.4 膜芯片制备

将尼龙膜裁成1.1 cm×1.1 cm 的膜条，放置于双蒸水中浸泡15 min，用15×SSC 浸泡15 min，取出后放在滤纸上80 ℃烘干，待膜条降至室温后，按膜芯片探针布局图（图1）上顺序依次点上内参探针（10 ～20 μmol·L-1）、各检测靶标探针（10 ～20 μmol·L-1）、阳性探针PC（5 μmol·L-1）以及阴性探针NC（5 μmol·L-1）。

图1 膜芯片探针布局图

1.3.5 杂交显色将多重PCR 产物置于95 ℃加热5 min 使其解链，立即取出低温放置，完成杂交反应。

1.3.6 结果判读

杂交反应结束后，对照膜芯片点阵图判读检测结果，膜芯片探针布局图如图1 所示。结果有效前提：芯片上阳性质控点（Positive）显色，阴性质控点（Negative）不显色。

2 结果与分析

2.1 特异性测试

阳性模板取1.1 中所述的7 种阳性样本，按照1.3进行实验操作，检测体系特异性。检测结果如图2所示，各阳性核酸检测结果靶标点单一且特异，各阴性核酸无阳性探针点显色，充分证明了该体系具有良好的特异性。

图2 膜芯片特异性测试芯片结果图

2.2 检出限测试

采 用1.1 中 的7 种 浓 度 为1.0×107copies/mL 的阳性样本再进行2 个梯度稀释后检测多重体系的检测限，各梯度核酸加样量为2 μL。如图3 ～4 所示，通过肉眼观察结合仪器信号值判断，结果表明使用阳性样本进行检测，综合检测限可达1.0×105copies/mL。检出限以上的样本，包括混合样本均能检测到所有阳性靶点。

图3 1.0×106 copies/mL 阳性样本测试结果图

图4 1.0×105 copies/mL 阳性样本测试结果图

2.3 样本测试

2.3.1 市场样本测试

收集市场上各种即食蔬菜、水果等，提取相应样本中的核酸，使用已建立的多重PCR 检测体系进行测试，验证体系的可应用性。检测结果如图5 所示。

图5 样本应用性评价测试结果图

2.3.2 模拟检测

选取鲜切苹果作为样品采用人工添加标准样品的形式进行模拟检测实验，验证体系的可应用性。取沙门氏菌、大肠埃希氏菌O157、金黄色葡萄球菌、单核增生李斯特氏菌划线平皿上的单菌落，接种至液体培养基中培养过夜，梯度稀释至10-7～10-8（约稀释至1 000 CFU·mL-1），分别取100 μL 接种至100 mL 共增菌培养基中。病毒核酸质控品：向病毒富集体系中加入临界浓度的病毒质控品样本。后续同上述样本处理步骤，检测结果如图6 所示，结果均与预期相符，证明了体系具有良好的可应用性。

图6 模拟检测结果芯片图

3 结论

水果蔬菜作为健康饮食的重要组成部分，其消费量逐年上升[9]。近年来，即食果蔬食品越来越受消费者的青睐。即食果蔬在食用前会经过清洗、消毒、切割、分装等诸多加工处理环节，容易发生微生物污染。全世界范围内由即食果蔬致病微生物引起的食源性疾病事件频发[10-11]。本研究通过对膜芯片体系检测特异性和检出限的测试，充分说明该技术具有稳定性高、特异性强、灵敏度高的特点。既提高了检测通量，也提高了检测效率，为食品安全预防监控、风险评估等提供了一种新型、快速、有效的检测手段。