不同工艺制备金钱草茶对体外消解结石效果的影响

蒋永波 张华 阎睿 孟琦 邱迁 文方秀 肖雅芳

摘要 ［目的］分析不同金钱草茶制备工艺对体外消解结石的影响，同时探究金钱草茶中总多糖和总黄酮与体外消解结石的相关性。［方法］采用喷雾干燥法、高温漂烫法、烘箱烘干法和日晒法4种工艺制备金钱草茶，结石消解试验采用显微镜观察法记录一水草酸钙消解情况，采用硫酸蒽酮法测定总多糖含量，硝酸铝显色法测定总黄酮含量。［结果］显微观察结果显示4种制备工艺的金钱草茶均具有明显的一水草酸钙消解效果，其中日晒法效果最佳。不同浓度总多糖和总黄酮提取液具有消解一水草酸钙的效果，并且随浓度增大对一水草酸钙消解效果均增强，日晒法中总多糖和总黄酮含量显著高于其他制备工艺。［结论］4种工艺消解试验整体对比表明，日晒法制备工艺消解一水草酸钙效果最优，且总多糖和总黄酮是主要消解成分。

关键词 金钱草；制备工艺；结石消解；总多糖；总黄酮

中图分类号 R 285  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2023）07-0175-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.07.040

Effect of Lysimachia christinae Tea Prepared by Different Processes on Calculus Digestion in vitro

JIANG Yong-bo， ZHANG Hua，YAN Rui et al

（College of Biology and Food Engineering， Chongqing Three Gorges University，Chongqing 404120）

Abstract ［Objective］To analyze the effect of different preparation processes of Lysimachia christinae tea on the calculus dissolution in vitro， and to explore the correlation between total polysaccharides and total flavonoids in Lysimachia christinae tea and the calculus dissolution in vitro.［Method］The spray drying method， high temperature blanching method， oven drying method and sunlight method were used to prepare Lysimachia christinae tea. The calculus digestion test recorded the calcium oxalate monohydrate digestion by microscope observation method， the total polysaccharide content was determined by anthrone sulfate method， and the total flavones content was determined by aluminum nitrate color method.［Result］The microscopic observation results showed that the four preparation processes of Lysimachia japonica tea had obvious calcium oxalate monohydrate digestion effect， and the best effect was the sunlight method.Different concentrations of total polysaccharides and total flavonoids had the effect of digesting calcium oxalate monohydrate， and the effect of digesting calcium oxalate monohydrate increased with the increase of concentration. The content of total polysaccharides and total flavonoids in the solarization method was significantly higher than that in other preparation processes.［Conclusion］The overall comparison of the digestion tests of the four processes showed that the preparation process of sunlight method had the best digestion effect of calcium oxalate monohydrate， and the total polysaccharides and total flavonoids were the main digestion components.

Key words Lysimachia christinae;Preparation process;Calculus digestion;Total polysaccharide;Total flavonoids

基金項目 重庆市技术创新与应用发展专项（cstc2020jscx-kjfpX0011）；重庆市万州区科技计划项目（wzstc-2020041）。

作者简介 蒋永波（1995—），男，重庆人，硕士研究生，研究方向：植物化学物质鉴定及抗氧化活性。

通信作者，副教授，博士，硕士生导师，从事植物化学物质鉴定及抗氧化活性研究。

收稿日期 2022-05-06；修回日期 2022-06-21

金钱草又称大金钱草，为报春花科植物过路黄（Lysimachia christinae Hance）的干燥全草，别名过路黄、真金草、走游草、铺地莲，植株为多年生草本［1］，也是一种药食同源植物［2］。通过人们的实践经验和科学研究［3］均显示金钱草有较好地清除体内泌尿系统结石的效果。泌尿系统结石是一种人体常见的疾病，泌尿系统结石的主要成分为草酸钙结晶，尿石中纯草酸钙晶体约占40%。草酸钙晶体有3种不同的水合物形式，包括一水合草酸钙、二水合草酸钙和三水合草酸钙。其中一水合草酸钙热力学最稳定，是泌尿系统结石的主要成石成分［4］。研究显示金钱草中主要含有黄酮类化合物、多糖类化合物、挥发油、氨基酸、胆碱、甾醇、内脂类等成分，其中黄酮类化合物具有消解结石的效果，消解结石的主要原理是黄酮类化合物中羰基及酚羟基可以与尿液中的钙离子络合，将一水合草酸钙络合成二水合草酸钙再络合成三水合草酸钙，排出体外，降低钙离子的浓度，起直接性作用减少草酸钙的过饱和度，从而抑制草酸钙晶体的生长［5］。有研究表明由水提醇沉得到的多糖部分对一水草酸钙结晶的生长抑制作用较好［6］，并且抑制作用会随多糖浓度的增加而增强［7］，其中多糖类起间接抑制草酸钙结石的作用，主要是通过抑制α-葡萄糖苷酶的活性，从而间接性抑制草酸钙结石的形成［8］。目前金钱草提取液有不同的制备方式，但是关于不同制备方式对泌尿系统结石的影响研究较少。基于体外模拟结石消解试验具有省时、方便的优点，且能直观地展现出作用物质对草酸钙的消解效果，笔者主要研究不同金钱草茶制备工艺对体外模拟消解结石效果的影响，筛选出较好的制茶工艺；并且通过体外模型试验直接探索金钱草茶中总多糖［9］、黄酮类化合物［10-11］与结石体外消解效果的关系，为金钱草茶进一步开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 試材。供试样品来源于重庆市丰都县，一般于夏季、秋季采收，全草干净，无病斑、虫斑，叶片完整，无断叶、残叶，采后试验不宜超过36 h，也可于-80 ℃左右保存鲜草。

1.1.2

试剂。麦芽糊精、β-环状糊精，郑州安康食品化工有限公司；二氧化硅，柘城县耕道贸易有限公司；木糖醇，山东福田药业有限公司；一水草酸钙，上海迈昆化工有限公司；无水乙醇、氯仿、硫酸、30%过氧化氢，重庆川东化工集团有限公司；亚硝酸钠、正丁醇，成都市科龙化工试剂厂；蒽酮，中国试剂网；葡萄糖（批号20180701，供总多糖含量测定用），合肥博美生物科技有限公司；芦丁（批号20180803，供总黄酮类化合物含量测定用），北京坛墨质检科技有限公司；氢氧化钠，斯百全化学有限公司；无水碳酸钠，沧州凯林化工产品有限公司；硝酸铝，万州化工贸易有限公司。双蒸馏水，实验室自制。

1.1.3

仪器与设备。zxfd-5250十段编程鼓风干燥箱，上海智城分析仪器制造有限公司；YC-015实验型喷雾干燥机，上海雅程仪器设备有限公司；高压均质机，上海申鹿均质机有限公司；美吉斯Elite500 Puls真空包装封口机，温州恒豪包装机械有限公司；标准检验筛60目孔径0.3 mm，浙江上虞市华丰五金仪器有限公司；FW80型高速试样粉碎机，河北省黄市新兴电器厂；FA1004型号电子天平，上海舜宇恒平科学仪器有限公司；HH.S精密恒温水浴锅，江苏金坛市医疗仪器厂；752型紫外可见分光光度计，上海菁华科技仪器有限公司；OPTIKA 显微镜，上海伯建生物科技有限公司；HT-K219P粉末颗粒包装机，武汉海泰机械有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 金钱草茶的制备工艺。

1.2.1.1 喷雾干燥法制备金钱草茶。工艺流程：前期处理→金钱草水提法提取液的制备→添加辅料→高压均质→喷雾干燥→调配→包装。金钱草采摘后置于阳光下暴晒2 h加工，上笼蒸2～3 min，然后晒干即可［12］。金钱草经干燥粉碎后过50目筛，保存于自封袋中，置于干燥器中备用［13］。之后按罗兰等［14］的方法稍加优化，称取金钱草全草干燥粉50 g（已过50目筛），第一次加入1 L水煮沸后小火慢煎60 min，趁热过4层纱布，第二次加入800 mL蒸馏水同上慢煎40 min，趁热过滤合并2次滤液，用2个烧杯平分滤液，100 ℃分别浓缩到500 mL（以干重质量计即金钱草含量0.1 g/mL）。之后添加辅料20%麦芽糊精（100 g）、β-环状糊精2 g。制备好的金钱草茶速溶搅拌好进行高压均质（参数设置为压强30 MPa，t=10 min）及喷雾干燥得喷雾干燥原粉。之后按喷雾粉∶木糖醇=1∶0.5的比例调配。每份10 g进行包装。

1.2.1.2

高温漂烫法制备金钱草茶。工艺流程：高温漂汤（脱苦脱涩）→冷浸护色（漂洗）→风干脱水→杀青→烘干成型→包装。1 L烧杯加水，待水沸腾后，将鲜叶500 g（已截段2～3 cm）适量（25～35 g）投入烧杯中，煮沸1 min，迅速过凉水进行冷却护色及除杂。将护色处理后的金钱草取出来，散开摆置在有孔隙的筛子上风干全草表面水分，之后进行杀青［15］。将抖散后的叶片投入烘箱（温控80～90 ℃），除去60%～70%的水分，略湿不沾手。然后温控在 120～130 ℃，除去剩余15%的水分，松开手即散为宜，每袋50 g，用包装袋抽真空热塑封包装得到本品。

1.2.1.3

烘箱烘干法制备金钱草茶。工艺流程：前期处理→初次烘干→再次烘干→包装保存。新鲜金钱草清水洗净，沥干水分，切成2 cm左右短竿条。置于热风循环干燥箱中［16］，温控50 ℃将水分烘干至50%。之后再调温至60 ℃充分烘干，每0.5 h观察一次保证彻底烘干。每袋50 g，用包装袋抽真空热塑封包装得到本品。

1.2.1.4

日晒法制备金钱草茶。工艺流程：前期处理→阳光晾晒→包装保存。新鲜金钱草清水洗净后，薄摊晾晒，在10：00以前摊开，中午强光时放置阴凉处，下午光线不强时再晾晒，晾晒需多次翻动，直至彻底晒干为止。每袋50 g，用包装袋抽真空热塑封封口包装得到本品。

1.2.2

金钱草茶水提液的制备及模拟体外模型一水草酸钙消解观察试验。

1.2.2.1

金钱草水提液的制备。喷雾干燥法参照“1.2.1.1”方法，取一定量喷雾前浓缩液作为消解液，其余3种工艺同样取适量干茶叶，水提浓缩制成最终分别含生药0.05和0.10 g/mL梯度的水提液。

1.2.2.2

载玻片亲水性处理。第一步进行食人鱼溶液的配制，将（浓）H2SO4∶H2O4按3∶7比例充分混匀［17］，浓硫酸用玻璃棒引流缓慢倒入且匀速搅拌；第二步载玻片表面清洁先用洗洁精清洗再用超纯水冲洗至无泡；第三步载玻片表面羟基化处理是将需处理的载玻片轻放入食人鱼溶液中75 ℃加热1 h；第四步取出冷风直接吹干［18］待用。

1.2.2.3

消解试验。称取0.365 g CaC2O4·H2O，定容至500 mL容量瓶，配制成5 mmol/L的一水草酸钙浊液。空白组为50 mL一水草酸钙浊液+50 mL双蒸水；试验组为50 mL一水草酸钙浊液+50 mL金钱草水提液（分别含金钱草0.10和0.05 g/mL，以金钱草干粉计）。将空白组和试验组均用保鲜膜密封于（37±1）℃恒温室箱放置48 h，小心取出载玻片，自然风干，整个过程需在无菌室内进行操作，防止微生物污染，用OPTIKA高倍光学显微镜观察晶体变化。

1.2.3

4种工艺制备金钱草茶总多糖提取液和总黄酮提取液对结石消解效果比较。

1.2.3.1

总多糖提取液制备。喷雾干燥法取“1.2.1.1”中100 mL浓缩液（含10 g金钱草），其余3种方法取10 g制品粉末，水提浓缩至100 mL，置烧杯中加入3～4倍无水乙醇4 ℃下沉淀12 h，5 000 r/min离心得沉淀并用Sevage法除蛋白［19］，蒸馏水定容到100 mL得总多糖提取液，即为含生药0.1 g/mL的金钱草总多糖提取物，用于总多糖含量测定。

1.2.3.2

总黄酮提取液制备［20］。喷雾干燥法取“1.2.1.1”中100 mL浓缩液冷冻干燥，其余3种均取10 g制品粉末，加95%乙醇充分搅拌，静置24 h，过滤离心收集上清液得含生药0.1 g/mL总黄酮提取物，用于总黄酮含量测定。

1.2.3.3

总多糖含量梯度试验设计。在通过日晒工艺获得的样品中，分别取0（空白）、5、10、15、20、25 g，按“1.2.3.1”中方法提取总多糖，定容到100 mL［20］，即得到含金钱草0、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 g/mL的总多糖提取物消解液，待总多糖含量测定和消解试验备用。

1.2.3.4

总黄酮含量梯度试验设计。分别取0（空白）、5、10、15、20、25 g金钱草全草干草粉末（已过20目筛），按“1.2.3.2”提取总黄酮，定容到100 mL得到含生药0、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 g/mL的总黄酮消解液。取其中50 mL再次浓缩到20 mL测定总黄酮。

1.2.3.5

一水草酸钙含量测定。消解试验方法同“1.2.2.3”，区别是无须添加载玻片进行显微观察。通过滴定试验测定一水草酸钙含量，具体操作如下：酸液配制参照GB/T  601—2016，取36%～37%的HCl（浓）9 mL，注入1 000 mL水摇匀，密闭储存，使用前或者每14 d标定一次，用无水碳酸钠进行标定，溴甲基绿-甲基红作指示剂标定后HCl浓度为0.097 75 mol/L。一水草酸钙测定用紫色石蕊作指示剂，滴5滴紫色石蕊入待滴定液中，边滴定边摇匀，待溶液显红色且0.5 min内不褪色则为滴定终点。

1.2.4

总多糖测定。先称取0.1 g葡萄糖标准品溶解定容到100 mL配制成1 mg/mL的葡萄糖溶液，分别取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL葡萄糖标准溶液加双蒸水补至10 mL，制成0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14 mg/mL葡萄糖溶液，通过测定绘制得葡萄糖标准曲線Y=6.288 7X+0.017 7（R2=0.999 0），表明葡萄糖浓度在0～0.14 mg/mL呈现良好的线性关系。喷雾干燥法取浓缩液20 mL（近似于草干粉2 g），补水到60 mL（近似于2 g料液比为1∶30的水量）置于烧杯中加入3～4倍无水乙醇，再经过后续处理得总多糖溶液。其余3种各取2 g茶制品，通过提取进行总多糖含量的测定。在具塞试管加入5 mL蒽酮-硫酸溶液，取1 mL样品或标准品，轻微摇匀，沸水水浴10 min，流水冷却。在620 nm下测吸光度［20］，根据标准曲线计算总多糖，每个样品测3次且每次3个平行，分别计算平均值和RSD。

1.2.5

总黄酮测定。称量芦丁对照品5.1 mg，加入60%乙醇溶解，定容至50 mL容量瓶，得芦丁标准样液，通过计算浓度为0.102 mg/mL。精确吸取芦丁标品溶液0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0、14.0 mL于10 mL比色管中，加入60%乙醇1 mL、5%亚硝酸钠溶液0.3 mL，轻轻摇匀后放置10 min；加入10%硝酸铝溶液0.3 mL，再次摇匀后放置10 min；最后加入4%氢氧化钠溶液2.0 mL，用60%乙醇定容至10 mL，摇匀静置15 min，在510 nm下检测绘制标准曲线［14］。得出芦丁标准曲线为Y=0.85X-0.0029（R2=0.999 5），表明芦丁标准液浓度在0.204～1.428 mg/mL呈现良好的线性关系。喷雾干燥法取50 mL浓缩液，参照“1.2.3.2”制备样品，其余制品取5 g进行提取测定。该试验总黄酮的测定原理是采用硝酸铝比色法［21-22］，用芦丁作为标准样。根据芦丁标准曲线方程计算金钱草总黄酮含量，每个样品测3次且每次3个平行，分别计算平均值和RSD。

2 结果与分析

2.1 4种工艺制备金钱草茶体外消解结石效果对比

由10×40高倍显微观察图（图1）分析可知，4种工艺制备的金钱草茶与空白对照组（A0、B0、C0、D0）对比，均显示一水草酸钙有被消解的现象，并且消解现象随着样液浓度增高消解现象明显。烘箱烘干法（C组）和日晒法（D组），当浓度梯度达到0.10 g/mL时，一水草酸钙晶体几乎以很小的聚合分子形式存在，其次是高温漂汤法（B组），最后是喷雾干燥法（A组）。相比4种制备工艺，烘箱烘干法和日晒法较其他2种制备工艺的消解效果较好。产生这样的原因有可能是制备工艺对消解结石的活性成分含量或成分影响的现象。

注：A.喷雾干燥法；B.高温漂烫法；C.烘箱烘干法；D.日晒法。A0、B0、C0、D0代表50 mL一水草酸钙浊液+50 mL双蒸馏水；A1、B1、C1、D1代表50 mL一水草酸钙浊液+50 mL的0.05 g/mL样液；A2、B2、C2、D2代表50 mL一水草酸钙浊液+50 mL的0.10 g/mL样液。显微镜观察倍数10×40。

Note：A.Spray drying method；B.High temperature blanching method；C.Oven drying method；D.Sunlight method.A0，B0，C0 and D0 represent 50 mL calcium oxalate monohydrate turbid solution+50 mL double distilled water；A1，B1，C1 and D1 represent 50 mL calcium oxalate monohydrate turbid solution+50 mL 0.05 g/mL sample solution；A2，B2，C2 and D2 represent 50 mL calcium oxalate monohydrate turbid solution+50 mL 0.10 g/mL sample solution.Microscopic magnification is 10 × 40.

2.2 4种工艺制备茶总多糖提取液和总黄酮提取液结石消解效果对比

由图2可知，日晒法制备工艺所提取的总多糖提取液和总黄酮提取液均对一水草酸钙清除效果最好，其次是喷雾干燥法和烘箱烘干法，而高温漂汤法提取的总多糖提取液和总黄酮提取液对一水草酸钙清除效果较差。这可能与制备过程中总多糖和总黄酮的损失有关。

2.3 不同浓度总多糖和总黄酮提取液与结石消解效果相关性

由图3可知，随着总多糖含量与总黄酮含量的增加，一水草酸钙含量逐渐降低，总多糖和总黄酮均与一水草酸钙含量呈现良好的负相关。很好地证明了总多糖和总黄酮可能是一水草酸钙消解的主要作用成分。

2.4 4种工艺制备金钱草茶总多糖和总黄酮含量测定

由表1可知，4种工艺得到的金钱草茶制品中总多糖含量为0.71%～0.78%，总黄酮含量为3.05%～4.01%。其中日晒法制备的总多糖和总黄酮含量最高，其次是喷雾干燥法和烘箱烘干法，高温漂烫法制备的总多糖和总黄酮含量最低，其分析可能是由于经过一系列高温漂烫和杀青等工艺，导致总多糖和总黄酮物质稳定性下降从而受到破坏。这与4种工艺方法其消解之后一水草酸钙含量对比所得结果基本一致。

3 讨论与结论

该试验主要通过对4种金钱草制备工艺进行体外模拟消解试验，证明这种常用于治疗结石的中草药金钱草具有很强的消解结石的效果，且通过显微镜直观地观察到4种工艺制备金钱草茶水提物对结石的消解程度。另外，该研究分别提取金钱草中总多糖和总黄酮并进行体外消解结石相关性试验验证，结果显示，总多糖和总黄酮对于体外模拟消解结石均具有极强的消解效果，并且随着浓度的增加，消解效果增加，这与林瑶等［6，8］的研究结果一致。冯丽华等［23］研究得出金钱草总黄酮的超声提取工艺的提取率在4.84%～6.33%，与该研究结果接近。通过该试验探索得出4种制备工艺（喷雾干燥法、高温漂烫法、烘箱烘干法、日晒法）中，日晒法制备工艺所制备的金钱草茶对体外消解结石效果最好，其中总多糖和总黄酮是其主要消解作用成分。

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