1株携带blaNDM-1的临床多重耐药豚鼠气单胞菌的基因组及表型鉴定

李玲 ,周宏伟 ,张嵘

(1.湘乡市人民医院检验科,湖南湘潭411100;2.浙江大学医学院附属第二医院检验科,杭州 310003)

气单胞菌属(Aeromonas)属于气单胞菌科,为具有端鞭毛的革兰阴性杆菌,氧化酶和触酶阳性,能降解硝酸盐为亚硝酸盐,发酵葡萄糖,广泛分布于自然界。部分菌种可引起人类、鱼类和其他水生动物的疾病,是一种典型的人—畜—鱼共患病病原菌。与临床病例96.5%相关的气单胞菌主要有4种:嗜水气单胞菌、豚鼠气单胞菌、嗜水气单胞菌达卡亚种及维氏气单胞菌。气单胞菌为机会致病菌,能引起人类的肠道内感染(如肠胃炎)和肠道外感染(如皮肤软组织感染、尿路感染和败血症等)[1]。

新德里金属β-内酰胺酶1(New Delhi metallo-β-lactamase-1,NDM-1)是一种能水解包括碳青霉烯在内的所有β-内酰胺类抗菌药物,不水解氨曲南的金属β-内酰胺酶。自2008年首次在印度新德里被发现以来,全球多个国家和地区都发现产NDM-1细菌的流行,并不断有新发的感染病例出现,给临床治疗和感染防控带来严重挑战,已成为全球重大的公共卫生问题。到目前为止,共报道了40种NDM的变异体。NDM-1主要来源于大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌等肠杆菌目细菌,其他细菌如鲍曼不动杆菌也有产NDM-1的报道[2]。气单胞菌产NDM的报道较少,仅浙江省报道过1例从血液样本分离到携带blaNDM-1的豚鼠气单胞菌[3]。本研究报道1例从湖南省湘乡市人民医院患者粪便筛查获得的产NDM-1的豚鼠气单胞菌(XX182)的基因特征。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1菌株来源 2022年7月筛查湖南省湘乡市人民医院住院患者粪便标本中碳青霉烯耐药革兰阴性杆菌时分离到1株产碳青霉烯酶豚鼠气单胞菌。该患者为69岁女性,家住农村,于2022年7月5日因发作性头晕入住湖南省湘乡市人民医院,有“冠心病、高血压、高脂血症”病史。住院期间予以阿司匹林肠溶片、阿托伐他汀钙片、盐酸氟桂利嗪胶囊、苯磺酸左氨氯地平等对症支持治疗,患者症状好转,于2022年7月11日出院。

1.1.2主要试剂及仪器 中国蓝平板(郑州安图生物公司)、微量肉汤药敏板(珠海迪尔公司)、PureLink细菌基因组提取试剂盒(美国赛默飞公司)、PCR引物(上海生工生物公司)、GARBA酶型试剂盒(上海复星公司)、基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱(matrix-assited laser desorption inoization-time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS)仪(德国布鲁克公司)、PCR仪(美国ABI公司)、恒温振荡培养箱(武汉汇诚公司)。

1.2方法

1.2.1气单胞菌的培养与鉴定 用无菌棉签挑取1 g左右粪便接种到5 mL LB肉汤中,37 ℃温育过夜。将10 μL增菌液转种于含0.3 μg/mL美罗培南的中国蓝琼脂平板上,37 ℃温育过夜。挑取可疑菌落用MALDI-TOF MS质谱仪进行鉴定。

1.2.2微量肉汤稀释法检测抗菌药物最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration, MIC) 根据美国临床和实验室标准协会(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)2020指南[4],使用微量肉汤稀释法对豚鼠气单胞菌进行药敏试验。药敏试验药物为:碳青霉烯类(亚胺培南、厄他培南、美罗培南),头孢菌素类(头孢吡肟、头孢美唑、头孢噻肟、头孢他啶),β-内酰胺酶/β-内酰胺酶抑制剂(头孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、头孢他啶/阿维巴坦),环丙沙星,阿米卡星和氨曲南。多黏菌素B与替加环素折点参考欧洲抗菌药物敏感性试验委员会(EUCAST)。质控菌株为大肠埃希菌ATCC 25922及铜绿假单胞菌ATCC 27853。

1.2.3PCR检测碳青霉烯酶耐药基因亚型 用煮沸法提取细菌DNA,PCR扩增常见的碳青霉烯酶耐药基因(blaNDM、blaKPC、blaVIM和blaIMP)。引物序列[5]见表1。PCR检测反应体系为50 μL,包括PCR Mix 25 μL, ddH2O 22 μL,10 pmol/mL上、下游引物各1 μL,DNA模板1 μL。PCR反应条件为:95 ℃预变性4 min;95 ℃变性30 s,退火温度根据引物确定(见表1),退火30 s,72 ℃延伸1 min,30个循环;72 ℃充分延伸10 min。取3 μL PCR扩增产物行10 g/L琼脂糖凝胶电泳,凝胶成像系统显像观察结果,PCR产物送上海生工生物技术公司,在ABI 3730XL测序仪上进行Sanger测序,测序结果在NCBI中进行BLAST比对以确定基因亚型(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)。产KPC酶嗜水气单胞菌[6]和产NDM酶大肠埃希菌[7]的阳性对照菌株由浙江大学医学院附属第二医院张嵘教授惠赠。

表1 目的基因引物序列及长度

1.2.4全基因组测序 采用PureLink细菌基因组提取试剂盒提取菌株基因组,并送至华大基因公司采用Illumina HiSeq X Ten二代测序仪进行全基因组测序。用SPAdes v3.13.1软件进行组装,获得基因组草图[8]。采用mlst软件(https://github. com/tseemann/mlst)分析该菌株的ST分型。用ResFinder v4.1分析该菌株所携带的耐药基因[9]。用PlasmidFinder v2.0.1软件分析其所携带的质粒类型[10]。利用CLC Genomics Workbench v9软件的在线BLAST功能,比对出NCBI数据库与该菌株的质粒元件相似的质粒,并用BRIG软件绘制质粒图谱[11]。用VFDB分析软件鉴定豚鼠气单胞菌的毒力因子(http://www.mgc.ac.cn/VFs/main.htm)。

1.2.5接合试验(滤膜法) 豚鼠气单胞菌XX182和受体菌大肠埃希菌EC600(利福平耐药)分别转种于血平板上,35 ℃温育过夜。挑取单个菌落转种至5 mL LB肉汤中,35 ℃振荡(300 r/min)温育过夜,再分别将供体菌和受体菌在LB肉汤中1∶100稀释,35 ℃振荡(200 r/min)温育4 h。取供体菌和受体菌各50 μL于滤膜上,置于血平板上37 ℃温育过夜。刮取滤膜上所有菌落于LB肉汤稀释后取100 μL混合菌液涂布于筛选平板上,37 ℃温育过夜。筛选平板为含利福平(600 μg/mL)和美罗培南(2 μg/mL)的中国蓝筛选平板。

2 结果

2.1豚鼠气单胞菌(XX182)的药敏试验结果 该菌株对头孢菌素、碳青霉烯类、环丙沙星和多黏菌素耐药,对替加环素、阿米卡星和氨曲南敏感。见表2。

表2 豚鼠气单胞菌XX182的药敏结果

2.2碳青霉烯酶耐药基因检测 碳青霉烯酶耐药基因结果为XX182菌株blaNDM-1基因阳性,见图1。

2.3测序结果分析 如图2菌株XX182经组装获得了该菌的基因组草图,共组装得到281条contig,序列总长度为4 668 603 bp,最长的contig为290 359 bp。N50和N90的长度分别为120 474 bp和25 409 bp。其基因组G+C含量为61.34%。MLST分析结果显示菌株XX182为不能分型,表明其属于新ST型。该菌株携带多种抗菌药物耐药基因,主要包括blaNDM-1、blaMOX-6(n=2)、blaRSA-1、blaTEM-1、aac(3)-Ⅱd、cmlA5、arr-2、dfrA1、dfrA12等。序列比对结果显示,blaNDM-1基因相关元件与豚鼠气单胞菌的pK433-NDM质粒(GenBank序列号:OK287926)和pFAHZZU2447_NDM质粒相似度较高(GenBank序列号:CP100393)。pK433-NDM质粒总长度为200 855 bp,总G+C含量为55.0%,包括199个开放阅读框,不携带结合转移相关基因元件。该质粒为多重耐药质粒,携带的耐药基因包括blaNDM-1、blaMOX-6、blaTEM-1(n=2)、mph(A)、sul1(n=2)、dfrA12和aac(3)-Ⅱd。PlasmidFinder 软件无法对pK433-NDM质粒进行分型。

注:M,DL2000 DNA;1,blaNDM-5;2,blaNDM-1;3,blaVIM;4,blaIMP;5,blaKPC。

该菌株携带多种毒力因子,包括极鞭毛、侧鞭毛、甘露糖敏感血红素凝集素、Ⅳ型Tap菌毛、T6SS和T2SS分泌系统、溶血素A、耐热溶血素和荚膜多糖抗原等。

2.4接合试验 未检测到接合子。

3 讨论

近年来随着临床抗菌药物的广泛应用,已从临床、动物、食品和环境样本中分离出耐多药气单胞菌菌株,特别是碳青霉烯类耐药菌株在不同国家的流行率从0.5%到7.7%不等[12]。2014年在以色列一家医院发现类产VIM的豚鼠气单胞菌[13],2019年在中国四川一家医院的废水监测中分离到1株同时产KPC-2和IMP-4的豚鼠气单胞菌[14]。但产NDM的豚鼠气单胞菌的报道罕见。本研究的豚鼠气单胞菌XX182分离自湖南省湘乡市人民医院神经内科住院患者的粪便标本,该患者家住农村,住院期间无抗菌药物暴露史,为社区获得的无症状携带者。无症状携带者在耐药菌的无声传播中发挥着重要的作用。

注:本图以pK433-NDM质粒序列为参考序列进行绘制。

该菌的药敏结果为对碳青霉烯类、头孢菌素类耐药,对氨曲南敏感,PCR检测基因型为NDM-1,基因分型该菌携带blaNDM-1,说明耐药表型和基因型一致。该菌质粒上还携带了很多其他耐药基因,如编码β-内酰胺酶耐药基因的blaMOX-6、blaRSA-1、blaTEM-1;编码氨基糖苷类耐药基因的aac(3)-Ⅱd,编码磺胺类碇耐药基因的sul1,编码甲氧苄啶耐药基因的dfrA1、dfrA12,编码大环内酯类耐药基因的mph(A),利福平耐药基因的arr-2和编码外排泵与氯霉素耐药相关的基因cmlA5。因豚鼠气单胞菌XX182的耐药质粒缺少tra等与接合相关的元件,导致其与大肠埃希菌的接合失败。

多黏菌素是一组由多黏类芽胞杆菌产生的一组多肽类抗菌药物,携带正电荷,竞争性地与革兰阴性杆菌外膜上脂多糖(LPS)的脂质A进行结合,破坏细胞膜的稳定性,进而发挥杀菌作用。随着多耐药菌和泛耐药菌的出现,多黏菌素作为对抗耐药菌的最后手段,又被重新用于临床抗感染。紧接着出现多黏菌素的耐药性,自2015年中国首次报道质粒介导的mcr-1基因以来[15],已在世界各地27种细菌种发现该基因。有文献报道从一位腹泻患者分离到同时携带多黏菌素耐药基因mcr-3.3和碳青霉烯酶耐药基因blaKPC-2的豚鼠气单胞菌[16]。除携带mcr外,其他豚鼠气单胞菌的多黏菌素耐药机制尚不明确,但是有报道显示嗜水气单胞菌的多黏菌素耐药机制可能为:(1)EnvZ/OmpR上调arnBACDTEF操纵子的表达,介导L-Ara4N对LPS的修饰;(2)EnvZ/OmpR调节自身转运基因的表达,从而降低黏菌素对外膜通透性的响应;(3)EnvZ/OmpR的缺失激活PhoP/PhoQ,后者作为一个替代的双组份系统,通过pmrC介导磷脂酰乙醇胺加入脂质A;(4)mlaFD173A突变体通过上调Mla途径产生高水平的多黏菌素耐药性[17]。本研究中豚鼠气单胞菌XX182质粒上没有编码多黏菌素的耐药基因mcr,也表现为对多黏菌素B耐药,因此这株菌的耐药原因有待进一步研究。

豚鼠气单胞菌的毒力和致病机制尚不清楚,通过对毒力基因的分析,XX182含有多种毒力因子,如T6SS和T2SS分泌系统、极鞭毛、侧鞭毛、甘露糖敏感血红素凝集素、Ⅳ型Tap菌毛、溶血素A、耐热溶血素和荚膜多糖抗原等,这些毒力因子可以帮助该菌黏附在宿主表面,抵抗吞噬和补体系统,造成宿主细胞和组织损伤,逃避宿主免疫反应,帮助细菌黏附在细胞表面形成生物膜[18]。

综上所述,该菌株对碳青霉烯类耐药主要由产NDM-1型碳青霉烯酶导致,且NDM-1耐药基因位于不可接合质粒上,尽管目前气单胞菌属对碳青霉烯类耐药率较低,但该菌携带多种耐药基因,耐药谱广,且其携带的多种毒力因子给临床抗感染治疗带来挑战,仍应加强对该克隆菌株的监测,以有效遏制耐药菌在该地区的传播。