大黄的生物学功能及其在水产养殖中的应用

卫力博,任同军,2,王福强,2,韩雨哲,2

( 1.大连海洋大学 水产与生命学院,辽宁 大连 116023; 2.辽宁省北方鱼类应用生物学与增养殖重点实验室,辽宁 大连 116023 )

在目前的水产养殖模式下,过度或违规使用抗生素已成为制约水产养殖健康可持续发展的关键因素之一,因此研发安全绿色的新型渔药已成为水产养殖的重点研究方向。中草药相对于化学药物具有无污染、成本低廉和资源丰富等优点,在水产研究中的应用受到越来越多的关注[1-2]。现有研究表明,中草药在水产养殖中具有促进生长、增强机体免疫和病害防治等功能,是抗生素的良好替代品[3-6]。其中大黄作为我国传统中药之一,具有凉血解毒、清热泻火、泻下攻积、逐瘀通经、利湿退黄的功效,广泛应用在医学领域[7]。另外,以大黄为主要原料制备的商品化渔药(大黄末、三黄粉、病毒清等)在渔病防治方面已取得了良好的效果,大黄作为新型绿色渔药在水产养殖中的应用前景广泛。笔者总结了大黄的相关基础研究及其在水产养殖中的应用现状,为今后大黄在水产养殖中的合理开发和推广应用提供理论参考。

1 大黄活性成分及其生物学功能

大黄(Radix et Rhizoma Rhei),为廖科大黄属多年生高大草本植物,实际应用中的大黄多为掌叶大黄(Rheumpalmatum)、唐古特大黄(R.tanguticum)或药用大黄(R.officinale)干燥的根及根茎[7-8],又称将军、黄良、火参和锦纹等。目前大黄作为药物已载入19个国家的药典,全世界的大黄属植物大约有60种,其中我国主要集中分布在西北及西南一带[9]。近年来,国内外学者对大黄的化学成分进行了分析,主要包括蒽醌类、蒽酮类、二苯乙烯类、苯丁酮类、色原酮类、黄酮类、鞣质类、多糖类等成分,其次还包括挥发油、甾醇类、有机酸类及微量元素等[8]。而大黄中蒽醌类成分质量分数为3%～5%,是大黄最主要的活性成分,主要分为游离型蒽醌和结合性蒽醌,其中游离型蒽醌主要包括大黄酸、大黄素和大黄酚等[10]。

1.1 大黄酸

大黄酸在大黄中的质量分数为0.2%～0.4%,属于单蒽核类1,8-二羟基蒽醌衍生物[10],结构式见图1。大黄酸已被证明具有抗氧化、抗炎和抗菌等生物学功能。研究表明,大黄酸可降低镉染毒大鼠(SPF级雄性Wista大鼠,200～240 g,北京维通利华实验动物技术有限公司提供,许可证编号:SCXK京2009-0004)体内丙二醛、乳酸脱氢酶的含量,增加一氧化氮合酶、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶的活性,进而对机体的氧化损伤起到保护作用[11];魏明艳[12]通过提取“地黄-大黄”对应的活性成分“梓醇-大黄酸”,探究其对试验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠(SPF级C57BL/6雌性小鼠,6～8周龄,18～22 g,北京维通利华实验动物技术有限公司,许可证编号:SCXK京2012-0001)的作用机制,结果表明,梓醇配伍大黄酸具有显著的抗炎和免疫调节作用;孙文武等[13]分离出感染类风湿关节炎的大鼠腹腔巨噬细胞、脾淋巴细胞,使用大黄酸处理后发现,大黄酸可以抑制巨噬细胞释放炎介质一氧化氮,同时抑制关节炎淋巴细胞的趋化作用;而大黄酸作为植物抗生素对葡萄球菌(Staphylococcus)、链球菌(Streptococcus)、白喉杆菌(Corynebacteriumdiphtheria)、枯草杆菌(Bacillussubtilis)、炭疽杆菌(B.anthracis)、伤寒杆菌(Salmonellatyphi)、痢疾杆菌(Shigellacastellani)等均具有显著的抗菌活性[14]。

图1 大黄酸的结构骨架[7]Fig.1 The structural frame of rhein

1.2 大黄素

大黄素在大黄中的质量分数为0.15%～0.40%,化学结构式为1,3,8-三羟基-6-甲基蒽醌[10],结构式见图2。与大黄酸类似,大黄素也同样具有抑菌、抗病毒、抗氧化、抗炎及保护肝脏等生物学功能。研究表明,大黄素对冠状病毒[15]、乙肝病毒[16]及脊髓灰质炎病毒[17]等均具有抑制作用;焉鑫[18]的研究表明,大黄素会显著降低金黄色葡萄球菌(S.aureus)生物被膜形成相关基因的表达和群体感应系统信号分子AI-2的释放,抑制细菌生物被膜的形成,进而在控制金黄色葡萄球菌感染和抗菌方面有良好的效果;据相关报道,大黄素具有清除羟自由基、抑制脂质过氧化物以保护机体免受损伤的作用;马春艳等[19]用大黄素配伍芹菜素对自发性高血压大鼠(SPF级雄性SHR大鼠,13周龄,北京维通利华实验动物技术有限公司,许可证号:SCXK京2016-0611)通过灌胃进行给药6周后发现,药用组可显著降低其肾脏中丙二醛含量,提高超氧化物歧化酶活性,减少高血压对其肾脏的氧化损伤;张昊悦等[20]研究发现,大黄素可以调节Nrf-2/HO-1和MAPK信号通路,进而抑制由脂多糖诱导的小鼠单核巨噬细胞(小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7,中国科学院上海科学研究院细胞库)的细胞炎症和氧化应激;张丽丽等[21]通过复合致病因素法建立肝纤维化大鼠(CL级成年雄性SD大鼠,200～220 g,北京军事科学院实验动物中心)模型后用大黄素进行干预,结果显示,大黄素可抑制肝脏纤维化的形成,降低肝脏的氧化应激水平,对肝脏起到一定的保护作用。

图2 大黄素的结构骨架[7]Fig.2 The structural frame of emodin

1.3 大黄酚

大黄酚在大黄中的质量分数为0.3%～1.1%,化学结构式为1,8-二羟基-3-甲基-蒽醌,结构式见图3。其生物学功能主要集中在抗氧化方面,沈丽霞等[22]在使用不同剂量的大黄酚对经AlCl3致急性衰老的小鼠(KM小鼠,18～20 g,张家口医学院动物管理室)进行注射给药后发现,大黄酚可显著提升其脑组织中超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶的活性,推测其作用机制可能是通过增加抗氧化酶活性,清除氧自由基从而减少机体的氧化损伤。

图3 大黄酚的结构骨架[7]Fig.3 The structural frame of chrysophanol

2 大黄在水产中的主要应用

2.1 给药方法及抑菌作用

大黄具有价格低廉、绿色无污染等特点,在水产养殖的病害防治方面已被广泛研究和应用。田海军等[23]按一定比例将大黄、苦参、贯众、百部、五倍子粉末混合煎煮后取不同质量浓度药液,发现150 mg/mL的药液对鳜(Sinipercachuatsi)无毒害作用并能有效地杀灭指环虫;邓海红等[24]用大黄、黄芩、黄柏(质量比为4∶3∶3)制成三黄粉治疗被病菌感染的史氏鲟(Acipenserschrenckii),投药至第3天史氏鲟停止死亡,连续投喂5 d后史氏鲟摄食恢复正常,治愈率高达96%。在养殖过程中,大黄的给药方法主要分为投喂、浸泡和泼洒等,其中:在针对鱼类体表病,如小瓜虫(Ichthyophthiriusmultifiliis)寄生、白头白嘴病等的防治措施中,主要以中草药水煎液进行全池泼洒和药浴;而在针对病毒性疾病,如出血病、传染性胰腺坏死病,和某些细菌性疾病,如细菌性肠炎、烂鳃病等时,则需将大黄等中草药粉拌入饵料中进行投喂,并辅以药浴进行预防和治疗。大黄在实际养殖中作为病害预防手段的应用见表1。

大黄可作为植物性抗生素用于病害防治,主要因为其含有大黄素、大黄酸等蒽醌类活性物质,对水产养殖中常见病原菌具有很强抑制作用。周群兰等[30]在评估大黄蒽醌类物质对水产养殖中常见病菌的抑菌效果时发现,其对嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)的最小抑菌质量浓度和最小杀菌质量浓度均为0.25 mg/mL,对鳗弧菌(Vibrioanguillarum)、副溶血弧菌(V.parahemolyticus)、点状产气单胞菌(A.punctatasubpunctate)也有很强的抑制作用;此外在进行药敏试验后发现,大黄提取物对嗜水气单胞菌的抑菌圈直径可达到氯霉素抑菌圈的70.34%,诺氟沙星的61.82%;综合两种结果可知,大黄提取物对水产养殖中常见病原菌可以达到良好的抑制作用。黎家勤等[31]在进行大黄和公丁香对哈氏弧菌(V.harveyi)的抑菌试验时发现,大黄的抑菌圈直径为(15±0.4) mm,相较于公丁香[(11.53±0.6) mm]具有更强的抑菌效果,并且在抑制哈维氏弧菌(V.harveyi)生物膜形成方面同样效果显著。张传亮等[32]在分析27种中草药及5种中药复方配伍的体外抑菌活性试验中发现,大黄、黄连、金银花和复方(黄连、金银花和连翘)对常见病原菌具有显著的抑制效果。分析大黄的抑菌效果差异时发现,大黄的抑菌效果主要与有效成分的差异和试验方法的差异有关:一方面,大黄不同的提取方法对同一菌种的抑菌效果会出现差异,针对大黄进行超微粉碎、超声波提取等技术处理后的抑菌效果要高于水煎剂、乙醇提取等传统粗提方法;另一方面,大黄及其蒽醌对病原菌的抑菌试验主要以体外抑菌为主,测定方法主要包括抑菌圈直径测定、最小抑菌质量浓度和最小杀菌质量浓度的测定,但每种测定方法也包括多种试验方法,同时试验中临床分离出的菌种以及亚种之间也存在差异,对试验结果均会存在潜在影响。大黄蒽醌主要通过影响病原菌的形态、遗传物质和能量代谢起到抑菌作用,大黄素会改变病原菌细胞膜的通透性,加速内容物流出从而杀死细菌,在探究蒽醌类化合物对嗜水气单胞菌作用的分子机制时发现,大黄素会与DNA的磷酸基团结合并嵌入到碱基对之间,影响DNA的复制与转录,导致细菌死亡[33]。另外,研究表明,大黄酸会抑制细菌自身线粒体呼吸链的电子传递,从而导致NADH脱氢酶、琥珀酸脱氢酶等活性下降,阻碍细菌底物氧化和脱氢过程使其死亡[34]。大黄及蒽醌对各病原菌的抑菌效果见表2。

表2 大黄及其蒽醌的抑菌效果Tab.2 Antibacterial effect of rhubarb and its anthraquinone

(续表2)

2.2 调节免疫的作用

多数水产养殖种类自身机体的防御机制仍主要为非特异性免疫[43],鱼类的非特异性免疫主要分为3部分,外部屏障(鳞片、表皮和黏液等)、细胞免疫(吞噬细胞、淋巴细胞等)和体液免疫(溶菌酶、C3补体等)。中草药可调节机体免疫的功能已被证明,其中大黄及其蒽醌对生物非特异性免疫的影响也有较多报道。陈孝煊等[44]分别将大黄、穿心莲、金银花和板蓝根粗提后混入异育银鲫(C.auratusgibelio)基础饲料中进行投喂,结果显示,这4种中草药可明显提高白细胞的吞噬活性和血清、体表黏液中溶菌酶的活性。明建华等[45]在团头鲂(Megalobramaamblycephala)饲料中添加60 mg/kg的大黄素饲喂60 d后进行嗜水气单胞菌攻毒试验,结果显示,药物组可显著降低其死亡率,此外与对照组相比,试验组团头鲂血清中碱性磷酸酶和溶菌酶水平显著提高,肝脏中HSC70 mRNA和HSP70 mRNA的表达量明显上升。杨维维等[46]在饲料中添加75 mg/kg大黄素可以显著提高克氏原螯虾(Procambarusclarkia)血清中溶菌酶活性、铜蓝蛋白含量、肝胰腺谷胱甘肽含量和过氧化氢酶活性。Yang等[47]在仿刺参(Apostichopusjaponicus)饲料中分别添加大黄粉(大黄素含量0.93%)、蜡样芽胞杆菌、酵母多糖和氟苯尼考,结果显示,大黄粉添加组和蜡样芽胞杆菌添加组的的仿刺参体腔液碱性磷酸酶活性显著高于对照组和氟苯尼考添加组,表明大黄素是天然的免疫增强剂,然而高浓度大黄蒽醌可能会对机体产生负面作用。Kuo等[48]通过观察斜带石斑鱼(Epinepheluscoioides)头肾白细胞对大黄蒽醌提取物的免疫应答后发现,低浓度大黄蒽醌提取物会增强白细胞的吞噬活性,但高浓度组白细胞吞噬活性下降并且形态开始出现变化,表明高浓度的大黄蒽醌可能具有细胞毒性,对机体免疫造成损伤。在使用不同浓度大黄素处理草鱼肝细胞的试验中也发现了类似的结果,高浓度大黄素会诱导草鱼肝细胞线粒体膜电位改变,导致细胞凋亡[49]。此外,高剂量大黄添加组饲料在投喂仿刺参3周之后,仿刺参会出现化皮现象[50]。因此,在探究大黄及其蒽醌与机体免疫的相关试验时,需要考虑到有效成分的剂量问题。

2.3 提升抗氧化能力的作用

与高等动物相同,水产养殖动物也是依靠自身的抗氧化系统来保证机体健康。鱼类的抗氧化系统主要由抗氧化酶(过氧化氢酶、超氧化物歧化酶等)和非酶物质(谷胱甘肽、热休克蛋白等)组成[6]。大黄素等可清除氧自由基、抑制脂质过氧化物产生的作用在临床医学上已被证明,且关于大黄对水生生物抗氧化能力方面的研究也有类似的结果。刘波等[51]的试验表明,大黄蒽醌提取物可以显著提高罗氏沼虾(Macrobrachiumrosenbergii)过氧化氢酶和超氧化物歧化酶的活性,降低丙二醛含量,并在高温应激48 h后药物组的肝胰腺抗氧化能力依旧强于对照组。曹丽萍等[52]全面评价了大黄素对CCl4诱导建鲤(C.carpiovarJian)肝损伤后的保肝效果,试验组鱼腹腔注射0.05 mL/g鱼体质量的30%的CCl4,对照组鱼腹腔注射等量橄榄油,禁食72 h后取血清与肝脏进行检测。结果显示,中、高剂量药物组可明显降低血清中谷丙转氨酶、谷草转氨酶及乳酸脱氢酶的水平,并显著抑制肝脏中CCl4对CYP450酶的诱导,降低CYP1A、CYP3A的mRNA表达[52]。此外,使用DPHH自由基分析法评价大黄素抗氧化能力时,6 μg/mL的大黄素清除自由基能力可达到81%,表明大黄素可作为理想的抗氧化添加剂[52]。Song等[53]评价了大黄素对氧化鱼油诱导团头鲂氧化损伤的修复效果,通过在氧化鱼油饲料中添加大黄素进行饲养,结果显示,大黄素可显著降低肝脏中总超氧化物岐化酶、抗超氧阴离子自由基的活性和丙二醛含量,修复肠道损伤。说明大黄素在修复氧化损伤方面同样具有巨大的潜力。大黄对机体的抗氧化能力的影响,其作用机制可能在于蒽醌类物质会调控体内参与抗氧化过程相关基因的表达,Song等[54]基于双向电泳的蛋白质组学方法评价大黄素对团头鲂肝脏差异蛋白质组的潜在影响,探究大黄素对机体抗氧化能力的作用机制,试验表明,在27种差异表达蛋白中,ALDOB、GAPDH、GPx1、GSTm、HSP70、ME1、LDHHB、Pgk1、Aldh8a1、Sord均参与了氧化代谢过程,并且大黄素会通过下调蛋白质(ALDOB、GAPDH、LDHHB、Pgk1、Eno3)的表达来抑制糖酵解,并通过磷酸戊糖途径逆向激活NADPH。同时NADPH刺激活性氧的产生,进而上调GPx1、GSTm和HSP70基因的表达来激活抗氧化系统和NF-κB信号通路,最终提高机体的抗氧化能力。Song等[53,55]的研究也表明,适量的大黄素可以有效降低氧化鱼油诱导的过氧化物酶体增殖物激活受体表达和改善Nrf2-Keap1信号通路及其下游靶点的表达,提升超氧化物歧化酶和过氧化氢酶的mRNA表达,印证了大黄素对于维持机体氧化还原稳态具有很强的调控能力。综上所述,大黄及其蒽醌无论是增强动物自身抗氧化能力还是在修复氧化损伤方面都有重大的研究意义。大黄素增强机体抗氧化能力的作用机制见图4。

图4 大黄素增强机体抗氧化能力的作用机制[54]Fig.4 The mechanism of enhancement of body′s antioxidant capacity by emodin黄色缩写表示大黄素作用机体后的差异表达蛋白,虚线箭头表示差异蛋白的mRNA表达水平,实线表示差异蛋白的蛋白表达水平,红色表示上调,绿色表示下调;G6P.6-磷酸葡萄糖;FDP.1,6-二磷酸果糖;GAP.3-磷酸甘油醛;1,3-BPG.1,3-二磷酸甘油酸;3-PG.3-磷酸甘油酸;PEP.磷酸烯醇丙酮酸;pyruvate.丙酮酸盐;lacate.乳酸盐;NAPDH.还原型辅酶Ⅱ;ROS.活性氧;H2O2.过氧化氢;NF-κB.核转录因子κB;ALDOB.果糖二磷酸醛缩酶B;GAPDH.3-磷酸甘油醛脱氢酶;pgk1.磷酸甘油酸激酶1;Eno3.烯醇化酶3;LDHB-B.乳酸脱氢酶-B;GPx1.谷胱甘肽过氧化物酶1;GSTm.谷胱甘肽S-转移酶;HSP70.热休克蛋白70;SOD.超氧化物歧化酶;MPO.髓过氧化物酶;CAT.过氧化氢酶;iNOS.诱导型一氧化氮合酶;TNF-α.肿瘤坏死因子-α;IL-1β.白介素1β;IL-6.白介素6;IL-12.白介素12.Abbreviations in yellow represent the altered proteins in present study, dashed arrows show mRNA expression, and solid arrows denote protein expression, the red color shows up-regulation, and the green color shows down-regulation; G6P. glucose 6-phosphate; FDP. 1,6 fructose diphosphate; GAP. glyceraldaldehyde-3-phosphate; 1,3-BPG. 1,3-bisphosphoglycerate; 3-PG. 3-phosphoglycerate; PEP. phosphoenolpyruvate; pyruvate; lacate ; NAPDH. nicotinamide adenine dinucleotide phosphate; ROS. reactive oxygen species; H2O2. hydrogen peroxide; NF-κB. nuclear factor κΒ; ALDOB. recombinant aldolase B, fructose; GAPDH. glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase; pgk1. phosphoglycerate kinase 1; Eno3. enolase 3; LDHB-B. lactate dehydrogenase-B; GPx1. glutathione peroxidase 1; GSTm. glutathione s-transferase; HSP70. heat stress protein 70; SOD. superoxide dismutase; MPO. myeloperoxidase; CAT. catalase; iNOS. inducible nitric oxide synthase; TNF-α. tumor necrosis factor-α; IL-1β.interleukins-1β; IL-6.interleukins-6; IL-12. interleukins-12.

2.4 其他作用

大黄在传统中医理论中具有“荡涤肠胃,推陈致新”的功效,而在水产养殖中,大黄及其蒽醌对动物肠道也有积极的作用。齐红莉等[56]用离体小肠平滑肌灌流法评价了不同质量浓度的大黄水煎剂对乌鳢(Channaargus)离体小肠运动性能的影响,结果显示,大黄水煎剂可以明显增强肠道平滑肌的收缩表现。而在大黄素对离体小鼠回肠影响的试验中也有相似的结果,其作用机制可能与大黄素触发机体释放内源性乙酰胆碱有关[57]。除此之外,大黄及其蒽醌对生物肠道菌群也会产生有益影响,刘波等[58]的研究表明,在建鲤饲料中加入大黄蒽醌提取物会明显抑制肠道内弧菌的生长,增加乳酸杆菌(Lactobacillus)的数量。动物机体在受到外部因子的应激后,体内活性氧因子快速升高,而大黄蒽醌类化合物有较强的清除氧自由基的能力,因此大黄及其蒽醌具有作为抗应激制剂的研究价值。Liu等[59]发现,用添加大黄素的饲料喂养团头鲂60 d后进行高密度应激24 h,与对照组相比,大黄素添加组团头鲂肝脏中HSP70 mRNA表达量和超氧化物歧化酶活性显著升高,血清中皮质醇含量及肝脏中丙二醛含量明显降低,说明大黄素可有效缓解高密度胁迫后的肝脏损伤,提升鱼体的抗应激能力。另外在基础饲料中添加大黄蒽醌类提取物,也可提升罗氏沼虾[51,60]、建鲤[61]的抗应激能力。大黄及其蒽醌在水产养殖中的其他功效作用还需要进一步研究。

3 大黄在水产中应用存在的问题及建议

大黄在水产养殖中的病害防治、调节机体免疫抗氧化等方面的应用已取得一定的效果,并且随着人们对粮食安全和生态保护的逐渐重视,大黄及其蒽醌类化合物在替代抗生素等化学药品方面将具有深入研究的价值。然而,大黄在水产养殖中的应用也存在着一些问题。第一,大黄在实际应用中会存在毒性问题。在实践中对于添加剂量和用药时间需要进行细化,大黄及其蒽醌的毒理学需要进一步的研究。第二,实际养殖中的使用方法相对落后。大黄在养殖生产中泼洒、浸泡等方法较为低效,利用率也无法评估,无法精准使用,因此对大黄及其蒽醌进行有效的针对性提取和分离以提高药效和减少盲目用药是较为必要的。第三,目前大黄在水产养殖的研究主要集中在淡水鱼、虾等,其作为添加剂应用于海水生物的相关研究还相对匮乏。第四,大黄及其蒽醌对于水生生物的作用机制研究并不完善。目前大黄蒽醌的生物学功能和对靶器官的作用途径大部分处于推测阶段,而大黄对于各生物体内的药代动力学依旧在起步阶段,因此需要运用分子技术阐明其作用机理,为大黄的合理利用奠定理论基础。第五,大黄的使用缺乏专业标准体系。大黄的有效成分会因其产地、品系、炮制方法等因素出现差异,因此只有规范生产、加工以及监测体系,才有可能实现大黄在水产养殖中的精准使用。

4 展 望

大黄在我国资源丰富,大黄蒽醌作为其最重要的活性物质,已展现出了多种生物学功能,应用范围广泛。在水产养殖中,大黄及其蒽醌对多种常见致病菌具有极强的抑制作用,可研发为新一代的绿色渔药,此外,大黄对动物机体免疫和抗氧化性能具有促进作用,对改善机体肠道健康、抗应激能力等也有一定成效,可开发为不同类型的添加剂使用,而对于大黄的毒性研究和生物活性物质的利用仍需要进一步探索。