石榴离体再生体系建立及遗传转化技术研究进展

刘春 储思媛 李锦锦

摘要 石榴果实营养丰富，树形优美，花色鲜艳，果形奇特，是一种兼具食用观赏价值的经济树种，在国内深受大众喜爱。我国石榴种质资源丰富，栽培历史悠久。然而近年来由于栽培技术落后，生产管理粗放，导致品种退化、树势减退。随着生活水平提高和经济的发展，人们对石榴的品质要求日益提高，因而培育优质果苗，筛选优良品种成为石榴生产的必然趋势。采用离体培养技术及构建遗传转化体系，对培育脱毒苗和选育优良品种提供了技术手段。通过对国内外研究成果进行收集分析，对石榴离体培养及遗传转化技术、现状、问题分析及未来研究发展趋势等进行阐述，以期为开展石榴的科学研究和生产实践提供理论基础和科学依据。

关键词 石榴；离体培养；再生体系；遗传转化

中图分类号 S665.4   文献标识码 A

文章编号 1007-7731（2023）04-0017-05

Research Progress on Establishment of in Vitro Regeneration System and Genetic

Transformation Technology of Pomegranate

LIU Chun   CHU Siyuan   LI Jinjin

（College of Life Sciences， Huaibei Normal University， Huaibei Anhui 235000）

Abstract Pomegranate has rich nutrition， beautiful tree shape， bright colors and peculiar fruit shape.It is an economic tree species with edible and ornamental value. It is deeply loved by the public in China.China is rich in pomegranate germplasm resources and has a long history of cultivation.However， in recent years， due to backward cultivation techniques and extensive production management， varieties have degenerated and tree vigor has decreased.With the improvement of living standards and economic development， people's requirements for the quality of pomegranate are increasing.Cultivating high quality seedlings and screening excellent varieties have become the inevitable trend of pomegranate production. In vitro culture technology and genetic transformation system were used to provide technical means for cultivating virus-free seedlings and breeding excellent varieties. By collecting and analyzing the research results at home and abroad， this paper expounds the in vitro culture and genetic transformation technology， current situation， problem analysis and future research development trend of pomegranate， in order to provide theoretical basis and basis for scientific research and production practice of pomegranate.

Keywords pomegranate; in vitro culture; regeneration system; genetic transformation

石榴（Punica granatum L.）属石榴科石榴属植物，是一种深受人们喜爱的水果，综合应用价值极高[1]。其花期一般在5—6月，果期大多为9—10月。适应于温暖的环境，对土壤要求不严，总体生存能力較强，在温带与热带地区均有种植。我国栽培历史可上溯至汉代，据陆巩记载是张骞从西域引入。在中国以江苏、河南等地种植面积较大，有一些广为人知的优良品种，如“红石榴”“河阴石榴”“黄里石榴”等。其中，“黄里石榴”是安徽省淮北市的特产，色泽光鲜，味道鲜美可口，深受人们欢迎。

石榴是一种浆果，果实晶莹剔透，颗粒饱满，宛如红宝石，味道酸甜可口，含有丰富的糖类、维生素C等，可以为人们补充身体所需能量。石榴中还富含多酚类与黄酮类物质，具有一定的抗衰老和抗氧化功效。石榴全身是宝，花、叶、果、果皮、果核均可入药。相关研究表明，石榴对提高老年人的免疫力，维持身体健康具有一定的作用。同时，石榴花、果、叶优美，具有较高的观赏价值。

过去由于国内长期关注苹果、梨等大宗水果的发展，而对石榴的研究起步较晚，所以总体水平相对落后，影响了石榴优良品种的合理开发和资源的优化配置。此外，在石榴栽培过程中由于栽培技术落后，管理粗放，树体易感染病害，主要包括白腐病、黑痘病、炭疽病，从而导致树势减退，品种退化。随着我国经济的发展和人们生活水平的提高，对石榴的品质需求日益增加，培育壮苗和筛选优良品种已成为石榴生产的必然趋势。采用离体培养技术及构建遗传转化体系，对培育脱毒苗和选育优良品种具有重要的意义。笔者通过查阅相关文献资料，对近年来有关石榴离体培养及遗传转化的研究了进行总结分析，并对其发展前景做出了展望，以期为石榴育种研究提供一定的理论基础和科学依据。

1 石榴的离体培养研究

1.1 外植体选择

在石榴组培生产过程中，外植体的选择非常广泛，目前国内外以茎尖、茎段、叶柄、成熟叶片、嫩叶等为外植体进行组织离体培养，先后获得了成功。闫志佩[2]以新梢茎尖为外植体快速繁殖获得无毒试管苗，成功挽救了软籽石榴濒危品种；程江华[3]通过对茎尖、茎段、成熟叶片、真叶、上胚轴、种子7种外植体的试验得出叶片是最佳的外植体；陈海燕[4]以靠近基部的萌生枝条、根蘖等作为外植体培养建立了泰山红石榴快速繁殖体系。外植体的选择对试验结果有着关键作用，必须按照一定的依据选择合适的外植体进行试验。

1.2 外植体存活

影响外植体存活的因素有很多，如光照、温度、湿度、试验操作技术、培养基等培养条件。研究表明，光照在石榴的组织培养中起着至关重要的作用，不同光照条件下，外植体的生理状态表现出显著差异，直接影响后续的生长分化；温度决定了外植体的呼吸速率，温度过高或者过低都会使其组织代谢紊乱，试验中须根据实际情况合理调控温度；湿度的影响主要在于培养容器和培养室的湿度条件，湿度过大会引起外植体发生褐变，湿度过低会导致外植体生理性脱水，根据生长环境适度的调整适度对外植体的培养至关重要。

此外，试验员的操作技术也影响着外植体的生长，如切取外植体的过程中，应尽可能地减少伤口面积，从而有效防止褐变的产生[5]；对外植体的消毒是否彻底，也决定了培养的效果。研究表明，试验前应先将外植体用流水冲洗30 min，再使用70%～75%乙醇浸泡1～2 min，最后用0.1%氯化汞或0.5%NaClO等进行处理，达到消毒作用[6]。材料不同，消毒的方法有所变化。

1.3 愈伤组织的诱导分化

在石榴的离体培养中，愈伤组织的形成与分化尤为重要。其中最关键的影响因素是植物生长调节剂，不同种类、浓度与配比的生长调节剂对愈伤组织的诱导与分化作用差异性较大。目前，诱导愈伤组织常用的植物生长调节剂是生长素和细胞分裂素。生长素一般使用NAA、IBA、IAA等，而细胞分裂素一般有KT、ZT、6-BA等，其中以6-BA的应用最为广泛，常用浓度为1.0～3.0 mg/L[7]。

筛选合适的培养基在一定程度上影响了愈伤组织的分化，程江华[3]通过试验得出结论，石榴愈伤组织诱导的最佳激素组合是：MS（基本培养基）+1.0 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA。除此之外，蔗糖浓度、pH、灭菌措施、温度、光照等因素也在不同程度上影响着愈伤组织的诱导与分化。如果培养基中没有蔗糖，一般情况下就不能诱导产生愈伤组织，通常蔗糖浓度在30～40 g/L，其生长状况良好，浓度过大或过小都会产生不良后果；pH大小会导致细胞渗透压发生变化，从而影响愈伤组织的生长。较多相关文献表明，乙醇与升汞的有机组合是非常有效的灭菌方法，合理的灭菌组合将有利于石榴愈伤组织的诱导与分化；培养温度一般设置在25 ℃左右有利于愈伤组织的形成[8]。

1.4 组培苗诱导生根

在石榴的生根诱导阶段，培养基的选择至关重要，相关文献报道，试验中采用较多的为MS基本培养基，细胞分裂素和生长素的浓度要根据不同的情况适当控制。培养基中的激素浓度变化对生根率产生了一定的影响。生长素对外植体的生长可以起到促进作用，其浓度一般比细胞分裂素浓度低。陶秀冬等[9]在石榴试管苗的生根诱导试验中发现，当IBA的浓度较低时，生根率也较低，所以应该适当增加培养基中IBA的浓度，以提高石榴的生根率。张爱民[10]试验发现，试管苗的生根率和培养基中的NAA浓度相关，若培养基中无NAA或NAA浓度过低，生根数也会相对较少。同时，大量研究表明，如果能在培养基中加入一些低浓度的蔗糖，将有利于生根，其浓度范围一般在1.0%～3.0%。整个生根诱导过程也受到诸多因素的影响，如温度、光照等。一般情况下，石榴组培苗的诱导生根会采用黑暗交替培养的方式，黑暗下培养可以刺激生根，也有利于植株内源生长素合成，培养温度大多控制在25 ℃左右。

1.5 组培苗移栽

组培苗在移栽过程中，其成活率的高低受到不同因素的影响，如组培苗的质量、移栽的基质、移栽技术管理等。苗质量越好，成活率越高；移栽基质不同，成活率也有差异，移栽前可先进行试验。大量研究表明，基质的透气性将影响栽培苗的移栽成活率。除此之外，試管苗的移栽成活率与水分、温度、光照等外界环境关系密切，移栽最适温度大多在25 ℃左右，若光照过强会灼烧幼苗，应适当进行遮阴处理[11]。栽培基质需事先消毒，一般可喷施5%高锰酸钾溶液，尽可能防止病虫害发生。移栽之前可先进行炼苗，让植株逐渐适应外部环境，期间给予适当的营养液，待幼苗强壮后再进行移栽，可大幅度提高存活率[12]。因此，试管苗移栽过程应综合考虑各方面因素，以保证苗木的成活率。

2 石榴的遗传转化研究

2.1 石榴遗传转化的方法

遗传转化技术在石榴育种方面应用广泛，试验中常用的遗传转化方法主要有农杆菌介导与DNA直接导入2种，后者又能细分为物理诱导法（基因枪法、注射法、花粉管通道法等）与化学诱导法（如PEG）[13]。

现阶段，农杆菌介导法在石榴的遗传转化方面应用最广，技术成熟，受到研究者的青睐。应用最多的是根癌农杆菌，其作用原理是将农杆菌中的Ri质粒或Ti质粒当作基因转化载体，继而将外源基因导进植物体基因组，完成转化过程。影响根癌农杆菌介导的遗传转化效率的因素众多，如菌株的类型、菌液的浓度、外植体的生理状态等。通常情况下，农杆菌菌株侵染力表现为：农杆碱型菌株>胭脂碱型菌株>章鱼碱型菌株；农杆菌菌液的浓度视具体情况而定；在石榴的遗传转化中，培养的时间一般为3～4 d，温度在20～25 ℃；处于发育幼年期的组织细胞转化能力更强，采用该方法的转化频率很高，同时转化质量也最好。

基因枪法是一种物理诱导法，利用超速运动的金属微粒直接将核酸分子引入受体细胞，然后通过离体培养来获取完整植株。通过这种方法获取的植株变异率较低，操作方法较为简便，但也存在一定的缺陷，如费用昂贵，转化效率通常较低等。

注射法就是利用注射器，在细胞中注射试验需要的遗传物质，再通过组织离体培养获得植株，这有利于克服远缘杂交困难，同时能够保证注射的准确性，但是转化效率低下。该方法在基因枪法出现后已较少应用。

花粉管通道法的工作原理是将外源DNA注入到子房中，然后进一步进行转化。该方法不需要进行细胞或组织培养，但是操作手续极为严格，在试验中应用不多[14-15]。

此外，物理诱导还可通过电击、激光等方式来实现，它们之间工作原理相似，都是利用细胞膜将DNA等遗传物质导入细胞中完成转化。这2种方法对于单子叶植物与双子叶植物均能适用，但也存在较多的问题，现阶段应用很少。

聚乙二醇（PEG）是一种化学物质，它的作用主要是使细胞膜通透性发生变化，继而达到转化目的。这种方法費用较低，结果精准，不需要复杂精密的仪器，主要缺点是转化植株的变异率高，转化率相对较低。

2.2 石榴遗传转化的受体材料

试验中不同类型的受体转化率效果差别较大，试验过程应根据具体情况，对不同的受体材料进行合理选择与优化。若外植体的生理状态活跃，那么转化效率会更高。一般而言，子叶、愈伤组织、上下胚轴、叶片等都是试验中常用到的受体材料。郭晓丽[16]曾以突尼斯软籽石榴的叶片愈伤组织作为受体材料进行遗传转化试验，成功获得了抗性愈伤组织并且分化出抗性芽。李跃霞[17]曾对石榴遗传转化的侵染材料进行筛选，试验结果显示，在试验条件完全相同的情况下，叶片褐化较严重，而愈伤组织的褐化率较低，生长状态也良好。石榴遗传转化受体材料选择通常需满足一些条件，如稳定的再生体系与来源，并且需要对农杆菌侵染有一定的敏感性。

2.3 遗传转化植株的鉴定方法

当前，试验中遗传转化的植株鉴定最常用的方法有3种：免疫技术鉴定、标记基因的筛选鉴定与分子水平上的鉴定。

免疫技术有很多种类型，常见的有免疫荧光法和酶联免疫法。前者必须以抗体为基础进行检测，利用显微镜观察检测抗体发出的荧光；后者是利用加上酶的抗体去检测抗原，这种方法目前也被广泛使用。

标记基因主要可以分成选择标记基因和报告基因2种。选择标记基因是一种已知功能或序列的基因，并与受体细胞的遗传背景存在很大区别，因此非常有利于筛选鉴定。石榴遗传转化经常使用的选择标记基因是NPTⅡ，标记基因具有遗传片段小、易于检测的优点。报告基因通常情况下是酶的基因，可以在试验中加入相应的底物，观察酶是否还具有活性，继而判断基因是否完成转化。现阶段经常利用的报告基因有抗生素转化酶类、有光学性质的酶类、荧光素酶类等，它们具有无毒、表达水平稳定、快速灵活、可重复等优点，在石榴的遗传转化试验中经常用到。

分子水平上的鉴定主要包括分子标记与分子杂交2种。分子标记又名DNA标记，这种检测手段简单快速，成本不高。分子杂交可以与分子标记同步配合进行检测，它可用于检测转基因植株是否在相应水平上表达，如PCR-Southern 杂交、PCR-Western杂交、PCR-Northern杂交等，每一种杂交方式的原理和鉴定水平都各有不同。此前，Terakami[18]等曾以矮化石榴nana为受体材料，进行遗传转化的研究，他们运用PCR-Southern 的杂交方法，并检测到目的基因整合到石榴的基因组中。

2.4 石榴遗传转化的基因类型

相关研究表明，在较早时期石榴遗传转化中，基因类型主要是目的基因如NPTⅡ、Kan以及报告基因GUS。近几年来，生物科学及遗传转化相关技术在不断发展，有一些新的基因也相继出现，转基因类型更加多样化，如抗寒相关基因、抗病相关基因、改变生长习性的相关基因等[19]。

3 存在问题

影响石榴的离体培养因素较多，如外植体的选择、石榴愈伤组织诱导分化率、各类激素与培养基的选择、人为的操作技术、室外移栽的环境及设施等都是影响石榴离体的关键因素，且亟待解决。目前，石榴的遗传转化技术虽然在技术与应用上已有了一定的突破，但大规模应用在生产实践中仍有差距，需要继续进行探索和研究，建立一个较完善、稳定的遗传转化体系。

4 展望

现阶段，石榴是深受大众喜爱的一种水果，在市场上供不应求，但传统的扦插、压条等繁殖方式技术相对落后，在一定程度上限制了石榴的示范推广。通过离体培养技术，可以在较短时间内获取大量的优质种苗，且繁殖速度快、效率高，可以为石榴育种提供技术支撑，解决石榴发展的瓶颈问题[20]。

石榴的遗传转化技术对改良品种性状具有重要作用，对理论研究和生产实践有一定的价值，具有广阔的应用前景。利用遗传转化技术，可以有目的性、有针对性地创造具有优良性状的品种，丰富石榴种植质资源。现阶段，园艺工作者不仅要挖掘利用好已掌握的遗传转化技术，也要加快对石榴各品种资源的收集，建立种质资源库，开展基因工程育种工作，为后期的良种选育奠定基础。相信未来随着各项园艺栽培技术的发展以及园艺设施的完善，会进一步加大石榴品种改良的进度。

5 参考文献

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[20] 李佳娣，张爱民，薛建平，等.石榴组织培养研究进展[J].生物学杂志，2011，28（5）：4.

（责编：张宏民）