壳聚糖对苜蓿抗寒性及抗寒保护物质含量的影响

滕泽， 张玉霞，2*， 陈卫东， 丛百明， 田永雷，张庆昕， 张永亮， 王东儒

（1.内蒙古民族大学农学院，内蒙古 通辽 028041； 2.内蒙古民族大学生态环境与绿色发展研究所，内蒙古通辽 028000； 3.内蒙古自治区通辽市畜牧兽医科学研究所，内蒙古 通辽 028000； 4.内蒙古自治区农牧业科学院，呼和浩特 010010； 5.内蒙古自治区农牧技术推广中心，呼和浩特 010010）

紫花苜蓿（Medicago sativaL．）是苜蓿属多年生草本植物，是世界上种植最广泛的豆科牧草，有“牧草之王”的美称[1-2]，具有高产、营养价值高、抗逆性强等特点。但在北方干旱地区种植存在越冬安全性不稳的现象，尤其在科尔沁沙地由于冬季寒冷少雪，对紫花苜蓿越冬产生不良影响，严重时甚至可以引起紫花苜蓿死亡，对苜蓿持续稳定生产及经济效益造成严重影响,提高紫花苜蓿的抗寒能力是解决紫花苜蓿安全越冬的重要途径[3-4]。

壳聚糖是甲壳素的脱乙酰基产物，又称乙酰几丁质[5]，可以作为植物生长调节剂，在农业领域具有重要的应用价值[6]。有研究发现，将壳聚糖作为外源性物质喷施于水稻[7]、棉花[8]、辣椒[9]、荔枝[10]等的叶片，能显著提高其抗寒能力，但壳聚糖对提高紫花苜蓿抗寒性的研究未有报道。为此，本研究通过大田试验对紫花苜蓿进行不同浓度壳聚糖处理，于越冬前期挖取紫花苜蓿越冬材料模拟低温胁迫处理，检测低温处理下紫花苜蓿根颈的可溶性蛋白、蔗糖、果糖及脯氨酸含量变化，分析不同浓度壳聚糖处理对紫花苜蓿抗寒性的影响，探究在科尔沁沙地紫花苜蓿安全越冬的壳聚糖施用量，以期为科尔沁沙地紫花苜蓿抗寒越冬提供理论依据和技术指导。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验地位于内蒙古民族大学科技示范园区（43°36′N，122°22′E），海拔177 m。该地区属于温带半干旱大陆性气候，土壤为风沙土，土壤含有机 质4.86 g·kg-1，速 效 钾94.65 mg·kg-1，速 效 磷10.46 mg·kg-1，碱解氮11.15 mg·kg-1，pH为8。

1.2 试验方法

采用单因素随机区组试验设计，2018 年7 月3 日播种‘公农1 号'紫花苜蓿，播种量 为22.5 kg·hm-2，行距为20 cm，小区面积为4 m×4 m=16 m2。2018年8月5日分枝期进行喷施壳聚糖处理，共5 个处理，喷施量分别为0、50、100、150、200 μg·g-1，其中以不喷施（0 μg·g-1）为对照。每个处理设3 次重复，共15 个小区。试验田进行指针式喷灌，病虫防治等同正常田间管理。11 月13 日挖取长势一致的紫花苜蓿越冬材料，进行模拟低温处理。

每个小区挖取50 株长势均匀的紫花苜蓿，将植株地上部分剪去冲洗干净，每个小区的材料平均分成2 份，并排列整齐地摆放在厚度为3 mm。长×宽为30 cm×20 cm 的纯棉布上,包裹好后均匀喷洒30 mL 蒸馏水,使棉布保持潮湿状态,然后用长×宽为30 cm×30 cm的锡箔纸包好。其中1份放入4 ℃恒温冰箱进行低温冷藏处理，另1份放入可控式恒温恒湿试验箱进行-20 ℃低温冷冻处理。可控式恒温恒湿试验箱设置为：以4 ℃为起点，先以4 ℃·h-1的速率降温，在-20 ℃下保持6 h，后以4 ℃·h-1的速度升温至4 ℃，取出后在4 ℃下放置12 h，与冷藏处理材料同时测定根颈的相关性质。

1.3 测定指标及方法

相对电导率采用DDS 电导率仪法测定，采用酸性茚三酮法测定脯氨酸含量，采用考马斯亮蓝法测定可溶性蛋白含量，蔗糖和果糖采用间苯二酚法测定[11]。

1.4 统计分析方法

用DPS 7.0 软件进行二因素方差分析，采用Duncan检验方法进行新复极差多重比较。

2 结果与分析

2.1 喷施壳聚糖对苜蓿根颈相对电导率的影响

喷施壳聚糖对紫花苜蓿根颈相对电导率的影响如表1 所示，随着壳聚糖喷施量的增加，在低温冷藏处理下，紫花苜蓿根颈相对电导率呈下降的趋势。经过低温冷冻处理，不同含量壳聚糖喷施处理下，紫花苜蓿根颈相对电导率均较低温冷藏处理显著增加（P＜0.05）；壳聚糖喷施量为100 μg·g-1时，紫花苜蓿根颈相对电导率最低，为31.49%，且显著低于其他处理。由此说明，喷施壳聚糖能够减缓苜蓿在低温胁迫下生物膜的伤害，且以100 μg·g-1处理下效果最好。

表1 不同喷施量下苜蓿根颈相对电导率Table 1 Relative conductivity of alfalfa root neck under different spraying amount

2.2 喷施壳聚糖对苜蓿根颈可溶性蛋白含量的影响

由表2 可知，低温冷藏处理下壳聚糖喷施量为100 μg·g-1时，苜蓿根颈的可溶性蛋白含量显著高于其他处理（P＜0.05）；低温冷冻处理，壳聚糖施用量为150 μg·g-1时，紫花苜蓿根颈中可溶性蛋白含量达到最高，为27.19 mg·g-1，与壳聚糖喷施量100 μg·g-1处理差异不显著，但均显著高于其他处理（P＜0.05）。由此说明，喷施壳聚糖可提高苜蓿根颈的可溶性蛋白含量，且促进在低温冷冻胁迫下可溶性蛋白的转化，在喷施量150 μg·g-1处理下效果最明显。

表2 不同喷施量下苜蓿根颈可溶性蛋白含量Table 2 Content of soluble protein in alfalfa root neck under different spraying amount

2.3 喷施壳聚糖对苜蓿根颈脯氨酸含量的影响

如表3 所示，在低温冷藏处理下，随着壳聚糖喷施量的增加苜蓿根颈脯氨酸含量呈先上升后降低的趋势，其中壳聚糖喷施量为100、150、200 μg·g-1时苜蓿根颈中脯氨酸含量均显著高于对照（P＜0. 05），且喷施量为100 μg·g-1时脯氨酸含量达到最大。在低温冷冻处理下，苜蓿根颈脯氨酸含量也是随着壳聚糖喷施量的增加呈先增加后降低的趋势，且壳聚糖喷施量为100 μg·g-1时紫花苜蓿根颈中脯氨酸含量达到最大，为8.05 mg·g-1，与喷施150 μg·g-1处理间差异不显著，但显著高于其他处理（P＜0. 05）。说明在低温胁迫下，喷施壳聚糖有助于脯氨酸合成，提高渗透调节能力，在100 μg·g-1下效果最明显。

表3 不同喷施量下苜蓿根颈脯氨酸含量Table 3 Proline content of alfalfa root neck under different spraying amount

2.4 喷施壳聚糖对苜蓿根颈蔗糖含量的影响

如表4 所示，在低温冷藏处理下，喷施不同量壳聚糖，苜蓿根颈的蔗糖含量显著高于对照（P＜0.05），且随着喷施量的增加呈先增加后降低的变化趋势，在喷施100 μg·g-1时，苜蓿根颈的蔗糖含量最高，与150 μg·g-1处理差异不显著，但显著高于其他处理（P＜0.05）。除200 μg·g-1处理外，冷冻处理的蔗糖含量显著高于冷藏处理，也是随着处理量的增加呈先增加后降低的变化趋势，100 μg·g-1处 理 的苜 蓿 根 颈 蔗 糖 含 量 最高，为88.17 μg·g-1，显著高于其他处理（P＜0.05）。由此说明，喷施壳聚糖促进苜蓿根颈在低温处理下蔗糖的 合成 与转化，在100 μg·g-1处理 下效 果最明显。

表4 不同喷施量下苜蓿根颈蔗糖含量Table 4 Sucrose content of alfalfa root neck under different spraying amount

2.5 喷施壳聚糖对苜蓿根颈果糖含量的影响

如表5 所示，低温冷藏处理，紫花苜蓿根颈果糖含量在壳聚糖喷施量为150 μg·g-1时最高，达69.86 μg·g-1。在低温冷冻处理下，紫花苜蓿根颈的果糖含量显著高于低温冷藏处理（P＜0.05），随着喷施量的增加呈先增加后降低的变化趋势，壳聚糖喷施量为100 μg·g-1时苜蓿根颈的果糖含量最高，为86.32 μg·g-1，且显著高于除壳聚糖喷施量为50 μg·g-1外的其他处理（P＜0.05）。由此说明，喷施壳聚糖促进苜蓿根颈果糖的合成及低温胁迫下的转化，在100～150 μg·g-1处理下转化最明显。

表5 不同喷施量下苜蓿根颈果糖含量Table 5 Fructose content in alfalfa root neck under different spraying amount

2.6 紫花苜蓿根颈相对电导率含量与抗寒保护物质含量的相关性

如表6 所示，不同温度处理下紫花苜蓿根颈中可溶性蛋白含量、脯氨酸含量、蔗糖含量、果糖含量与相对电导率均呈负相关。低温冷藏处理下，紫花苜蓿根颈中脯氨酸含量与蔗糖含量呈极显著正相关（P＜0.01）。低温冷冻处理下，紫花苜蓿根颈中脯氨酸含量与可溶性蛋白含量和蔗糖含量均呈显著正相关（P＜0.05），果糖含量与蔗糖含量呈极显著正相关（P＜0.01）。由此说明，可溶性蛋白、脯氨酸、蔗糖、果糖是抗寒保护物质。

表6 紫花苜蓿根颈相对电导率含量与抗寒保护物质含量的相关性Table 6 Correlation between the content of relative electrical conductivity in root neck of alfalfa and content of cold-resistant protective substances

3 讨论

当植物遭受低温胁迫时，细胞的质膜透性会发生较大的改变，电解质会有不同程度的外渗。抗寒性越强或受寒害轻的细胞，外渗程度较轻，渗透性可逆，易于恢复正常，因此相对电导率可作为抗寒性的生理指标[12]。本研究表明，喷施一定量的壳聚糖能降低紫花苜蓿根颈的相对电导率，提高苜蓿的抗寒能力，与辛慧慧等[13]研究结果一致，当壳聚糖喷施量为100 μg·g-1时，相对电导率最低，紫花苜蓿根颈受害程度较轻。

研究发现，在低温胁迫下植物能合成一些小分子有机物质，以增强其抗寒性，可溶性蛋白含量与植物的抗寒性呈正相关[14]。脯氨酸作为渗透调节物质，可以提高渗透压，增强保水力，提高植物抗寒性，它还可以通过提高植物体内的抗氧化酶活性来有效地清除活性氧，同时脯氨酸有维持生物大分子的结构和功能从而保护细胞免受低温伤害的作用[15-16]。壳聚糖可以提高可溶性蛋白和脯氨酸等抗寒性物质的含量,从而有效地抵御低温对作物的伤害[17]。邓拓等[18]研究发现，壳聚糖能够显著提升低温胁迫后脯氨酸的含量，说明壳聚糖能增强核桃对低温胁迫的抗寒能力。朱云林等[19]发现在水稻2叶期喷施壳聚糖溶液后遭受低温胁迫,与对照相比壳聚糖处理能提高水稻幼苗体内的脯氨酸等抗寒保护物质含量,可以减轻低温对水稻秧苗的危害。本研究表明，壳聚糖喷施量为100～150 μg·g-1时，低温胁迫下紫花苜蓿根颈中可溶性蛋白和脯氨酸的含量最高。

研究表明，碳水化合物中蔗糖和果糖含量与苜蓿抗寒性有一定的相关性，在苜蓿抗寒性方面起着重要作用[20-21]。这些糖类不仅可以调节细胞渗透势，果糖还可以作为单糖发生磷酸化，从而引起糖信号传递使细胞对低温做出反应[22]。本试验结果表明，低温冷冻处理下随着壳聚糖喷施浓度的增加，蔗糖、果糖含量均呈现先升高后降低的趋势，其中在壳聚糖喷施量为100 μg·g-1时达到最大值，说明蔗糖和果糖是抗寒保护物质。