瓜实蝇成虫对不同杀虫剂相对敏感基线的建立

陈 黔，杨 朗，黄立飞，曹雪梅，张建民，姜建军

（1.长江大学农学院 湖北荆州 434025；2.农业农村部华南果蔬绿色防控重点实验室 南宁 530007；3.广西作物病虫害生物学重点实验室·广西壮族自治区农业科学院植物保护研究所 南宁 530007）

瓜实蝇Zeugodacus cucurbitae（Coquillett）隶属双翅目实蝇科镞果实蝇属昆虫，原产于印度，分布于亚洲、大洋洲、非洲和美洲的热带和亚热带地区，是一种果蔬上主要的入侵性害虫[1-2]，在我国主要分布于广西、广东、海南、四川、福建、台湾和香港等省份和地区。瓜实蝇为多食性，危害的寄主主要包括黄瓜、南瓜、甜瓜、西葫芦、丝瓜、西瓜、苦瓜等20 余科120 多种果蔬[3-5]，雌成虫产卵于瓜果表皮组织内，偶产卵于花蔓，孵化后的幼虫钻蛀至果实内部取食，造成受害果实腐烂、畸形和落果，影响作物产量和品质，危害严重时果实受害率在30%～100%，给生产造成严重损失[6-8]。目前生产上已有多种防控该虫的方法，如生物防治、信息素引诱、黄板诱杀、果实套袋、种植抗虫品种、化学防治和雄性不育治理技术等[9-11]，但采用化学杀虫剂仍是防治瓜实蝇最普遍和常用的手段。

化学杀虫剂的频繁使用，易使害虫产生抗药性，导致常规剂量药效下降，从而增加农药用量，缩短农药使用寿命，间接给经济、环境和人类食品安全带来风险[12]。热带和亚热带地区（如我国海南、广西等地）适宜的气候可周年种植瓜类蔬菜，瓜实蝇在这些拥有充足寄主植物和适宜气候条件的地区无越冬现象并终年可见[13-15]，而这意味着需全年对瓜实蝇进行防治。前人研究表明，田间瓜实蝇已对微生物源农药（阿维菌素、多杀菌素）和有机磷类杀虫剂农药（倍硫磷、敌百虫）等产生了不同程度的抗药性[16-18]。监测了解害虫田间种群对不同杀虫剂的抗药效性发展水平，从而指导合理用药是延缓和治理其抗药性的有效方法之一[19]。张帅等[20]于2013－2015 年连续对华北地区棉花主要害虫进行抗药性监测，在明确主要害虫棉铃虫、绿盲蝽和棉蚜对杀虫剂抗药性水平的基础上，实施以轮换用药为主的抗性治理示范，每667 m2减少3 次用药后增加棉花产量7.53%，节本增收109.16 元。张小磊等[21]于2009－2014 年研究表明，湖北稻区褐飞虱田间种群对噻虫嗪、噻嗪酮抗性上升明显，对吡虫啉抗性也有上升的趋势，因此建议田间暂停吡虫啉、噻嗪酮在水稻上防治褐飞虱，严格限制吡蚜酮在水稻上的使用次数，醚菊酯可作为吡虫啉、噻嗪酮和吡蚜酮的替代药剂或轮换药剂。为了掌握主要农作物病虫害抗药性状况，从而针对具体抗性情况提出治理对策，我国农技推广服务中心从2008 至今连续多年牵头监测与发布水稻、棉花、玉米和蔬菜等重要农业有害生物抗药性监测报告与治理对策[22-24]。害虫抗药性主要是随着杀虫剂的连续使用而逐渐产生。因此，害虫对某种药剂有无抗药性，只是相对的比较[25]，所以在对害虫进行抗药性监测前，必须建立可靠的敏感毒力基线，只有具备了敏感基线，才能确定区分剂量和准确地判断田间害虫种群是否已经产生抗药性及抗药性的程度和范围[26]。敏感基线（sensitivity baseline）是通过生物测定方法得到的害虫敏感品系（或种群）对杀虫剂的剂量反应曲线[27]，其测定方法是用一系列药剂剂量或浓度处理供试生物，以剂量对数值和相应死亡率概率值绘图，求其直线回归方程、斜率（b值）及LD50等毒力分析数据。研究和评估害虫抗药性的发展水平，采用的测定方式不同则表示方法不同，如一般点滴法采用半数致死量（LD50）来表示比较，药膜法、饲毒法和浸叶法等采用致死中浓度（LC50）来表示，还有半数击倒量（KD50）和半数击倒时间（KT50）等表示方法，但所有的表示方式其抗性水平求法基本相同[28]。

由于瓜实蝇幼虫在瓜果内蛀食为害，药剂难于接触，所以田间药剂主要针对其成虫进行防治，目前国内外有关瓜实蝇成虫对杀虫剂敏感基线的研究已有部分报道。Hsu 等[17]以室内饲养超过300 代的试虫为敏感品系，分别采用点滴法和饲毒法建立了瓜实蝇成虫对多杀霉素的敏感基线。谷世伟等[18]以室内饲养24 代的试虫为敏感品系，采用药膜法建立了瓜实蝇对敌百虫、氯氟氰菊酯、高效氯氰菊酯、甲维盐、阿维菌素、多杀霉素的敏感基线。随着田间用药种类的增加，为了补充更多数据以用于田间瓜实蝇抗药性监测，笔者的研究以室内标准化连续饲养63 代的瓜实蝇为相对敏感品系，采用点滴法和饲毒法测定了田间常见的17 类30 种杀虫剂对瓜实蝇成虫的毒力及建立相对敏感基线，并比较分析了2 种方法对阿维菌素抗性品系的抗性水平测定结果的差异，以期为瓜实蝇的田间抗药性监测和抗药性综合治理提供参考。

1 材料和方法

1.1 材料

供试昆虫：瓜实蝇敏感品系（susceptible strain，SS）是2012 年采自广西南宁郊区苦瓜上，在室内标准化连续饲养至2022 年已63 代的种群。饲养条件为温度（26±1）℃，湿度（75±5）%，光周期L/D=14 h/10 h。用削皮后的南瓜（市售）接卵和饲养幼虫，成虫采用酵母与蔗糖混合物饲养（w酵母∶w糖=1∶3）。瓜实蝇抗阿维菌素品系（resistant strain，RS），以上述采自野外的种群室内经饲毒法选育至33 代后获得。

供试药剂：笔者研究所用药剂及来源见表1，其他试剂为丙酮分析纯（成都市科隆化学品有限公司），吐温-80[生工生物工程（上海）股份有限公司]。

表1 试验所用药剂

1.2 生物测定

1.2.1 点滴法毒力测定 参考农业部发布的方法[29]和Hsu 等[17]所述方法进行。具体步骤如下：首先用丙酮把原药溶解配制成母液，然后在预试验的基础上将母液用丙酮等比稀释成5～6 个系列工作浓度。取羽化4～5 d 的瓜实蝇成虫（雌虫∶雄虫=1∶1），CO2气体迷晕后，用镊子夹住其翅膀，采用微量点滴仪（Burkard，英格兰）把1 μL 药剂点滴于前胸背板，点滴后的试虫放置于自制的养虫杯中，杯中放入水和饲料，饲养条件同1.1 中所述。每处理4个重复，每重复20 头虫，以点滴等量丙酮的瓜实蝇成虫为空白对照处理。

1.2.2 饲毒法毒力测定 参考Hsu[30]和Kakani 等[31]的方法略有改动。具体操作如下：用丙酮把原药溶解配制成母液，然后在预试验的基础上将母液用含0.5%吐温-80 和10%蜂蜜的水溶液等比稀释成5～7个系列工作浓度。在自制的养虫杯底部放置1 个15 mm×15 mm 规格的称量杯，称量杯中放置脱脂棉球。然后在棉球中加入2 mL 不同浓度的药液使其完全湿润。杯中放入羽化4～5 d 已饥饿24 h 的瓜实蝇成虫20 头（雌虫∶雄虫=1∶1），取食药剂处理24 h 后，取出药剂，换用正常的水和食物饲养，饲养条件同前述。每处理4 次重复，每个重复20 头虫。以不含药剂的上述稀释药剂用溶液作为空白对照处理。

上述2 种方法生物测定中，灭蝇胺、氟啶虫酰胺、苯氧威和氟啶脲96 h 后统计处理死亡虫数[32]，其他药剂处理后48 h 统计死亡虫数。处理后的试虫以不能移动或用毛笔反转后5 s 内不能翻身判断为死亡。2 种方法敏感基线测定所用试虫均为敏感品系63 代种群，在连续的时间内完成测定。

1.3 抗阿维菌素品系抗药性水平测定

采用点滴法和饲毒法分别测定阿维菌素对RS品系的毒力，比较分析2 种方法测定的抗性品系对阿维菌素的抗药性水平是否存在较大差异。测定方法同1.2，每处理均设4 个重复，每重复20 头虫。抗药性水平计算方法：抗药性品系致死中浓度（lethal concentration of 50%，LC50）/敏感品系致死中浓度（LC50）（饲毒法）或抗药性品系致死中量（lethal dose of 50%，LD50）/敏感品系致死中量（LD50）（点滴法）。

1.4 数据分析

根据剂量对数和死亡概率值直线回归法，采用SPSS 19 软件进行统计分析，为了消除虫体本身或环境因素引起的试虫死亡率太高，导致试验数据偏差，设置所有处理空白对照组死亡率小于10%为有效数据[32]，统计计算LD50或LC50值及其95%置信区间、毒力回归线斜率值及其标准误（SE）、卡方值（χ2）、自由度（df）及P值。

2 结果与分析

2.1 点滴法测定瓜实蝇对杀虫剂的相对敏感基线

由表2 可以看出，点滴法结果表明，瓜实蝇成虫对微生物源类的甲维盐、阿维菌素和多杀霉素最敏感，LD50值在3.422～5.117 ng·头-1；3 个菊酯类LD50值在39.902～56.698 ng·头-1；有机磷类乐果和辛硫磷农药LD50值为20.929、41.692 ng·头-1；吡唑类唑虫酰胺、1 个有机磷类农药马拉硫磷及吡咯类虫螨腈的LD50值在104.789～196.840 ng·头-1；4 个烟碱类农药LD50值较为接近，其值介于266.456～274.348 ng·头-1之间；双酰胺类溴氰虫酰胺、氨基甲酸酯类仲丁威和植物源农药鱼藤酮LD50值在341.080～576.842 ng·头-1。除了上述18 种农药，其他包括烟碱类的烯啶虫胺和吡虫啉、植物源农药D-柠檬烯和苦参碱、硫脲类的丁醚脲，季酮酸类螺虫乙酯，噁二嗪类茚虫威，三嗪类灭蝇胺，吡啶酰胺类氟啶虫酰胺，非萜烯类苯氧威，苯甲酰脲类氟啶脲和吡啶类吡蚜酮等12 种农药因瓜实蝇成虫极为不敏感，无法测出其毒力。同时根据毒力LD50测定结果，瓜实蝇对不同杀虫剂敏感性排序为甲维盐＞多杀霉素＞阿维菌素＞乐果＞高效氯氰菊酯＞溴氰菊酯＞辛硫磷＞高效氯氟氰菊酯＞唑虫酰胺＞马拉硫磷＞虫螨腈＞噻虫嗪＞噻虫胺＞啶虫脒＞呋虫胺＞溴氰虫酰胺＞仲丁威＞鱼藤酮。

表2 瓜实蝇对不同杀虫剂敏感基线（点滴法）

2.2 饲毒法测定瓜实蝇对杀虫剂的相对敏感基线

由表3 可以看出，饲毒法结果有21 种药剂测出了LC50值。在这21 种药剂中除鱼藤酮LC50=60.542 mg·L-1外，其他药剂LC50值均低于27.000 mg·L-1，其中甲维盐、阿维菌素和多杀霉素3个生物源农药LC50值在0.035～0.123 mg·L-1；3 个菊酯类药剂LC50值较为接近，在1.090～1.695 mg·L-1；有机磷类乐果LC50=0.302 mg·L-1、辛硫磷和马拉硫磷LC50分别为3.479 mg·L-1和4.710 mg·L-1。6 个烟碱类药剂中，烯啶虫胺LC50=26.507 mg·L-1、吡虫啉LC50=13.972 mg·L-1，其余4 种药剂LC50在1.399～6.350 mg·L-1；双酰胺类溴氰虫酰胺、吡咯类虫螨腈、吡唑类唑虫酰胺、氨基甲酸酯类仲丁威和噁二嗪类茚虫威的LC50值分别为1.396、6.403、11.552、18.535、18.810 mg·L-1。其他包括植物源农药D-柠檬烯和苦参碱，硫脲类的丁醚脲，季酮酸类螺虫乙酯，三嗪类灭蝇胺，吡啶酰胺类氟啶虫酰胺，非萜烯类苯氧威，苯甲酰脲类氟啶脲和吡啶类吡蚜酮等9 种农药因瓜实蝇成虫对其极为不敏感，无法测出其毒力。同时根据毒力LC50测定结果，瓜实蝇对不同杀虫剂的敏感性由高到低排序为甲维盐＞阿维菌素＞多杀霉素＞乐果＞溴氰菊酯＞高效氯氰菊酯＞溴氰虫酰胺＞噻虫胺＞高效氯氟氰菊酯＞噻虫嗪＞呋虫胺＞辛硫磷＞马拉硫磷＞啶虫脒＞虫螨腈＞唑虫酰胺＞吡虫啉＞仲丁威＞茚虫威＞烯啶虫胺＞鱼藤酮。

表3 瓜实蝇对不同杀虫剂敏感基线（饲毒法）

2.3 抗阿维菌素品系抗药性水平测定

采用点滴法和饲毒法测得的瓜实蝇抗阿维菌素品系抗性水平见表4，由表中结果可知点滴法测得的抗性水平为18.22 倍，饲毒法测得的抗性水平为17.37 倍，2 种方法测得的抗性水平结果相接近。

3 讨论与结论

化学杀虫剂防治田间害虫时，需考虑药剂作用于靶标对象的方式（触杀、胃毒等）、靶标害虫种群在田间对药剂的耐受性、不同类型杀虫剂对种群抗药性水平的影响等[27]。目前生产上化学防治果实蝇类害虫主要采用喷洒杀虫剂和悬挂或定点投放毒饵等[16，33-34]，根据瓜实蝇成虫生活习性特征，喷雾防治以触杀为主兼顾胃毒，毒饵诱杀以胃毒为主兼顾触杀。对害虫的药剂敏感性或抗性进行测定时，不同的生物测定方法会测得不同的毒力结果[19]。点滴法主要测定杀虫剂的触杀作用，定量精确。饲毒法主要测定杀虫剂胃毒作用兼顾触杀作用。因此2种方法虽均可测定出大部分药剂对害虫的毒力，在抗药性监测和机制研究中广泛应用，但也需要根据测定目的和药剂的作用方式来选择合适的方法[32]。

在笔者的研究中，点滴法试验结果表明，瓜实蝇成虫对吡虫啉、茚虫威、烯啶虫胺不敏感，无法测出其毒力。而采用饲毒法，上述3 种药剂表现出对瓜实蝇具有一定的毒力，说明这3 种药剂对瓜实蝇具有胃毒作用，无触杀活性。另外采用2 种方法测定的药剂毒力排序也发生了一定变化，如溴氰虫酰胺在点滴法中相对排序第16 位，LD50=341.080 ng·头-1，而饲毒法中排序为第7 位，LC50=1.396 mg·L-1。辛硫磷和唑虫酰胺点滴法中排序分别为第7 位和第9位，LD50值分别为41.692、104.789 ng·头-1，饲毒法中两种药剂排序分别为第12 位和第16 位，说明相对于其他药剂，溴氰虫酰胺对瓜实蝇胃毒作用要优于触杀，而辛硫磷和唑虫酰胺触杀作用优于其胃毒作用。因此，在生产上建议研发瓜实蝇药剂时如溴氰虫酰胺可优先以毒饵剂型为主，而辛硫磷和唑虫酰胺则可开发以触杀作用的剂型为主。同时，采用点滴法和饲毒法测定室内选育的阿维菌素抗药性品系，结果显示，2 种方法测得的抗性水平分别为18.22 倍、17.37 倍，较为接近，因此在应用中可以根据实际情况选择适合的方法进行抗药性监测，如点滴法要求需要精密的点滴仪，操作起来相对较繁琐，而饲毒法对操作仪器无要求，操作简便，可以优先选择。

室内生测建立害虫对不同杀虫剂的敏感性基线，结合田间抗药性水平监测，可以为害虫田间化学防治药剂选择提供参考。根据笔者研究的点滴法和饲毒法测定的瓜实蝇对不同杀虫剂的相对敏感基线结果，2 种方法中微生物源类农药甲维盐、阿维菌素和多杀霉素及有机磷类的乐果均表现出对瓜实蝇成虫较高的毒力，其次是菊酯类、有机磷类和烟碱类，因此建议生产中可轮换使用上述几类药剂，但是上述几种类型药剂间是否存在交互抗药性需要注意观察和进一步研究。烟碱类的吡虫啉和烯啶虫胺，采用点滴触杀时并未表现出毒力，虽然饲毒法对瓜实蝇有一定毒性，但相对其他4 个烟碱类杀虫剂其LC50值较高，因此建议田间选择烟碱类杀虫剂应避免选择这2 种药剂。植物源农药D-柠檬烯和苦参碱、硫脲类的丁醚脲、季酮酸类螺虫乙酯、三嗪类灭蝇胺、吡啶酰胺类氟啶虫酰胺、非萜烯类苯氧威、苯甲酰脲类氟啶脲和吡啶类吡蚜酮9 种杀虫剂采用2 种方法无法测出其对瓜实蝇成虫的毒力，同时噁二嗪类茚虫威采用点滴法也不能测出其致死中量，表明瓜实蝇成虫对上述10 种药剂较为不敏感，生产中也应避免用于防治瓜实蝇成虫。

毒力敏感基线的建立是抗药性水平监测的重要依据和基础工作，而敏感品系的获得是建立敏感基线的基础。笔者的研究所用敏感品系为在室内饲养近10 年至今已63 代的虫源，相比于田间种群其对各种农药的相对敏感性较高和稳定，如Hsu等[17]采用点滴法对室内饲养超过300 代的敏感品系瓜实蝇成虫测定其对多杀霉素的毒力敏感性，结果显示，LD50值为3.16 ng·头-1，笔者所用瓜实蝇敏感品系测得的LD50值为5.117 ng·头-1，推测造成差异的原因是笔者研究用种群在室内饲养代数为63 代可能还未达到完全敏感，但2 个种群对多杀霉素的LD50差异不是太大，显示笔者研究所用的瓜实蝇已经相对敏感，建立的相对敏感基线可以为瓜实蝇抗药性监测相关研究提供参考依据。下一步笔者计划以此研究建立的敏感基线为基础，对我国不同地区田间瓜实蝇种群抗药性进行调查和监测，以期为该虫综合防控提供数据支撑。

瓜实蝇作为果蔬上的一种主要害虫，长期以来的田间用药情况和抗药性水平数据缺乏，因此笔者采用点滴法和饲毒法分别建立了瓜实蝇成虫对18种和21 种杀虫剂的相对敏感基线，对今后长期系统监测其抗药性发展，指导合理用药，避免农药的滥用和抗性综合治理具有重要的参考价值。